检索结果-南通市图书馆

作者：伍丹华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探讨红景天苷抑制日光性皮炎的分子机制。方法:(1)通过免疫组织化学技术(IHC)分析临床日光性皮炎标本中与日光紫外线(SUV)相关MAPK通路因子p-JNKs,p-p38和炎症因子Ki67,CD45,COX-2的表达。(2)选取适宜的SUV照射剂量(不引起细胞凋... 详细信息

目的:探讨红景天苷抑制日光性皮炎的分子机制。方法:(1)通过免疫组织化学技术(IHC)分析临床日光性皮炎标本中与日光紫外线(SUV)相关MAPK通路因子p-JNKs,p-p38和炎症因子Ki67,CD45,COX-2的表达。(2)选取适宜的SUV照射剂量(不引起细胞凋亡),对JB6 Cl41(小鼠上皮细胞)和Ha Ca T(人角质形成细胞)进行处理,用western blot检测p-p38,p-JNKs和COX-2的表达。(3)在Ha Ca T细胞中采用基因沉默技术使COX-2表达下调,观察MAPK通路因子p-p38,p-JNKs的变化。(4)采用同源建模和分子对接方法预测COX-2的抑制剂,以及相互作用的位点。(5)采用体外药物蛋白结合技术(in vitro pull-down assay),检测红景天苷能否与COX-2结合。(6)MTS方法测定细胞存活率,观察红景天苷对细胞是否有毒性。(7)选取不同浓度的红景天苷和适宜浓度不同时间段预处理JB6 Cl41和Ha Ca T细胞,SUV照射后,收集细胞培养上清,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定红景天苷是否抑制COX-2活性,即下游PGE2的产生以及炎症因子IL-6和TNF-α水平;提取细胞总蛋白,采用western blot分析红景天苷对细胞MAPK通路因子及COX-2的作用。(8)建立小鼠日光性皮炎模型,在小鼠背部皮肤处涂抹红景天苷或者丙酮,然后进行SUV照射,取皮肤组织进行H-E染色观察皮肤炎症的病理变化,以及免疫组化技术来分析皮肤组织中COX-2,p-p38,p-JNKs的表达变化。结果:(1)COX-2,p-JNKs,p-p38,Ki67和CD45在日光性皮炎中表达上调。(2)SUV诱导Ha Ca T和JB6 Cl41细胞中COX-2,p-p38和p-JNK的表达增加。(3)在Ha Ca T细胞中沉默COX-2后,SUV诱导的p38或JNKs的磷酸化水平下降。(4)红景天苷在体外与COX-2直接结合且对Ha Ca T和JB6 Cl41细胞无毒性。(5)红景天苷抑制COX-2的活性,减轻SUV辐射引起的Ha Ca T和JB6Cl41细胞炎症反应。(6)红景天苷预处理过的小鼠皮肤经SUV照射后,皮肤组织表层明显增厚,炎症细胞减少,COX-2,p-p38和p-JNKs的表达均有减少。结论:红景天苷可靶向COX-2抑制日光性皮炎。红景天苷作为潜在的COX-2抑制剂,有助于改善皮肤光损伤和治疗光敏性皮肤疾病。为开发天然安全的中药防护剂和临床日光性皮肤炎症的治疗提供了科学依据。

关键词：红景天苷环氧合酶(COX-2) 日光紫外线日光性皮炎 p38

褪黑素对SD大鼠脑缺血再灌注诱发的自噬的影响

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褪黑素对SD大鼠脑缺血再灌注诱发的自噬的影响

作者：吴俊平华中科技大学

学位级别：硕士

目的：研究SD大鼠脑缺血再灌注一周内皮层和海马自噬的活性变化，以及褪黑素处理后对自噬的影响。方法：（1）实验分组及动物模型的制作：成年雄性SD大鼠，分为三组：假手术组，缺血再灌注组（MCAO组），褪黑素处理组。假手术组：仅模... 详细信息

