检索结果-南通市图书馆

作者：袁航华侨大学

学位级别：硕士

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最受欢迎的合成聚酯之一,它是由乙二醇（EG）和对苯二甲酸（TPA）制成的聚合物。由于其耐久性,它被广泛用于饮料瓶、包装材料和纺织纤维和许多其他领域,给人类生活带来极大便利。然而,一旦进入环境,PET变... 详细信息

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最受欢迎的合成聚酯之一,它是由乙二醇（EG）和对苯二甲酸（TPA）制成的聚合物。由于其耐久性,它被广泛用于饮料瓶、包装材料和纺织纤维和许多其他领域,给人类生活带来极大便利。然而,一旦进入环境,PET变得易碎,分解成更小的碎片,形成微/纳米塑料（<5毫米）,进入食物链,对海洋和人类生命造成危害,对全球生态系统造成严重问题。酶法降解技术因其环境友好性和低能耗被认为是解决塑料降解的一种有吸引力的方法,但也面临着一些尚未解决的挑战,如酶制备和再利用成本高且复杂,酶与PET接触困难,并且有中间产物抑制,纳米PET（Nano PET）目前无法从市面上购买得到等问题。为了解决上述问题,本论文主要展开以下工作:首先,提出了一种“一体化”的策略,即以角质酶（突变体WCCG）为模型酶,与类弹性蛋白多肽（ELPs）标签构建融合蛋白（ET-C）来实现PET高效降解。利用ELPs作为纯化标记,通过简单离心可大规模制备角质酶,其活性回收率为57.55%,产量为160 mg/L。并且,设计良好含有疏水性和芳香族氨基酸残基的ELPs,可以通过疏水和π-π相互作用改善角质酶-PET的相互作用,从而提高PET的生物降解效率。与没有ELPs标记的角质酶相比,ELPs标记的角质酶降解微塑料的活性提高了1.3倍,降解大颗粒塑料时活性提高了1.66倍。此外,通过ELPs介导的生物硅化获得自固定化角质酶（ET-C@SiO）。SEM-Mapping,EDS,CLSM,FTIR和TGA结果相互验证,表明ET-C成功固定化在二氧化硅上。ET-C@SiO表现出较高的负载量、活性和热稳定性,并且在重复使用10次后保持77.65%的原始活性。更令人鼓舞的是,带ELPs标签的角质酶（ET-C）降解PET的产物为TPA,这是由于融合ELPs轻微改变了酶的活性口袋,而野生型角质酶产物为TPA和MHET。与现有方法相比,这是一种简单的消除MHET抑制的方法。其次,建立了一种基于ELPs仿生矿化制备包磁二氧化硅的酶固定化方法,将其用于降解纳米塑料。首先,利用ELPs-（K5V4F）仿生矿化合成生物相容的磁性纳米粒子（ELPs-MNPs）作为磁芯。然后将ET-C与ELPs-MNPs纳米粒子充分混合,加入硅前体（TEOS）,ELPs介导生成二氧化硅包覆表面,同时实现角质酶的自固定化（ET-C@SiO@MNPs）,整个过程仅需31分钟。SEM-Mapping,EDS,FTIR,VSM和TGA结果相互验证,表明二氧化硅包覆在磁性纳米粒子上且ET-C成功自固定化。ET-C@SiO@MNPs能在30秒内完成磁分离,效果良好,简化了固定化酶的回收与再利用。与游离酶相比,固定化酶热稳定性拥有较明显的优势,并且磁分离11次后,仍保持86%的原始活性。由于纳米PET（Nano PET）目前无法从市面上购买得到,采用一种简单、快速和有效的方法来制备:以微塑料PET作为原料,用三氟乙酸处理后超声沉降制得Nano PET。SEM、FTIR和DLS结果证明Nano PET的成功制备,且尺寸分布为297±43 nm。将ET-C@SiO@MNPs用于降解Nano PET,1.5小时后,可得到0.00385 mg BHETeq,其降解速率为游离酶的94.8%。本论文基于多功能ELPs提出了一种一体化策略,解决酶法降解PET中出现的问题,为PET降解和循环利用铺平了一条经济、可扩展的道路,这有助于推动PET降解研究从实验室走向实际应用。

关键词：聚对苯二甲酸乙二醇酯类弹性蛋白多肽角质酶亲和力酶法降解PET 固定化酶

β-1，3-木聚糖酶祖先序列重建及水解产物类型改造

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β-1，3-木聚糖酶祖先序列重建及水解产物类型改造

作者：曾波华侨大学

学位级别：硕士

β-1,3-木聚糖酶(EC 3.***.1.32)可以水解β-1,3-木聚糖,其水解产物中的单糖(木糖)可用于高附加值化学品的生产,如木糖醇、2,3-丁二醇等;而β-1,3-低聚木糖则具有多种生物活性,如抗氧化活性、抗凝血活性和抗肿瘤活性(例如人乳腺癌细胞MCF... 详细信息

