检索结果-南通市图书馆

作者：张楠山东财经大学

学位级别：硕士

网络空间是现实社会的延伸,是亿万民众共同的精神家园。网络给我们的生活提供了便利,但随着网络社会的发展,因“网络暴力”造成他人自杀死亡的事件越来越多,如“2022年刘学州事件”、“粉色头发女孩事件”、“德阳女医生案”等,无不显... 详细信息

网络空间是现实社会的延伸,是亿万民众共同的精神家园。网络给我们的生活提供了便利,但随着网络社会的发展,因“网络暴力”造成他人自杀死亡的事件越来越多,如“2022年刘学州事件”、“粉色头发女孩事件”、“德阳女医生案”等,无不显示出网络暴力致命的危害性,对于网络暴力施加更严厉之刑罚的群众呼声亦愈来愈高。而我国目前对于“网络暴力致人自杀”行为的规制仍存在以民法、行政法为主,刑法规制乏力等问题,这也是“网络暴力致人自杀”行为难以遏制的原因之一。在刑法上,虽然对“网络暴力致人自杀”行为有侮辱罪、诽谤罪、侵犯公民个人信息罪、寻衅滋事罪等罪名可以规制,但对此类案件作出有罪判决的比例极低。以诽谤刑事案件为例,在2023年审结的网络诽谤刑事案件中,不予受理、驳回起诉和撤诉的达到81.43%,作出判决的仅占13.46%,其中有罪判决仅占7.32%。可见,入罪标准高、处罚程度低、维权之路难等现状导致“网络暴力致人自杀”行为难以有效治理。在此背景下,本文从学理分析的角度,运用案例分析及比较分析等方法,厘清“网络暴力致人自杀”行为刑事治理过程中存在的问题,结合我国实际情况,探索“网络暴力致人自杀”行为刑事规制的具体路径。全文除绪论外,共分为四个部分:第一部分,从“网络暴力”的概念展开,分析“网络暴力”的类型及特点,进而对“网络暴力致人自杀行为”的概念进行界定,并分析该行为造成的严重恶劣影响,最后对“网络暴力致人自杀”行为原因进行分析,为下文完善“网络暴力致人自杀”行为的刑法规制确定立论基础。第二部分,通过整理不同类型的网络暴力热点案件,梳理分析出国内关于“网络暴力致人自杀行为”法律治理存在“民事赔偿、行政治理为主,刑事规制乏力”等缺陷,并整理一些具有代表性的域外国家关于治理“网络暴力致人自杀行为”的优秀经验,为下文提出规制“网络暴力致人自杀”行为具体意见提供借鉴。第三部分,通过对前述案例的分析以及相关理论研究的梳理,总结整理出对“网络暴力致人自杀”行为进行规制过程中存在的几个争议焦点:“网络暴力是否为实行行为”、“网络暴力与自杀死亡之间是否存在因果关系”、“网络暴力致人自杀行为构成什么犯罪”、“网络暴力致人自杀行为的责任主体如何确认”。通过廓清“网络暴力致人自杀”行为刑法规制过程中存在的难题和障碍,为下文有针对性地解决司法认定争议问题确立方向。第四部分,通过借鉴域外国家相关优秀治理经验,结合我国国情,针对司法实践中存在的规制难题提出以下建议:明确“网络暴力致人自杀”行为定罪的基础理论问题、将“网络暴力致人自杀”行为分类定罪、完善网络暴力相关司法解释以及明确“网络暴力致人自杀”行为不同主体的责任等具体规制路径,以期为遏制网络暴力致人自杀死亡现象提供一定的理论支持和实践对策。网络社会瞬息万变,遏制“网络暴力”现象并非仅靠完善刑事规制就能实现,必须结合其他的社会治理手段综合治理、不断探索,网络暴力致人自杀行为的治理之路任重而道远。

关键词：网络暴力致人自杀因果关系分类定罪刑法规制

滥用职权罪“造成恶劣社会影响”认定问题研究

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滥用职权罪“造成恶劣社会影响”认定问题研究

作者：张锐展山东财经大学

学位级别：硕士

反腐倡廉是党风廉政建设的行动纲领,也是维护社会公平正义和促进社会和谐的重要任务,习近平总书记不断强调要把权力关进制度的笼子里,滥用职权罪作为反腐倡廉打击的重要犯罪之一,近年来呈现出高危高发的态势。由于案件本身隐蔽性强、犯... 详细信息