目的：研究SD大鼠脑缺血再灌注一周内皮层和海马自噬的活性变化，以及褪黑素处理后对自噬的影响。方法：（1）实验分组及动物模型的制作：成年雄性SD大鼠，分为三组：假手术组，缺血再灌注组（MCAO组），褪黑素处理组。假手术组：仅模拟手术，不阻塞中动脉，一天后处死，作为对照组。MCAO组：实施左侧中动脉缺血90min之后再灌注1,3,5,7天。褪黑素处理组：实施左侧中动脉缺血90min，再灌注时腹腔注射给药，以后每24h给药一次。（2）样本采集：TTC染色确定缺血部位，取相应缺血区皮层，海马，及相对应右侧皮层，海马。（3）Western blot检测自噬相关蛋白LC3,Beclin1,p-p70s6k，p70s6k的表达情况。结果：1）TTC染色结果显示与假手术组相比，MCAO组皮层及皮下组织有明显的缺血灶。2）Western Blot结果：（1）MCAO组，随着再灌注时间的延长，皮层组织的Western blot结果显示相对于假手术组LC3-Ⅱ的水平先上升后下降，在第一天时达到最高（p0.05）。皮层中Beclin1的表达随着时间延长表现出先增后降的趋势，第一、三、五天表现出增长的趋势，且第三天与假手术组相比有明显的差异(P0.05），Beclin1的变化趋势与皮层一致，表现为先增后降，第五天与假手术组相比有明显的增加（P0.05），皮层中Beclin1的水平与LC3-Ⅱ的水平变化相吻合，但与假手术组相比没有统计学的差异（p>0.05）。海马中Beclin1整个过程没有明显的起伏，与假手术组相比没有明显的差异（p>0.05）。结论：缺血再灌注诱导SD大鼠皮层和海马组织LC3-Ⅱ、Beclin-1表达上调，促进细胞自噬，同时p-p70s6k/p70s6k的比值表现出增加的趋势。褪黑素处理之后LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达在第一天并未表现增强，之后几天表现为缓慢增加，与缺血再灌注组变化趋势相反，表明褪黑素可能会通过调节自噬使自噬维持在一定的水平，从而减少缺血再灌注造成的损伤。

关键词：自噬 MCAO LC3 Beclin1 褪黑素

YANK2在胶质瘤生长中的作用及其机制研究

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YANK2在胶质瘤生长中的作用及其机制研究

作者：程悦华中科技大学

学位级别：硕士

背景:多形性胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,占胶质瘤的50%左右。具有肿瘤异质性高、侵袭性高等特点,患者预后差,复发率高,中位生存期短。现有的针对胶质瘤的分子靶向药物的临床效果有限,对其新的分子机制研究有助于... 详细信息

背景:多形性胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,占胶质瘤的50%左右。具有肿瘤异质性高、侵袭性高等特点,患者预后差,复发率高,中位生存期短。现有的针对胶质瘤的分子靶向药物的临床效果有限,对其新的分子机制研究有助于探索新的分子治疗靶点。研究表明YANK2在胶质瘤中表达水平高,且与患者预后相关。但是YANK2在胶质瘤中的具体作用及其机制尚不清晰。目的:本研究旨在探索YANK2在胶质瘤中的具体生物学作用以及相关分子机制。方法:1.通过生物信息学分析研究YANK2在胶质瘤中的表达水平、生存分析、潜在的相关性分子。2.在JB6 Cl41细胞中过表达YANK2利用锚定非依赖性细胞生长实验研究其是否具有促进正常表皮细胞恶性转化的作用。3.在U87MG、Hs683细胞中敲低YANK2,在U118MG、H4、GL261细胞中过表达YANK2,用MTT实验、平板克隆、锚定非依赖性细胞生长实验研究其对胶质瘤细胞体外增殖、克隆形成能力的影响;用Western Blot检测上述细胞系中相关信号通路分子的水平,如AKT、c-Met、TOPK等,探究YANK2在胶质瘤中发挥促肿瘤作用的分子机制。4.在GL261细胞中过表达YANK2,并将其注射进小鼠颅内,利用脑原位模型及小动物活体成像技术研究其在体内对胶质瘤肿瘤生长的影响以及对成瘤小鼠生存期的影响。5.敲低Fyn,用Western Blot检测YANK2的表达。通过内、外源性免疫共沉淀实验检测Fyn和YNAK2是否具有相互作用。通过体外激酶实验检测Fyn是否能在体外磷酸化YANK2。结果:***2在胶质瘤中表达水平高于正常组织,且与患者生存期负相关。2.过表达YANK2后的JB6 Cl41细胞的锚定非依赖生长能力强,形成的克隆大。3.沉默YANK2的胶质瘤细胞的增殖速度变慢、形成的克隆变小;而过表达YANK2的胶质瘤细胞的增殖速度变快、形成的克隆变大。4.过表达YANK2的GL261在小鼠颅内形成的肿瘤生长快,瘤块大,小鼠生存期缩短。5.与对照组相比,沉默YANK2的胶质瘤细胞中,AKT、c-Met、TOPK的蛋白表达水平降低;而过表达YANK2的胶质瘤细胞中,AKT、c-Met、TOPK的蛋白表达水平增加。6.敲低胶质瘤细胞中的Fyn,YANK2的表达显著降低。***细胞内的Fyn,能够检测到YANK2;反之,IP细胞内的YANK2,检测到Fyn。***在体外磷酸化YANK2。结论:***2在体内外促进胶质瘤的生长,是治疗胶质瘤候选靶标。***2可能通过促进AKT、c-Met、TOPK的表达来促进胶质瘤生长。***是YANK2的上游激酶。