β-1,3-木聚糖酶(EC 3.***.1.32)可以水解β-1,3-木聚糖,其水解产物中的单糖(木糖)可用于高附加值化学品的生产,如木糖醇、2,3-丁二醇等;而β-1,3-低聚木糖则具有多种生物活性,如抗氧化活性、抗凝血活性和抗肿瘤活性(例如人乳腺癌细胞MCF-7)。因此,β-1,3-木聚糖酶在生物资源利用和寡糖制备领域具有潜在的应用前景。目前,已报导的β-1,3-木聚糖酶催化性能不高,限制了其在工业上的应用。此外,未来酶法制备功能性寡糖将会替代化学法。然而,大部分酶的水解产物中都会有对应的单糖存在,一些单糖的占比甚至超过20%,这对于制备高纯度寡糖来说是不利的。基于此,本论文主要开展以下工作:首先,为提升β-1,3-木聚糖酶在工业上的应用水平,本文提出并使用优化的祖先序列重建策略来提升β-1,3-木聚糖酶催化性能。本文重建了6个祖先β-1,3-木聚糖酶,通过分子对接和动力学模拟筛选得到了预期目标的祖先Anc Xyl09,并进行实验表征验证。结果表明,Anc Xyl09底物谱发生改变且具有高热稳定性,具有工业化应用潜力。Anc Xy09的最适温度为55℃,p H为6.5,属于中温的β-1,3-木聚糖酶。50℃半衰期为65.08 h,具有良好的热稳定性。本文通过蛋白互作网络和分子动力学模拟分析,发现氢键和二硫键是维持Anc Xyl09热稳定性的主要原因。有趣的是,β-1,3-木聚糖酶(Anc Xyl09)除了能水解原始底物β-1,3-木聚糖外,还能水解地衣多糖,这是首次报道底物谱发生改变的β-1,3-木聚糖酶。Anc Xyl09在水解β-1,3-木聚糖和地衣时,水解产物以双糖为主,分别反应24 h后β-1,3-木二糖占比为79%,地衣二糖占比为76%,可显著简化低聚寡糖的分离纯化步骤。Anc Xyl09水解产物(β-1,3-低聚木糖、地衣寡糖)具有良好的抗氧化性,在1.5 mg/ml时,对羟基自由基的清除活性均达到100%。其次,制备寡糖的酶水解产物中都会有对应的单糖单元存在。为了改造及筛选只产生特定寡糖的水解酶(GH),本文提出了一种改造、筛选酶水解产物类型的新策略,为挖掘只产生特定寡糖的水解酶(GH)提供了有效工具。第一步,将重建的祖先β-1,3-木聚糖酶作为潜在的只产特定寡糖的筛选数据库。通过分子对接,本文采集了影响β-1,3-木聚糖酶水解产物类型的因子。通过对水解产物类型进行数值编码并对数据集进行训练,本文建立了两种数据挖掘算法。它们为非线性Logit Boost分类器和线性PLSR分类器,对“寡糖”这种类型的预测准确率可达100%,用于预测祖先β-1,3木聚糖酶水解产物的类型。第二步,通过两种算法对剩余的5个祖先蛋白进行筛选,最后本文选取了水解产物类型预测为只有寡糖的祖先β-1,3-木聚糖酶Anc Xyl10进行表征。其水解产物仅为寡糖(β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖),实验结果与两者预测模型结果一致,进一步证明了预测器的可靠性。这是第一个通过祖先序列重建方法改变水解产物类型的成功案例,Anc Xyl10在制备高纯度β-1,3-木糖聚寡糖方面具有应用潜力。第三步,本文结合实验结果和ASR过程(序列Gap处理和古代氨基酸置换)对Anc Xyl10的水解产物类型改变的分子机制进行探究,发现序列Gap处理和古代氨基酸置换影响了5个重要因子,导致β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖不能继续被水解,也导致不能产生三个以上木糖单位的低聚糖。综上所述,本研究使用优化的祖先序列重建策略成功提升了β-1,3-木聚糖酶的催化能力,在酶设计中具有潜在的应用价值,为β-1,3-低聚木糖、地衣寡糖制备及海藻资源利用提供了新的思路。其次,使用一种改造、筛选酶水解产物类型的新型组合策略成功应用于β-1,3-木聚糖酶,为改造及筛选只产生特定寡糖的水解酶提供了有效工具。Anc Xyl10水解产物类型改变的分子机制(五个因子及ASR过程),可为改造其他碳水化合物水解酶以产生特定寡糖提供了新的思路。两种策略的提出及其在β-1,3-木聚糖酶的成功应用,相较于传统方法,有利于避免实验盲目性并减少实验工作量,在酶的热稳定性,改变底物谱,水解产物类型的改造、筛选中具有很大的应用潜力和价值。

关键词： β-1,3-木聚糖酶祖先序列重建数据挖掘功能性寡糖低聚寡糖制备

肽启发制备磁性生物活性纳米复合物及其用于多酶定向固定化

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肽启发制备磁性生物活性纳米复合物及其用于多酶定向固定化

作者：周雁红华侨大学

学位级别：硕士

近年来,磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)因具有优秀的磁学性能、机械性能和比表面积等特点,而迅速发展成为一种极具潜力的新型材料,在生物医学、催化和固定化等方面均被广泛应用。其中,将MNPs应用于固定化酶,最重要的一个前... 详细信息