反腐倡廉是党风廉政建设的行动纲领,也是维护社会公平正义和促进社会和谐的重要任务,习近平总书记不断强调要把权力关进制度的笼子里,滥用职权罪作为反腐倡廉打击的重要犯罪之一,近年来呈现出高危高发的态势。由于案件本身隐蔽性强、犯罪领域涉及广、危害结果发生存在一定的滞后性等原因,滥用职权罪难以查处的问题始终存在,该犯罪得不到有效处置会损害党和政府的威信、威胁社会安定和进步。“造成恶劣社会影响”是滥用职权罪的定罪条件之一,作为非物质性损害,与物质性损害相互补充,给予了司法工作人员一定的自由裁量空间,但是由于其自身的抽象性、隐蔽性等特点,导致在司法实践中认定较为困难,甚至各地法院间认定标准不一致、法院与检察院间意见分歧,同案不同判等现象不断出现。基于此,本文通过案例分析法与比较研究法,针对滥用职权罪“造成恶劣社会影响”问题展开研究,研读与参考了滥用职权罪有关的文献以及对“造成恶劣社会影响”认定相关的研究成果,对典型案例进行分析,以期解决认定标准不统一等问题。首先,本文论述了滥用职权罪“造成恶劣社会影响”的内涵与特征,在滥用职权罪犯罪构成中的作用、与其他物质损害之间的关系以及实践中常见的类型,通过对“造成恶劣社会影响”的内涵、特征及作用等基础问题进行分析,为后续研究的展开确定基本前提。其次,梳理了“造成恶劣社会影响”认定中存在的因果关系把握不明、适用标准模糊使得案件定罪占比低、认定过程中释法说理不充分、认定过程易受外界影响、认定主体存在争议、定罪量刑司法尺度不统一等问题,结合“造成恶劣社会影响”本身多样性、抽象性和难以量化评价的特点,分析上述问题存在的原因,为下文提出行之有效的对策奠定基础。再次,笔者将“造成恶劣社会影响”拆分为“造成”“社会”和“恶劣影响”三个部分,对刑法中的“社会影响”进行界定。对于社会影响的判断,应当遵循刑法明确性原则的要求,把握犯罪常态的界限,综合考虑影响的程度、范围及现实作用,在此基础上进行规范界定。然后在比较分析相关因果关系理论的基础上,确定以客观归责理论作为“造成恶劣社会影响”的分析思路,并对“造成恶劣社会影响”的因果关系进行了分析,提出在判断滥用职权行为和危害结果的因果关系时应当遵循的方法。最后,针对“造成恶劣社会影响”认定中存在的问题,提出具体的对策建议。对于认定主体与认定过程中存在的问题,可以通过借助社会力量进行认定、引入民意调查机制和发布指导性案例、加强认定过程中释法说理的力度等方法,拓宽认定渠道。在此基础上,针对恶劣社会影响的不同类型构建具体的量化指标,包括信访等群众性事件、引发媒体报道、引发危险状态、引发刑事犯罪、损害司法公正等,在每种情形中确定何种程度可以认定为“造成恶劣社会影响”,统一判断标准,从而解决认定难的问题,确保更加有力地打击滥用职权犯罪。

关键词：滥用职权造成恶劣社会影响司法认定

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我国刑罚附随后果研究

我国刑罚附随后果研究

作者：王玉妍山东财经大学

学位级别：硕士

刑罚附随后果作为对犯罪前科人员在刑罚之外的一系列限制,在社会上广泛存在,虽然在一定程度上起到了预防其再次犯罪的作用,但同时也在很多方面限制和阻碍其回归社会,可能又会将他们再次推向犯罪的道路,犯罪预防功能难以实现,形成恶性循... 详细信息