关键词：胶质瘤 YANK2 Fyn AKT MET

泮托拉唑靶向蛋白激酶TOPK抑制结肠癌的作用研究

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泮托拉唑靶向蛋白激酶TOPK抑制结肠癌的作用研究

作者：曾孝玉华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探讨泮托拉唑能否通过靶向蛋白激酶TOPK抑制结肠癌生长。方法:1)基于TOPK结构,在FDA批准的药物和保健药品库中,采用计算机虚拟配体筛选得到潜在的TOPK抑制剂—泮托拉唑,并采用MST实验检测泮托拉唑能否与TOPK结合。2)采用MTS实验,... 详细信息

目的:探讨泮托拉唑能否通过靶向蛋白激酶TOPK抑制结肠癌生长。方法:1)基于TOPK结构,在FDA批准的药物和保健药品库中,采用计算机虚拟配体筛选得到潜在的TOPK抑制剂—泮托拉唑,并采用MST实验检测泮托拉唑能否与TOPK结合。2)采用MTS实验,筛选细胞实验中泮托拉唑可使用的最大剂量。3)采用软琼脂集落形成实验(soft agar assay)分析泮托拉唑对JB6 Cl41,结肠癌细胞及sh TOPK结肠癌细胞增殖的抑制作用。4)采用体外激酶实验分析泮托拉唑对TOPK活性的抑制作用。5)采用Western blot实验技术,在JB6 Cl41细胞和HCT 116细胞中检测泮托拉唑对TOPK信号通路的影响。6)建立裸鼠荷瘤模型,观察泮托拉能否抑制体内结肠癌生长。结果:1)计算机虚拟配体筛选和MST实验确定泮托拉唑直接结合TOPK。2)泮托拉唑抑制EGF诱导的JB6 Cl41细胞以及结肠癌细胞锚定非依赖性增殖。3)泮托拉唑在体外和在细胞内均能抑制TOPK激酶活性。4)泮托拉唑对沉默TOPK后的结肠癌细胞的增殖抑制作用不明显。5)泮托拉唑抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。结论:泮托拉唑直接抑制TOPK活性达到抗结肠癌效应。

关键词：泮托拉唑质子泵抑制剂 TOPK 细胞转化结肠癌

AGK通过促进ATAD3A与TIM23的结合导致AD线粒体自噬障碍

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AGK通过促进ATAD3A与TIM23的结合导致AD线粒体自噬障碍

作者：李文胜华中科技大学

学位级别：硕士

背景:线粒体自噬作为线粒体质量控制方式之一,用于清除功能失调或多余的线粒体,从而调节线粒体数量并维持能量代谢。越来越多的证据表明,线粒体自噬障碍在阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生发展中起着重要作用。线粒体自噬... 详细信息