近年来,磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)因具有优秀的磁学性能、机械性能和比表面积等特点,而迅速发展成为一种极具潜力的新型材料,在生物医学、催化和固定化等方面均被广泛应用。其中,将MNPs应用于固定化酶,最重要的一个前提即为对其进行功能化修饰。传统制备和修饰MNPs的方法是通过添加有机溶剂(如戊二醛、N-异丙基-丙烯酰胺和过硫酸铵等)将MNPs与官能团偶联,以制备能够连接位于酶分子中目标基团的磁性纳米材料,且制备MNPs的过程大多需要在真空条件下进行,对反应条件要求较高,存在很多安全隐患,容易对环境造成污染,操作较复杂,所需时间长。因此,需要寻找一种无须借助有机溶剂的仿生矿化制备及修饰MNPs的策略,以使反应过程更加绿色环保,使MNPs对生态环境和生理环境具有更高的相容性。基于此,本论文开展如下工作:首先,设计温度响应性弹性蛋白样多肽(ELPs)的序列,构建具有40个VPGXG重复序列(“X”是赖氨酸:缬氨酸:苯丙氨酸=5:4:1的组合)的ELPs-(K5V4F)(NCBI中登录号为MZ073641)蛋白,在其C端设计带有色氨酸。借助ELPs-(K5V4F)一锅法参与仿生矿化制备MNPs,此反应在80℃的有氧环境下进行,反应108 min。XRD,TEM,元素定位和TGA结果相互验证,并表明ELPs-(K5V4F)参与了制备MNPs。XRD结果显示仿生矿化的产物为立方四氧化三铁晶体,结晶度相对较高,粒径大约为32 nm,这一结果在TEM分析中被更加直观地验证。蛋白质的特征元素C/N/O分析和TGA分析表明ELPs-(K5V4F)客观存在于MNPs上。磁性分析,温度相变分析和硅化产物的元素分析及FTIR分析分别表明:ELPs-MNPs具有经典的铁磁行为、ELPs-MNPs在36℃时具有明显的低临界溶液温度相行为和温度响应性以及ELPs-MNPs能够自发触发正硅酸四甲酯(TMOS)的生物硅化反应,将其自身捕获到氧化硅中,平均尺寸约为62 nm。其次,将Spy Catcher通过基因工程手段引入ELPs-(K5V4F)序列中。构建ELPs-(K5V4F)和Spy Catcher的融合蛋白KC和融合Spy Tag的木聚糖酶和地衣多糖酶双酶嵌合体(X-T-L)。KC参与一锅法仿生矿化制备MNPs(KC@FeO)。优化矿化实验所需的反应温度和时间。基于Spy Catcher和Spy Tag的自发共价结合,将KC@FeO用作从细胞裂解液中固定化X-T-L的载体,从而一步法实现X-T-L的定向固定化和纯化(X-T-L/KC@FeO)。其中,仿生矿化反应在有氧环境下进行,温度为30℃,反应12 min,相比于之前制备ELPs-MNPs,条件更加温和,节省反应时间;固定化过程在37℃的有氧环境中进行,40 min。在25°C温度条件下,将KC@FeO在多种环境下孵育1 h,仅在表面活性剂Tween 20的作用下,有5.90%的蛋白质被洗脱,而在其他条件下未检测到蛋白质分子,表明KC和FeO之间存在强烈的相互作用。XRD、TEM、SEM、FTIR和VSM表征和酶活性测定证实KC@FeO成功地一步法实现了X-T-L的定向固定化和纯化,固定化酶为立方四氧化三铁磁性晶体,具有经典的铁磁行为。X-T-L/KC@FeO在36 h内仅有7.91%的蛋白泄漏,与游离X-T-L具有相似的催化效率(K/K),固定化效果良好。固定化X-T-L的木聚糖酶固定化量为99.68%,固定化效率为72.05%,酶活回收率为71.82%;地衣多糖酶固定化量为92.27%,固定化效率为89.31%,酶活回收率为82.65%。固定化X-T-L的木聚糖酶在重复使用10次之后保留接近66.25%的初始酶活,地衣多糖酶在使用10次之后仍然保留72.66%的初始酶活力。本论文提出了一种温和的绿色简单的一步法高效合成多功能磁性纳米材料的方法。它不仅为智能生物材料的设计开辟了途径,而且代表了一种有效的酶定向固定化方法,为共价固定化生物催化剂的研究提供思路。

关键词：多功能磁性材料类弹性蛋白多肽定向固定化酶仿生矿化一锅法策略

Ferritin触发形成多功能碳酸酐酶超粒子用于CO2捕获

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Ferritin触发形成多功能碳酸酐酶超粒子用于CO2捕获

作者：刘冠章华侨大学

学位级别：硕士

为了抵消CO排放增加对大气造成的碳污染,迫切需要提出可持续的碳捕获和储存（CCS）方法。碳酸酐酶（CA）是一种生物体内普遍存在的锌酶,通过催化CO和HO可逆水合为HCO和H。由于可以在较小的设备中有效吸收和解吸CO,且不会产生有害的二次... 详细信息