刑罚附随后果作为对犯罪前科人员在刑罚之外的一系列限制,在社会上广泛存在,虽然在一定程度上起到了预防其再次犯罪的作用,但同时也在很多方面限制和阻碍其回归社会,可能又会将他们再次推向犯罪的道路,犯罪预防功能难以实现,形成恶性循环。作为犯罪预防体系中的一环,刑罚附随后果制度的核心价值应当体现在:帮助缩小犯罪人与非犯罪人之间的鸿沟,以更合理、更人性的方式进行社会预防,尽可能地接纳受过刑罚之人复归社会,避免“标签效应”对犯罪人的反作用。为此,有必要转变理念,完善刑罚附随后果的体系架构,合理设置附随后果适用规范,完善相关程序性规定,探索实施个性化的前科消灭制度,真正实现刑罚附随后果所被赋予的价值期待。论文整体的写作思路:在界定我国刑罚附随后果概念的基础上,分析刑罚附随后果制度的现状,剖析了目前规定存在的不足之处,并参考借鉴国外对于刑罚附随后果的资格刑立法模式经验,提出附随后果可以纳入资格刑的建议,推动我国从现有的类行政处罚模式到资格刑模式的转变,最后,从具体的五个方面对我国刑罚附随后果的规定提出完善建议,其中创新性地将刑罚附随后果同前科消灭制度相结合,以期为解决我国刑罚附随后果存在的问题贡献绵薄之力。论文主要采用了案例分析、实证研究、比较研究等研究方法。除绪论外,论文主体分为四个部分。第一部分对刑罚附随后果进行基本界定,通过辨析与之相关的“犯罪附随后果”“犯罪行为的附随法律责任”等相关概念,分析总结其具有的特点,如适用主体同时涉及自然人和单位、适用上的刑事关联性、具体内容非刑事性与后果的严厉性。分析了我国四种关于附随后果性质的学说:保安处分说、资格刑说、从刑说、行政处罚说,分析了各个学说的合理性与不合理性,并提出了当前我国刑罚附随后果应定性为类行政处罚的观点。第二部分分析我国现有的刑罚附随后果制度存在的不足之处。一是刑罚附随后果内容非常庞杂,分布在各层级的法律规范之中,内容分散,且体系化不足,许多类似规定在各个地方之间还存在着不一致之处;二是由于我国刑罚附随后果内容的设置缺乏系统化,限制性条款内部缺乏一定的逻辑关联性与针对性,一些不严谨的概念用语也造成了附随后果适用的不便;三是某些刑罚附随后果没有明确的内容、期限等规定,其立法设置的随意性导致了附随后果的程度过于严厉,甚至超过了刑罚本身的严厉性,违背合理性原则;四是刑罚附随后果本身缺乏程序性、救济性规定,在其实施中忽略了配套法律体系的重要性,难以实现真正的公平正义。第三部分着眼于国内外刑罚附随后果两种立法模式,分析域外资格刑模式与我国类行政处罚模式的内涵、种类、地位以及适用等。通过横向综合比较,探寻国内外刑罚附随后果立法模式中的优缺点,借鉴国外优秀经验,改进我国的立法模式,建议将刑罚附随后果统一纳入资格刑。第四部分基于前述研究,对我国刑罚附随后果现存的问题提出解决之道。在思想方面,应当转变理念:附随后果的内容设置应当契合宪法精神,同时借鉴新社会防卫论思想,树立行为人复归社会为主的新理念,从整体上缓和附随后果的严厉程度。在制度方面,提高刑罚附随后果的位阶,限制制定主体,并系统化解决不同地方类似规定之间的矛盾,完善刑罚附随后果的体系架构。在内容方面,合理设置附随后果适用规范,使其在适用上更加具有关联性,对过失犯罪、轻微犯罪者以及某些特殊人员慎重适用,同时科学地设置限制期限。在程序方面,进一步完善相关程序性规定,通过赋予公安等部门监督制裁职能、明确附随后果的可诉性,确保程序正义的实现。在相关制度方面,可以结合个性化的前科消灭制度以进一步减轻刑罚附随后果的不利影响。

关键词：刑罚附随后果资格刑职业禁止

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刑事追诉时效适用问题研究

刑事追诉时效适用问题研究

作者：韩志豪山东财经大学

学位级别：硕士

作为刑罚消灭制度之一,追诉时效制度充分体现了尊重人权、提高司法效率的基本理念,顺应了我国宽缓化的刑罚趋势,但由于我国一直存在着严厉打击犯罪的法律传统,导致追诉时效制度在理论和司法实践中并未引起过多重视。追诉时效制度对行为... 详细信息