背景:线粒体自噬作为线粒体质量控制方式之一,用于清除功能失调或多余的线粒体,从而调节线粒体数量并维持能量代谢。越来越多的证据表明,线粒体自噬障碍在阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生发展中起着重要作用。线粒体自噬缺陷导致的线粒体功能障碍与Aβ和Tau病理的相互作用加重神经元损伤。目的:本研究旨在探寻AGK对线粒体自噬的影响,在AD线粒体自噬障碍中的作用与机制,为AD的治疗提供新的分子靶标。方法:在SH-SY5Y细胞中沉默或过表达AGK,通过Western blot,q PCR,免疫荧光实验探究沉默或过表达AGK后线粒体的自噬水平。然后利用细胞流式实验测定线粒体的相对膜电位。通过IP实验寻找AGK在线粒体自噬过程中潜在的作用分子。最后利用脑立体定位技术进行干预治疗,通过行为学实验检测小鼠的认知功能。结果:本研究发现:1)沉默AGK可以促进线粒体自噬;2)AGK在AD患者和13月龄的APP/PS1小鼠的海马组织中表达量均有所增加;3)IP实验发现AGK与ATAD3A有相互作用,并可以促进ATAD3A与TIM23结合;4)进一步,在神经元细胞和APP/PS1小鼠中沉默AGK后发现线粒体膜电位增加,线粒体自噬增强,PTau蛋白水平降低,以及小鼠认知功能改善。结论:上述结果提示AGK通过促进ATAD3A与TIM23结合进而导致AD线粒体自噬障碍,为AD的发生机制提供新线索,为其治疗提供新的分子靶标。

关键词：阿尔兹海默病线粒体自噬 AGK ATAD3A TIM23

甲基黄连碱靶向Aurora-B抑制银屑病的机制研究

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甲基黄连碱靶向Aurora-B抑制银屑病的机制研究

作者：倪小芳华中科技大学

学位级别：硕士

背景:银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病,全球患病率约为2%。其病理特点是角质形成细胞的过度增殖和异常分化,影响患者的皮肤、指甲和关节。研究表明,银屑病会影响患者的自尊,发生心脏病、肥胖、糖尿病、关节炎、抑郁症等... 详细信息

背景:银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病,全球患病率约为2%。其病理特点是角质形成细胞的过度增殖和异常分化,影响患者的皮肤、指甲和关节。研究表明,银屑病会影响患者的自尊,发生心脏病、肥胖、糖尿病、关节炎、抑郁症等疾病的风险增加,从而降低生活质量。银屑病易复发,迁延不愈,其完全治愈是当前面临的主要难题,这一问题的解决有利于提高患者的生活质量和降低其他疾病的患病风险,具有重大的临床价值及社会意义。我国传统中药黄连具有抗炎作用,甲基黄连碱是黄连中提取的一种单体成分,其在银屑病中作用及其机制研究未知。目的:探索甲基黄连碱在银屑病中的作用及分子机制。方法:1、在人源性角质形成细胞Ha Ca T中加入一定浓度的M5(TNF-α、IL-17A、IL-22、IL-1α和Oncostatin-M),处理不同时间,收集细胞,提取总蛋白,采用Western Blot方法检测银屑病标志蛋白S100A7的蛋白含量、STAT3蛋白含量及磷酸化水平。2、采用MTT方法检测甲基黄连碱对细胞的毒性作用,并选取合适的浓度梯度进行后续试验。3、在银屑病样细胞模型中加入甲基黄连碱,采用Western Blot方法检测银屑病标志蛋白S100A7的蛋白含量、STAT3蛋白含量及磷酸化水平。4、采用Kinase Array筛选甲基黄连碱潜在的作用靶标。5、采用体外激酶实验,验证甲基黄连碱是否可以在体外抑制Aurora-B。6、在银屑病样细胞模型中加入甲基黄连碱,采用Western Blot方法检测能够反映细胞内Aurora-B活性的Histone-H3(Ser10)的磷酸化水平。7、建立小鼠银屑病模型,用卡波姆940或者甲基黄连碱(Worenine,WOR)、氢化可的松(Hydrocortisone,HYD)涂于小鼠背部和耳朵,然后再涂抹咪喹莫特软膏(Imiquimod,IMQ),连续涂抹五天,最后将小鼠处死。8、动物建模期间,每天观察并拍照记录小鼠背部和耳部皮肤的形态学变化,并采用银屑病面积与严重性指数(Psoriasis area and severity index,PASI)对银屑病严重程度进行评估。9、取小鼠背部和耳部皮肤进行H&E染色,观察其病理学变化。10、小鼠背部皮肤匀浆后,采用Western Blot方法检测S100A7、STAT3、p-STAT3、p-Aurora-B和p-Histone-H3,进一步检测甲基黄连碱对STAT3和Aurora-B活性的影响。结果:1、在Ha Ca T中加入M5后,银屑病标志蛋白S100A7的蛋白含量、STAT3蛋白含量及磷酸化水平升高,成功建立银屑病样细胞模型。2、在Ha Ca T中加入甲基黄连碱,选取细胞活性在80%以上的浓度并设置浓度梯度(0、2μM、5μM和12.5μM)进行后续实验。3、在银屑病样细胞模型中加入甲基黄连碱后,银屑病标志蛋白S100A7的蛋白含量、STAT3蛋白含量及磷酸化水平降低,证实甲基黄连碱可以呈浓度和时间依赖性抑制Ha Ca T细胞中银屑病样的发生。4、Kinase Array实验筛选出Aurora-B是甲基黄连碱潜在的作用靶标。5、采用体外激酶实验,证实甲基黄连碱可以在体外抑制Aurora-B的激酶活性。6、在银屑病样细胞模型中加入甲基黄连碱后,p-Histone-H3(Ser10)降低,证实甲基黄连碱可以在细胞水平抑制Aurora-B的激酶活性。7、成功建立了IMQ诱导的银屑病样的动物模型。8、动物模型中,与IMQ组相比,甲基黄连碱组小鼠背部和耳部皮肤的银屑病样病变明显减轻,且PASI指数明显降低,在形态学和病理学上证实甲基黄连碱可以抑制银屑病的发生。9、小鼠背部皮肤中检测到的S100A7、STAT3、p-STAT3、p-Aurora-B和p-Histone-H3(Ser10)降低,进一步证实甲基黄连碱通过抑制STAT3和Aurora-B的活性来抑制银屑病的发生。结论:1、甲基黄连碱可以在细胞水平和动物水平抑制银屑病的发生。2、甲基黄连碱可以抑制银屑病所引起的STAT3的活化。3、Aurora-B是甲基黄连碱的潜在作用靶点。4、甲基黄连碱作为Aurora-B的潜在抑制剂能够缓解银屑病症状,为银屑病的治疗提供了新的方向和新的靶标。