为了抵消CO排放增加对大气造成的碳污染,迫切需要提出可持续的碳捕获和储存（CCS）方法。碳酸酐酶（CA）是一种生物体内普遍存在的锌酶,通过催化CO和HO可逆水合为HCO和H。由于可以在较小的设备中有效吸收和解吸CO,且不会产生有害的二次产物,从而降低资金和运营成本,所产生的碳酸氢盐还可以与钙离子反应转化为碳酸钙,以方便收集和储存或用于其他行业,CA成为了CCS领域的研究热点。尽管CA在CCS中的应用前景广阔,但仍有许多问题需要解决。第一,市售碳酸酐酶过于昂贵,无法实现大规模应用;第二,游离CA可重复使用性较差,虽然大部分有载体酶固定化方法可以解决,但是受到固定化过程复杂、固定化载体昂贵的阻碍。虽然交联酶聚集体（CLEAs）技术作为一种无载体固定化方法,其制备过程简单且不需要额外的载体,可大幅降低成本,但是该方法用戊二醛作为交联剂,其与氨基的自发反应缺乏选择性,这一定程度上会降低CA的活性;第三,大部分CA在工业碳捕获CO的环境下（高温、较碱）催化活性较差。为了解决上述问题,本论文开展如下工作:首先,提出了一种“多合一”的一体化策略。即将牛碳酸酐酶（b CA）的C末端与人铁蛋白H链相融合,构建p ET-b CA-Ferritin表达载体,再将其导入大肠杆菌中进行表达。融合蛋白b CA-F可以在细胞内自组装成微米级碳酸酐酶超粒子（mCASPs）,仅需低速离心即可从细胞破碎液中对其实现有效地纯化和制备,其酶活回收率为78%,产量高达870 mg/L。mCASPs可以作为一种无载体的固定化CA,在15次循环使用后还保留了90%以上的初始活性。有趣的是,mCASPs可自发重新溶解并形成催化性能更优异的纳米级寡聚碳酸酐酶粒子（n CAOPs）,其CO水合活性是游离b CA的1.05倍,k/K值是游离b CA的1.74倍,40℃下的半衰期是游离b CA的3.83倍。之后通过分析b CA-F表面电荷分布情况以及蛋白间疏水相互作用,探究mCASPs形成的机理,利用超声法实现了mCASPs到n CAOPs的快速转化。其次,在证明Ferritin触发目标酶形成超粒子方法可行性后,将其用于融合表达在极端嗜热微生物Sulfurihydrogenibium azorense中分离出的迄今为止发现催化活力最高的碳酸酐酶Saz CA,将得到的Saz CA碳酸酐酶超粒子（mCASPs）通过溶胶-凝胶法封装固定在Si O颗粒中,再将Si O固定化CA颗粒分散在环氧树脂涂料中,最后将该涂料涂覆在金属表面便得到了一种具有CA活性的环氧树脂涂层。通过SEM-Mapping,FTIR和TGA表征,证明了CA成功负载到了该涂层中,涂层的CA负载量可以达到0.15 mg/cm,CA比活力达到0.176 WAU/cm。该CA涂层具有优异的稳定性,在30℃孵育28天后还具有90%以上的剩余活力,60℃孵育28天后还具有67%的剩余活力。该CA涂层同时还具有较好的重复使用性,在28天的时间内循环使用6次后还具有60%的剩余活力。之后还将该CA涂层用于小球藻的培养,经过7天培养,加装该CA涂层装置的小球藻生物量比空白对照组增加了40%。由于具有产量高、纯化和固定化简单、易于扩大生产规模以及优良的酶学性质等特点,mCASPs和n CAOPs可以有效降低酶法捕集CO的成本。此外,制备mCASPs和n CAOPs整个过程是简单且绿色的。因此,这作为一种生态友好技术为实现碳中和的目标提供了参考。而将mCASPs作为游离酶,利用溶胶-凝胶法制备的CA涂层,由于制备方法简单、生产价格便宜、可持续高效吸收CO,为CA用于工业碳捕获和再利用,特别是将CA用于养殖微藻来捕集CO,提供了一种可行的方案。

关键词：碳酸酐酶铁蛋白无载体固定化超粒子 CO2捕获酶涂层

LPMOs及新型辅助蛋白协同水解地衣多糖及其作用机制

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LPMOs及新型辅助蛋白协同水解地衣多糖及其作用机制

作者：周蕊华侨大学

学位级别：硕士

可再生生物质能源为维持全球碳循环平衡、减缓全球变暖做出了重大贡献,符合可持续发展理念。生物质原料包括纤维素、半纤维素和木质素等。其中,利用可生物降解的多糖原料(如纤维素、地衣多糖、木葡聚糖、木聚糖、葡甘聚糖等)具有重大价... 详细信息