作为刑罚消灭制度之一,追诉时效制度充分体现了尊重人权、提高司法效率的基本理念,顺应了我国宽缓化的刑罚趋势,但由于我国一直存在着严厉打击犯罪的法律传统,导致追诉时效制度在理论和司法实践中并未引起过多重视。追诉时效制度对行为人是否应被追诉、是否应受到刑罚处罚起到决定性作用,因现行规定过于简略、用语较为模糊、司法实务错综复杂等问题,导致现有规定并不能准确、完备的为司法机关提供明确指引,因此需进一步探讨研究、健全追诉时效体系。基于上述原因,本文运用规范分析法、案例分析法、比较研究法,以相关裁判文书为指引,归纳整理司法实践适用追诉时效存在的困境,探究追诉时效适用困境根源所在,针对追诉时效的适用困境提出解决建议,为追诉时效的司法适用提供理论支撑。除绪论外,正文分为四部分:第一部分为追诉时效基础理论。通过对比分析不同学者对追诉时效的定义,本文从求刑权的角度出发阐释追诉时效的含义,将刑事追诉时效与近似的概念,如诉讼时效、行刑时效等,对其中异同点进行辨析比较。在对追诉时效制度的法理基础进行探讨时,目前不同学说仅从不同方面对追诉时效的积极意义进行探讨,难以全面阐释追诉时效制度的正当性依据,对此本文认为追诉时效的正当性基础应当以人的可改造性为前提条件,以承认刑罚的有限性为客观事实进行探讨。追诉时效制度法律属性的判定方面,追诉时效制度的逻辑起点在于求刑权的存在,其实体意义大于程序意义,应当界定为实体法制度。第二部分为我国追诉时效的适用困境。通过查阅司法判例,发现追诉时效在司法适用中的问题与困境,例如追诉时效起算认定存在分歧、核准追诉之“追诉必要性”的适用存在争议。同时为应对社会发展带来的新情况,司法机关在对单位犯罪和监察机关适用追诉时效规定时存在一系列问题与障碍,需要对此问题予以回应。第三部分为追诉时效域外考察。从大陆法系和英美法系两方面着手,探究不同法律体系追诉时效制度各自的特点,开拓研究视野、拓展学术研究广度和深度,同时对不同法系国家的追诉制度进行评述,吸收他国研究成果和成功经验,立足我国实际完善追诉时效制度。第四部分针对前述追诉时效适用困境提出相应对策。首先,应当明确追诉时效起算节点,将“犯罪之日”以刑法修正案的方式修改为“犯罪完成之日”,同时将“犯罪行为终了之日”的表述修正为“危害结果确定之日”,以此避免司法机关裁判理解不一的问题。其次,应当释明核准追诉之“追诉必要性”的范围与标准,本文从“划定追诉必要性案件适用范围”和“综合确定追诉必要性的考量因素”两方面出发,对追诉必要性界定不明的难题提出解决路径。再次,应将单位犯罪与自然人犯罪区别适用追诉时效制度,以最高罚金刑确立单位犯罪的追诉期限。最后,监察机关进行职务活动应当适用追诉时效制度,同时对监察机关的适用路径提出建议。

关键词：追诉时效时效期限追诉必要性监察时效

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侵害人脸识别信息行为刑法规制研究

侵害人脸识别信息行为刑法规制研究

作者：张展悦山东财经大学

学位级别：硕士

信息时代背景下,技术创新衍生出大量新型人工智能技术,人脸识别技术作为其中应用范围最为广泛、应用价值最高的科学技术种类,受到社会各界的强烈关注。人脸识别技术自开发应用以来,便以极快的速度渗入社会公众日常生活的方方面面,改变... 详细信息