关键词：甲基黄连碱 Aurora-B STAT3 Histone-H3 咪喹莫特IMQ 银屑病 S100A7

甲基黄连碱靶向抑制JNK2预防日光性皮炎及分子机制研究

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甲基黄连碱靶向抑制JNK2预防日光性皮炎及分子机制研究

作者：马腾飞华中科技大学

学位级别：硕士

背景:日光紫外辐射(UV)常常会导致皮肤炎症甚至肿瘤等皮肤问题。传统的紫外防护化合物多因其副作用而导致应用受限,因此,研发高效无副作用的紫外防护的化合物显得十分重要。近年来,天然化合物以其抗炎、抗氧化的能力为皮肤提供多方长效... 详细信息

背景:日光紫外辐射(UV)常常会导致皮肤炎症甚至肿瘤等皮肤问题。传统的紫外防护化合物多因其副作用而导致应用受限,因此,研发高效无副作用的紫外防护的化合物显得十分重要。近年来,天然化合物以其抗炎、抗氧化的能力为皮肤提供多方长效保护作用而成为研究热点。传统中草药黄连具有抗炎抗氧化效应,甲基黄连碱是其有效单体成分,但在日光性皮炎中作用及其机制研究未知。目的:探讨甲基黄连碱在预防紫外诱导的皮炎中的作用及分子机制。方法:(1)采用计算机辅助筛选法和体外激酶筛选实验(kinase array),发现甲基黄连碱的候选靶标分子:JNK2。(2)原核表达并纯化GST-JNK2蛋白,采用微量热泳动实验(MST)分析甲基黄连碱与JNK2相互作用及结合常数。(3)体外激酶实验分析甲基黄连碱对JNK2活性抑制作用。(4)通过MTT实验,观察不同浓度的甲基黄连碱对JB6 Cl41和Ha Ca T细胞的活性影响。(5)建立UV诱导的日光性皮炎细胞模型,并用不同浓度甲基黄连碱预处理不同时间,收集细胞培养上清、裂解细胞提取蛋白,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中IL-6浓度,免疫印迹实验(Western Blot)分析p38、JNK2信号通路相关分子表达。(6)裸露BALB/c小鼠背部皮肤,UV照射,建立UV诱导的日光性皮炎动物模型,用甲基黄连碱药膏预处理受照射皮肤,24h后采集皮肤,分为两份,一份进行H&E染色,观察皮肤病理变化;一份采用液氮研磨法提取皮肤组织蛋白,采用ELISA检测皮肤组织中炎症因子IL-6的含量,蛋白免疫印迹实验测皮肤组织中JNK2、p38相关信号通路因子的表达。结果:(1)甲基黄连碱可以结合JNK2,K值为116.41μM并呈以剂量依赖方式抑制JNK2活性。(2)甲基黄连碱预处理Ha Ca T细胞,抑制紫外诱导JNK2、p38和转录因子ATF2的磷酸化,抑制炎症因子IL-6的分泌。(3)甲基黄连碱能够减轻紫外照射引起的小鼠皮肤表皮增厚和炎性细胞浸润,抑制了皮肤组织中UV诱导的JNK2、p38磷酸化水平上调及IL-6分泌增加。结论:(1)甲基黄连碱是JNK2的抑制剂。(2)甲基黄连碱抑制JNK2,减轻紫外造成的皮肤损伤。(3)甲基黄连碱可开发为预防和治疗日光性皮炎的药物。