可再生生物质能源为维持全球碳循环平衡、减缓全球变暖做出了重大贡献,符合可持续发展理念。生物质原料包括纤维素、半纤维素和木质素等。其中,利用可生物降解的多糖原料(如纤维素、地衣多糖、木葡聚糖、木聚糖、葡甘聚糖等)具有重大价值。糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GHs),如纤维素酶、木聚糖酶、地衣多糖酶等,通过内/外切水解糖苷键将可生物降解的多糖水解成单糖、寡糖或它们的复合物,进而生产生物燃料。但由于多糖结构复杂,单一酶往往无法实现完全转化,寻找解决方案以实现多糖完全水解至关重要。为此,本论文开展了以下研究:首先,利用氧化裂解多糖之间糖苷键的溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMOs)与地衣多糖酶协同以实现多糖底物的完全水解。在大肠杆菌中成功表达了来源于细菌Micromonospora aurantiaca的LPMOs(Ma AA10),结果证明Ma AA10本身不会水解地衣多糖,而与地衣多糖酶发生协同作用时,还原糖含量增加了1.11倍。此外,Ma AA10发挥协同作用无需加入外源电子供体。同时,分步反应,即Ma AA10先预处理底物,再加入地衣多糖酶水解底物,可显著提高水解能力;与同步反应相比,相对还原糖量增加了48.8%。其次,Ma AA10与地衣多糖酶在40 h仍具有协同作用,且单酶和双酶的还原糖量分别为0.4 mg和0.512 mg,此时的双酶底物转化率为14.68%。最后,通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)再次证实了协同作用,即单酶和双酶的峰面积分别是48614和52018,且Ma AA10并未改变地衣多糖酶的内源水解模式,而是通过氧化裂解破坏多糖长链,以释放更多还原端,从而提高水解效率。其次,构建了一种新型辅助蛋白SCE,即类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide,ELPs)和Spy Catcher的嵌合体,实现了在大肠杆菌中的过量表达,并显著提高了地衣多糖酶的水解效率。当SCE蛋白只与地衣多糖反应时,并没有观察到还原糖含量的增加,但随着地衣多糖酶的加入,相对还原糖量增长了52%。此外,SCE蛋白与地衣多糖酶的协同体系对可溶性底物的酶活较高,但对不溶性底物的水解促进效果更好(比可溶性底物高约15%),说明在此协同体系中,地衣多糖酶的水解作用占主要地位,且SCE更倾向于促进不溶性底物的水解,这一特性与碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)类似。此外,与同步反应相比,分步反应的相对还原糖量增加了19%。SCE与地衣多糖酶在8 h协同作用效果最佳,且单酶和双酶的还原糖量分别为0.100 mg和0.223mg,此时的双酶底物转化率为6.22%。同时,通过生物信息学分析,亲和凝胶电泳和色氨酸荧光发射试验证实了SCE蛋白可以与地衣多糖底物结合。基于此,提出了SCE蛋白与底物及酶的可能作用机制。最后通过HPLC再次验证了协同效果,即单酶和双酶的峰面积分别是20362和38584,且SCE并未改变地衣多糖酶的内源水解模式,而是通过与底物结合,促使底物更接近地衣酶的催化结构域,从而提高它们的水解效率。与LPMOs相比,SCE蛋白更易制备,无需外源电子供体,促进效果更好,耗时短且过程稳定,因此在生物燃料和生物炼制中具有巨大的应用潜力。本研究成功构建并优化了两个地衣多糖酶协同体系(Ma AA10/Bgl SE和SCE/Bgl SE),分析了二者的水解模式,最后借助生物信息学分析和实验验证了SCE的作用机制,后者作为一种全新的协同体系,在生物炼制及生物燃料的生产中更具潜力,可为实现生物质的完全降解提供新思路。

关键词：地衣多糖酶溶解性多糖单加氧酶碳水化合物结合模块协同水解生物质降解

巴中—通南巴地区千佛崖组凝析油气成藏条件研究

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巴中—通南巴地区千佛崖组凝析油气成藏条件研究

作者：刘兴龙中国石油大学（北京）

学位级别：硕士

随着油气资源日益紧张,凝析油气勘探近年来越来越受到各国的重视,凝析油作为一种重要的油气资源,一直备受关注。本文通过对四川盆地巴中-通南巴地区烃源岩地化特征及分布情况的研究,利用岩石铸体薄片和SEM等分析储层特征,明确了研究区... 详细信息

随着油气资源日益紧张,凝析油气勘探近年来越来越受到各国的重视,凝析油作为一种重要的油气资源,一直备受关注。本文通过对四川盆地巴中-通南巴地区烃源岩地化特征及分布情况的研究,利用岩石铸体薄片和SEM等分析储层特征,明确了研究区油气富集主控因素。研究表明:巴中-通南巴地区烃源岩有机质丰度较低,有机质类型以Ⅱ型为主,热演化成熟度处于高成熟阶段,以湿气为主,暗色泥岩具有单层薄,连续性差的特点,属于差的烃源岩;储集层以长石砂岩和岩屑长石砂岩为主,储层物性差,属于特低孔、特低渗储集层,主要的成岩作用有压实作用、粘土包膜、早期钙质连晶式胶结和晚期钙质充填孔隙式胶结及交代作用、硅质充填孔隙式胶结和溶蚀作用,整体溶蚀作用不发育,微孔也很少发育;油气为自生自储的岩性和裂缝型油气藏,烃源岩主要是千佛崖组一段和二段泥岩,输导体系主要是中-晚侏罗世产生的挤压断层和剪切成因的中-高角度裂缝;凝析油的有利分布区主要有两部分:元陆172井、元陆176井、元陆177井、元陆16井和元陆4井以南的地区以及元坝9井附近,具有一定的勘探潜力。