关键词：日光性皮炎甲基黄连碱 JNK2 p38 IL-6

褪黑素通过增强自噬保护缺血再灌注损伤的N2a

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褪黑素通过增强自噬保护缺血再灌注损伤的N2a

作者：国艳春华中科技大学

学位级别：硕士

Researches have shown that melatonin is neuroprotectant in ischemia/reperfusion- mediated injury. Although melatonin is known as an effective antioxidant, the mechanism of the neuroprotection cannot be explained merely by its antioxidation. Our study was devoted to explore other existing mechanisms by investigating whether melatonin protects ischemia/reperfusion-injured neurons through elevating autophagy, since autophagy has been frequently suggested to play a crucial role in neuron survival. To find it out, an ischemia/reperfusion model in N2a cells was established for examination by MTT, TEM, LCSM and Western Blotting. The results showed that autophagy was significantly enhanced in N2a cells treated with melatonin at reperfusion onset following ischemia and cell viability was remarkably increased, while autophagy blockage by 3-MA led to decreased N2a cell survival. Besides, classic antioxidant Vitamin C was not as strong as melatonin in promoting cell survival. It was also observed that rapamycin, an autophagy activator, greatly activated autophagy but did not promote cell survival as did melatonin. Taken together these data suggest that in addition to antioxidation, autophagy is possibly one of the mechanisms underlying neuroprotection of melatonin.

关键词：缺血再灌注细胞保护褪黑素细胞生物学

在胶质瘤中TOPK磷酸化STAT3促进其转录活性

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在胶质瘤中TOPK磷酸化STAT3促进其转录活性

作者：袁征华中科技大学

学位级别：硕士

背景:胶质瘤是人颅内最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然对胶质瘤的分子生物学特征方面有了较大进展,但在治疗方面仍未取得很大突破。寻找新的重要分子标志物对胶质瘤分子病理分型诊断、治疗及预后判断有深远的意义。本实验室前期研究发现:T... 详细信息