关键词：成藏条件凝析油千佛崖组巴中-通南巴

不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集体特性及其间歇反应器中动力学研究

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不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集体特性及其间歇反应器中动力学研究

作者：李存存华侨大学

学位级别：硕士

本课题设计了一种新型类弹性蛋白多肽ELP（s即ELP[KV8F-20]）纯化标签，在可逆热循环（Inverse thermal cycling，ITC）纯化ELPs-木聚糖酶酶过程中发现很大一部分ELPs-木聚糖酶重组蛋白（约为75%）相变过程不可逆，即温度低于相变温度... 详细信息

本课题设计了一种新型类弹性蛋白多肽ELP（s即ELP[KV8F-20]）纯化标签，在可逆热循环（Inverse thermal cycling，ITC）纯化ELPs-木聚糖酶酶过程中发现很大一部分ELPs-木聚糖酶重组蛋白（约为75%）相变过程不可逆，即温度低于相变温度时，相变后的ELPs-木聚糖酶重组蛋白不可溶，测的其酶活力占总酶活力的92%，活力很高，类似于木聚糖酶被固定在相变的ELPs聚集体上，因而具有重要的研究意义。首先，考察了不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集体（Insoluble active ELPs-xylanaseaggregrates，IAEXA）的酶学性质，结果表明IAEXA的最适反应pH为6.0，与自由酶的最适反应pH相同，但是其最适pH范围是5～7，而自由木聚糖酶为6～7。自由木聚糖酶的最适反应温度为50℃，而IAEXA升高至70℃。自由木聚糖酶和IAEXA的Km分别为0.374g L-1和0.980g L-1，说明与自由酶相比，IAEXA与底物的亲和力降低，但是其pH稳定性、热稳定性及储存稳定性有了巨大提高。这种具有较高酶活力和稳定性的不溶木聚糖酶颗粒可以作为固定化酶应用于工业生产。其次，把IAEXA作为固定化酶，考察了其间歇酶反应器中的动力学性质，并对整个过程进行了优化。结果获得动力学常数Km=2.50g L-1，Vmax=2.64×10-4mol L-1min-1，最大反应速率常数K+2=0.475min-1;水解反应不存在底物抑制现象，而存在产物抑制现象，产物抑制常数Kp=0.09g L-1;对整个过程优化后得到：对每一个确定的DH，目标函数的取值仅与酶浓度和初始底物浓度有关，理论上酶用量越高越好，但在实际生产中，需要综合考虑加酶成本和水解时间内的操作成本两项内容，从而优化出最适加酶量。同时通过不同水解度下h（S0）对S0曲线图可获得最优底物浓度。最后，考察了IAEXA在不同盐和缓冲液条件下的稳定性，结果表明该聚集体在不同盐和缓冲液条件下均比较稳定，活力保持在78.01～97.32%。其中经过0.8mol L-1Na2CO3相变后获得的IAEXA在醋酸-醋酸盐缓冲液中稳定性最好，不溶部分酶活力占97.32%。然后对IAEXA进行了超声波及超高压匀质处理，结果显示IAEXA几乎都转变为可溶状态。其中1000bar高压匀质处理的体系最稳定，粒径最小。红外光谱分析表明IAEXA中含有有β-折叠、无规则卷曲和α-螺旋结构，说明ELPs与木聚糖酶之间的次级键作用（如氢键、盐键及范德华力等）可能是形成IAEXA的原因。

关键词：类弹性蛋白木聚糖酶活性蛋白聚集体固定化酶反应器

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共价寡聚酶催化性能及环化酶复性的研究

共价寡聚酶催化性能及环化酶复性的研究

作者：吴姝羽华侨大学

学位级别：硕士

寡聚化结构域Foldon介导的目标酶寡聚化可以提高酶催化性能,同时也能提高类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELP)分离纯化目标酶的得率,是一种简单易行的酶性能改造方法。但Foldon间非共价键的结合在高温下易解聚,影响目标酶催... 详细信息