背景:胶质瘤是人颅内最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然对胶质瘤的分子生物学特征方面有了较大进展,但在治疗方面仍未取得很大突破。寻找新的重要分子标志物对胶质瘤分子病理分型诊断、治疗及预后判断有深远的意义。本实验室前期研究发现:T细胞来源的蛋白激酶(TOPK)在胶质瘤中高表达,与胶质瘤分级呈正相关,患者的预后呈负相关;TOPK不仅促进胶质瘤细胞的生长,还直接磷酸化ULK1抑制自噬起始进而促进对替莫唑胺(TMZ)耐药。虽然关于TOPK在胶质瘤发生发展的作用有初步了解,但其详细作用机制特别是下游靶分子有待进一步深入研究。STAT3的Y705和S727的磷酸化修饰影响其在细胞内定位和转录活性,跟细胞的生长关系密切。研究发现STAT3信号通路异常激活促进胶质瘤细胞生长,但同样在胶质瘤细胞中异常活化的TOPK能否直接磷酸化修饰STAT3并调控其转录活性未见报道。目的:在胶质瘤细胞中,明确TOPK是否调控STAT3转录活性并阐明分子机制。方法:1、收集不同胶质瘤级别临床标本,用Western Blot方法检测TOPK和p STA T3(Y705和S727)的水平,分析TOPK与STAT3相关性。2、采用sh RNA沉默技术抑制胶质瘤细胞内TOPK表达,用Western Blot方法检测STAT3、p STAT3(Y705和S727)和STAT3下游效应分子BCL-2和BCL-XL。3、使用TOPK抑制剂OTS964处理细胞,用Western Blot方法检测STAT3、p STAT3(Y705和S727)。4、通过H is pull down实验、外源性和内源性Co-IP实验证明TOPK和STAT3是否存在相互作用。5、体外激酶实验和外源性IP实验证明了TOPK是否可以直接磷酸化修饰ST AT3。6、利用Net Phos 2.0网站预测STAT3潜在的磷酸化位点并体外合成相对应肽段,通过肽谱激酶实验检测TOPK磷酸化修饰STAT3的具体位点。7、采用定点突变技术构建STAT3被TOPK磷酸化修饰位点失活突变质粒(STAT3-S216A、STAT3-S521A和STAT3-S590A),与TOPK共转染至293T细胞,采用Flag抗体免疫沉淀F lag-STAT3蛋白,通过Western Blot方法检测p Ser和HA-TOPK信号。8、将空载、STAT3野生型、STAT3-S216A、STAT3-S521A和STAT3-S590A质粒以病毒包装形式感染胶质瘤细胞,建立稳定过表达细胞系,采用Western Blot方法检测BCL-2、BC L-XL的蛋白水平。9、构建STAT3-3A(S216A/S521A/S590A)和STAT3-3D(S216D/S521D/S590D)质粒,建立稳定表达细胞系,用Western Blot方法检测STAT3的靶基因BCL-2、BCL-XL的蛋白水平,采用MTT实验观察细胞增殖能力。结果:1、TOPK、pSTAT3(Y705和S727)在高级别胶质瘤临床样本中表达水平高,并且表达水平具有相关性。2、沉默TOPK或抑制TOPK活性,细胞内p STAT3(Y705和S727)水平降低,STAT3总蛋白水平下降不明显;沉默TOPK后,STAT3下游靶基因BCL-2和BCL-XL蛋白水平下调。3、His pull down实验、外源性和内源性Co-IP实验显示利用STAT3抗体免疫沉淀后的细胞裂解液可以检测到TOPK信号,同样富集TOPK后细胞裂解液可检测出STAT3信号。4、体外激酶实验中,ST AT3和TOPK同时存在的实验组、S2、S6和S7三个肽段(分别含有S216、S521和S590位点),可通过放射自显影技术检测出磷酸化信号。5、细胞外源性IP实验无EGF刺激时,转染STAT3实验组中STAT3丝氨酸磷酸化水平无明显变化;在EGF刺激后,相比于单转STAT3组,共转实验组中STAT3丝氨酸磷酸化水平升高。与转染STAT3组相比,STAT3-S216A、STAT3-S521A、STAT3-S590A三个磷酸化失活突变体组的STAT3丝氨酸磷酸化水平明显下降。6、在过表达STAT3-S216A、ST AT3-S521A和STAT3-S590A的细胞内发现BCL-2和BCL-XL蛋白水平显著下降。7、过表达STAT3-S216A/S521A/S590A细胞内的BCL-2蛋白水平无明显变化,BCL-XL蛋白水平上调。而过表达STAT3-3D质粒细胞内的BCL-XL和BCL-2蛋白水平无明显变化。MTT实验中四个过表达细胞系的细胞增殖能力之间无显著差异。结论:1、TOPK是STAT3上游蛋白激酶,磷酸化STAT3 S216、S521和S590位点。2、STAT3被TOPK磷酸化后促进其转录活性。3、STAT3 S21

关键词：胶质瘤磷酸化修饰 TOPK STAT3 OTS964

RIOK3促进食管鳞状细胞癌增殖及其作用机制的研究

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RIOK3促进食管鳞状细胞癌增殖及其作用机制的研究

作者：张丽媛华中科技大学

学位级别：硕士

背景:食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,是世界第七大癌症。在中国,食管癌患者类型以鳞状细胞癌为主,占90%以上,整体5年生存率小于20%。近年来,联合应用靶向药物是一种非常有前景的肿瘤治疗方式,但针对食管鳞状细胞癌的靶向药物较... 详细信息