寡聚化结构域Foldon介导的目标酶寡聚化可以提高酶催化性能,同时也能提高类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELP)分离纯化目标酶的得率,是一种简单易行的酶性能改造方法。但Foldon间非共价键的结合在高温下易解聚,影响目标酶催化性能的提升。为此,本课题通过在Foldon中适当位置引入Cys,通过多肽链间的二硫键连接提高其在高温下的稳定性,以拓展Foldon在嗜热酶催化性能提升中的应用。其次,为了探索蛋白质复性的新方法,对环化酶在不同变性条件下的复性效率进行了研究。得到如下研究结果:(1)通过对Foldon结构分析,将其第8位精氨酸和第18位甘氨酸全部替换为半胱氨酸,构建了基于共价键连接的寡聚化ELP-Foldon(E-Fm),经实验证明E-Fm单体之间能成功形成二硫键。随后构建了线性地衣多糖酶(B-E,该酶为常温酶)、非共价寡聚地衣多糖酶(B-E-F)和共价寡聚地衣多糖酶(B-E-Fm)并进行分离纯化,其最适反应温度均为45℃;最适反应pH为7.0;其中B-E-F在40℃开始发生解聚,B-E-Fm则在70℃才开始发生解聚;其动力学研究表明,在55℃以下,B-E-F和B-E-Fm催化效率明显优于B-E,并且B-E-Fm催化效率最高,在60℃时由于酶活力损失严重,不同拓扑结构地衣多糖酶催化效率均明显下降。(2)为了进一步考察共价连接的Foldon对嗜热酶的催化性能提升效果,选用GH11家族的嗜热木聚糖酶X11A进行研究,成功构建了线性木聚糖酶(X11A-E)、非共价寡聚木聚糖酶(X11A-E-F)和共价寡聚木聚糖酶(X11A-E-Fm)并进行分离纯化。研究得出X11A-E最适反应温度为60℃,X11A-E-F和X11A-E-Fm最适反应温度为55℃;最适反应pH均为7.0;其动力学研究表明,X11A-E-F在温度达到60℃时,催化效率与X11A-E趋于一致。然而,X11A-E-Fm在60-65℃依然能保持相比于X11A-E更高的催化效率。结果证明,共价连接的Foldon能使嗜热酶在高温下的催化效率得到提高。(3)此外,通过对不同变性条件下线性地衣多糖酶(B-E)和环化地衣多糖酶(cB-E)的研究发现,随着有机溶剂极性的增加,酶活力损失越严重。其中,甲醇、苯甲醇、丙酮和1 mol/L HCl能使B-E和cB-E在短时间内变性失活;乙腈、乙醇、正丁醇和乙二醇对酶活力分别有不同程度的影响;异丙醇对酶活力几乎没有影响,1 h后还能保持90%以上的酶活力。复性结果分析可得,经甲醇变性后B-E和cB-E都无法复性,而乙醇、乙腈、异丙醇和正丁醇变性后B-E和c B-E都能复性。有趣的是经苯甲醇、丙酮和1 mol/L HCl变性后,B-E无法复性,而c B-E却能在10 min之内迅速恢复80%以上的酶活力。上述研究证实,经合理设计所得共价连接的Foldon通过寡聚化实现了嗜热酶催化性能的提高,在嗜热酶活性改造领域具有应用潜力。此外,通过对蛋白质进行环化设计,有望建立一个全新的、通用的变性蛋白质复性方法,为蛋白质复性提供新思路。

关键词： Foldon SpyTag/SpyCatcher 类弹性蛋白多肽催化效率蛋白质复性

不同拓扑结构类弹性蛋白多肽相变特性及机理研究

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不同拓扑结构类弹性蛋白多肽相变特性及机理研究

作者：张丹丹华侨大学

学位级别：硕士

类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,简称:ELPs)是一种具有弹性功能且对环境温度敏感的生物大分子。将ELP40分别与SpyTag/SpyCatcher和Foldon进行融合,成功构建了不同拓扑结构的ELPs。这些拓扑结构各异的ELPs极大丰富了传统线性E... 详细信息

类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,简称:ELPs)是一种具有弹性功能且对环境温度敏感的生物大分子。将ELP40分别与SpyTag/SpyCatcher和Foldon进行融合,成功构建了不同拓扑结构的ELPs。这些拓扑结构各异的ELPs极大丰富了传统线性ELPs的结构形式,在拓展其应用领域方面具有重要意义。首先,通过SpyTag/SpyCatcher构建了不同拓扑结构的ELP40,考察了盐的类型及浓度对其相变特性的影响,并与线性ELPs进行比较。结果表明,不同盐浓度和类型下,不同拓扑结构ELP40的相变温度比相同重复数的线性ELPs平均高1-10.9℃。其中,共价三臂星型ELP40在0.05 mol/LNa2CO3溶液中与线性ELP120相差最大,达到11.5℃。同时,随着盐浓度的逐渐增加,相变温度均呈线性递减。然而,SpyCatcher-ELP40只有在高浓度(≥0.5 mol/L)Na2CO3溶液中才发生相变,且相变温度骤降为7.3℃,这一现象不符合Hofmeister离子序。其可能的原因与ELPs所融合的SpyCatcher分子表面分布了大量带电荷的氨基酸有关,并探讨了其作用机制。其次,将Foldon分别与SpyCatcher-ELP40和ELP40进行融合,构建了拓扑结构为非共价三臂星型的three-armed star C-E-F和three-armed star E-F,考察了不同盐浓度和类型对其相变特性的影响,并与不同拓扑结构的ELPs进行比较。研究结果发现:融合Foldon的ELP40的相变温度降低;而融合Foldon的SpyCatcher-ELP40的相变温度先升高后降低。同时,Na2CO3浓度在0.7 mol/L及以上时,three-armed star C-E-F才会在低温下有相变现象的发生;Foldon的加入会使three-armed star C-E-F的相变温度在Na2CO3更高浓度才会出现,这主要与Foldon和SpyCatcher的可及表面电荷数有关。最后,通过SpyTag/SpyCatcher将ELP40设计成蝌蚪型结构,表达和ITC纯化后获得的tadpole-like ELP40在TEV蛋白酶切位点经TEV蛋白酶酶切,再通过SDS-PAGE和MOTIF/TOF质谱分析来验证蝌蚪型结构的成功形成。研究不同盐类型、浓度对tadpole-like ELP40相变特性的影响,并将其与不同拓扑结构的ELPs进行比较,结果发现tadpole-like ELP40的相变温度比相应ELP80高。探究了Hofmeister离子序中的阴离子和阳离子对tadpole-like ELP40相变温度的影响,结果表明阴离子对tadpole-like ELP40相变温度的影响符合Hofmeister离子序,而阳离子发生了逆Hofmeister离子序现象。另外,在不同盐溶液中对tadpole-like ELP40的粒径进行分析,平均粒径在0.6μm-2μm之间,处于微米级别,在应用方面具有重要意义。

关键词：类弹性蛋白多肽 SpyTag/SpyCatcher Foldon Hofmeister离子序相变温度

基于结构认知和分子模拟探究β-琼胶酶的热稳定性机制

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基于结构认知和分子模拟探究β-琼胶酶的热稳定性机制

作者：楚云猛华侨大学

学位级别：硕士

酶具有高底物选择特异性和高催化效率的特点,使其作为天然的生物催化剂,在工业中具有很好的应用潜力和发展前景。然而,天然酶的热不稳定性,限制了酶在工业领域中的应用。因此,了解酶的热稳定性机制,并指导酶的设计改造以提高酶的耐热行... 详细信息

酶具有高底物选择特异性和高催化效率的特点,使其作为天然的生物催化剂,在工业中具有很好的应用潜力和发展前景。然而,天然酶的热不稳定性,限制了酶在工业领域中的应用。因此,了解酶的热稳定性机制,并指导酶的设计改造以提高酶的耐热行,一直都是酶学研究中的难点。研究酶的热稳定性机制,不仅能够加深和巩固对酶的结构和功能的关系认识和了解,还能够促进酶在工业生产中的应用和发展。本文首先从统计学的角度,通过模式识别的算法对酶的结构和功能有一个认知,再利用分子动力学模拟的方法从微观层次和动态水平来探究β-琼胶酶的热稳定性影响因素。本文首先采用基于十倍交叉验证的支持向量机回归机器学习法,分别对基于β-琼胶酶一级序列信息和结构的关系,分析β-琼胶酶的热稳定性影响因素。根据分段氨基酸组成与酶最适温度的回归结果可知,β-琼胶酶M段和N端中的氨基酸组成对酶的热稳定性影响较大,同时构建了β-琼胶酶最适温度预测模型;另外,采用了氨基酸相对溶液可及性与β-琼胶酶的最适温度进行回归分析,结果显示,在相对溶液可及性内部区域中带电荷氨基酸与酶的最适温度关系紧密,同时根据嗜热酶和嗜温酶T检验中的显著差异参数构建温度预测模型。用本实验室的3个琼胶酶相关参数代入模型中,预测该酶的最适温度,并与实验测定的温度进行比较。基于分段氨基酸组成的预测模型中,预测温度与实验温度的误差基本在±5℃范围以内;基于相对溶液可及性中,3个酶的预测温度和实验温度的绝对误差分别为2.2℃,2.6℃和0.1℃,进一步说明了该模型预测β-琼胶酶最适温度的可靠性高。然后用分子动力学模拟的方法在原子的微观层次和动态水平,来探究β-琼胶酶存在的耐热性机制。从已有的β-琼胶酶的晶体中挑选出嗜温酶1URX和嗜热酶3WZ1,设置不同的模拟温度,分别进行分子动力学模拟,获得模拟结果的轨迹文件并对轨迹文件进行分析,获得这两个酶在不同模拟温度下的构象动态变化、氨基酸的波动变化以及形成盐桥和氢键的数量变化等结果,即可以得知对β-琼胶酶热稳定性影响的主要因素并寻找出其热敏感区域。如3WZ1中的α螺旋,氨基酸Ala2,Gly83,Ser245和Ile277;1URX中的氨基酸Ser36等;另外,获得了一些在酶中表现出较好耐热性的盐桥,且盐桥的数量和类别也对β-琼胶酶的热稳定性也有显著的影响。研究结果将有助于更好的理解β-琼胶酶的热稳定性机制以及结构与功能的关系,同时为β-琼胶酶的设计改造奠定基础和提供指导。

关键词： β-琼胶酶结构认知分子动力学模拟热稳定性