背景:食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,是世界第七大癌症。在中国,食管癌患者类型以鳞状细胞癌为主,占90%以上,整体5年生存率小于20%。近年来,联合应用靶向药物是一种非常有前景的肿瘤治疗方式,但针对食管鳞状细胞癌的靶向药物较少,且临床获益不佳。因此,寻找食管鳞状细胞癌发生发展的分子机制,确定食管鳞状细胞癌新的治疗靶标,为食管鳞状细胞癌的联合治疗提供新视角十分必要。RIOK3(RIO kinase 3)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,属于非典型激酶家族中的RIO(right open reading frame)家族。目前,RIOK3晶体结构尚未解析,许多生物学功能仍然未知。研究报道RIOK3与肿瘤关系密切:在胰腺癌中发现RIOK3基因扩增;RIOK3在胶质瘤中高表达,通过AKT/m TOR信号通路促进肿瘤的增殖,迁移和侵袭;缺氧情况下RIOK3促进基底样乳腺癌的侵袭和转移。生物信息学分析发现在食管鳞状细胞癌中存在RIOK3 m RNA水平上调,但其在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及分子机制有待阐明。目的:本研究旨在探究RIOK3对食管鳞状细胞癌发生发展的作用及作用机制。方法:1.在TCGA数据库及食管鳞状细胞癌细胞系中分析RIOK3的表达水平。2.在易转化的小鼠表皮细胞JB6 Cl41中过表达RIOK3,Softagar实验观察细胞非锚定依赖式生长能力。3.建立RIOK3的沉默和过表达食管鳞状细胞癌细胞系,MTT、Softagar、平板克隆以及划痕实验检测细胞的增殖、非锚定依赖式生长、克隆形成以及迁移能力。***/c-nude鼠皮下接种RIOK3沉默细胞系,监测肿瘤生长变化。5.提取RIOK3沉默和过表达细胞的总蛋白,Western Blot方法检测支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)及其直接下游底物支链α酮酸脱氢酶(BCKDH)复合物的E1α亚基(BCKDHA)的磷酸化及总蛋白水平。6.采用哺乳动物双杂交,外源性和内源性免疫共沉淀(IP)实验证明RIOK3和BCKDK二者是否存在相互作用。7.在过表达RIOK3的细胞系中IP RIOK3并进行质谱鉴定,对结果进行基因富集分析。结果:***3在食管鳞状细胞癌细胞中蛋白水平较正常食管上皮细胞高。***3能够诱导JB6 Cl41细胞转化。3.沉默RIOK3后,细胞增殖慢,克隆小,克隆生长能力弱,数目少,迁移变慢。4.过表达RIOK3后,细胞增殖快,克隆大,克隆生长能力强,数目多,迁移变快。5.沉默RIOK3后的KYSE30在免疫缺陷鼠体内,肿瘤生长慢,体积小。6.在沉默RIOK3组的细胞中,BCKDK的蛋白水平和它下游底物BCKDHA的磷酸化水平显著降低;相反,在过表达RIOK3组的细胞,BCKDK的蛋白水平和它下游底物BCKDHA的磷酸化水平显著增加。7.哺乳动物双杂交实验显示,共转染p ACT-BCKDK+p BIND-RIOK3+p G5-luc和阳性组一样显示出荧光。8.外源性IP实验转染Myc-RIOK3与His-BCKDK质粒,IP Myc可以检测到BCKDK。内源性IP收取细胞裂解液,IP BCKDK可以检测到RIOK3。9.质谱的基因富集分析按照P值展示前20个基因集,显示RIOK3与RNA代谢,核糖核蛋白复合体生物发生,Rho GTPase信号调控,细胞周期进展等生物过程相关。结论:***3在食管鳞状细胞癌中表达上调,促进肿瘤的发生、增殖和迁移。2.在食管鳞状细胞癌中,RIOK3与BCKDK直接相互作用,且RIOK3上调BCKDK蛋白水平和活性。

关键词：肿瘤增殖食管鳞状细胞癌 RIOK3 BCKDK