信息时代背景下,技术创新衍生出大量新型人工智能技术,人脸识别技术作为其中应用范围最为广泛、应用价值最高的科学技术种类,受到社会各界的强烈关注。人脸识别技术自开发应用以来,便以极快的速度渗入社会公众日常生活的方方面面,改变公民生活方式和出行习惯,为社会各主体的生产生活提供极大便利,然而随之而来的信息安全风险也同样不可小觑,对公民个人利益、社会秩序乃至国家安全都有着不同程度的影响,亟需国家从法律层面对人脸识别技术的具体应用行为加以规制。刑法作为法秩序体系中的重要内容,发挥着强大的保障功能和震慑作用,是保护人脸识别信息的有力手段。论文主要运用规范研究法、案例分析法和比较研究法等研究方法,分别从以下四个方面对我国侵害人脸识别信息行为刑法规制问题展开研究,以期为相关工作提供一定理论支撑。第一部分介绍选题背景和意义,并从多个角度综述当前理论界对相关选题的研究现状,为后文深入研究侵害人脸识别信息行为的刑法规制路径提供经验支撑。第二部分从研究对象—人脸识别信息入手,阐述人脸识别信息的概念特征,明确人脸识别信息的法律属性,认为人脸识别信息是法律层面定义的敏感个人信息之一,具有复合法益属性。在此基础上论述侵害人脸识别信息行为刑法规制的必要性,为下文进一步探讨侵害人脸识别信息行为刑法规制路径奠定理论基础。基于人脸识别技术自身应用风险和前置法保护缺陷,刑法有必要及时介入规制人脸识别信息犯罪,充分发挥刑法作为最后一道防线的保障作用。第三部分重点分析我国侵害人脸识别信息行为刑法规制的现状和目前需要解决的现实困境。我国对人脸识别信息保护尚未形成成熟完整的法律体系,当前司法实践中多以侵犯公民个人信息罪规制人脸识别信息犯罪,但这一司法适用明显缺乏法律依据,且本罪中现有的行为模式、入罪标准和量刑情节在具体评价人脸识别信息犯罪时均存在不合理之处。同时刑事司法实践中如何合理把握侵害人脸识别信息行为的罪与非罪、人脸识别信息犯罪同其他相关犯罪之间的罪数关系是理论界广泛讨论的议题,如何规范罚金刑的适用也亟需形成可行性对策。第四部分是本文的重点内容,分别从相关定罪量刑标准、侵害人脸识别信息行为的罪与非罪、与相关犯罪之间的罪数关系以及罚金刑适用四个方面全方位提出侵害人脸识别信息行为的刑法规制方式。根据人脸识别信息犯罪的行为性质和行为方式,构建以侵犯公民个人信息罪为主,以诈骗罪等财产类犯罪、计算机犯罪、网络犯罪等相关罪名为补充的刑法规制体系。通过修改司法解释明确刑法对人脸识别信息的保护依据符合经验逻辑和现实需求,根据人脸识别信息犯罪的行为性质扩充行为方式,针对人脸识别信息犯罪设置符合比例原则的入罪标准和量刑情节,以此完善侵犯公民个人信息罪构成要件。此外,提出准确把握侵害人脸识别信息行为的罪与非罪、理清人脸识别信息犯罪的罪数关系,通过设置统一的罚金刑量刑标准、借鉴域外经验提高罚金刑执行率完善罚金刑适用之规范性,从而全面强化刑法对人脸识别信息的保护功能。

关键词：人脸识别信息公民个人信息侵犯公民个人信息罪刑法保护

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刑事违法所得认定问题研究

刑事违法所得认定问题研究

作者：杜盈山东财经大学

学位级别：硕士

在坚持全面依法治国、不断推进法治中国建设的进程中,尊重和保障人权始终是刑事法治领域关注的重点话题。刑事司法中关于犯罪分子财产权保护的问题逐渐进入学者们的视野,从事实务的法官、律师也意识到了被告人财产权利保障的重要性。尤... 详细信息

在坚持全面依法治国、不断推进法治中国建设的进程中,尊重和保障人权始终是刑事法治领域关注的重点话题。刑事司法中关于犯罪分子财产权保护的问题逐渐进入学者们的视野,从事实务的法官、律师也意识到了被告人财产权利保障的重要性。尤其是涉及到刑事没收,司法实践中经常出现犯罪分子违法所得与合法财产相混淆,难以分清的情形,这导致犯罪分子的合法财产权受到极大威胁。因此,笔者围绕刑事没收的主要对象——违法所得的认定问题进行研究,以丰富我国关于违法所得认定问题的理论知识,进而为司法实践中的难题提供解决方案,以期能够充分保障犯罪分子的合法财产权。本文除绪论和结语外,一共分为四个部分,重点部分是厘清刑事违法所得投资收益的范围以及明确刑事违法所得数额的计算。第一部分是刑事违法所得的界定。本文是在刑法的语境中对违法所得进行研究,因此有必要对刑法中的违法所得进行详细界定。笔者从我国刑事法律规范中有关违法所得的规定出发,明确了“违法所得”的含义;在此基础上,将“违法所得”与容易混淆的“犯罪所得”、“赃款赃物”概念进行辨析,最后,将违法所得进行分类,更便于理解违法所得的内涵,为后续实践问题的解决提供理论根基。第二部分是刑事司法中违法所得认定之现状。首先,在司法解释层面对刑事违法所得认定的相关规定进行了分析与总结;其次,选取了司法实践中的代表性案例,得出目前违法所得认定的两大难题,分别是违法所得投资收益范围的认定以及违法所得数额的认定,为下文研究的展开奠定基础。第三部分是刑事违法所得投资收益的厘定。在对国内外关于违法所得投资收益的性质进行定位后,笔者认为可以从投资活动的类型判断、比例原则、先前犯罪行为的危害性大小以及没收对社会经济发展的影响四个方面来厘清违法所得投资收益的范围,为司法实践中该问题的解决提供一些具体的参考标准。第四部分是刑事违法所得数额的认定。在对目前国内外违法所得数额的三种主要计算方法即总额说、净额说以及相对总额说进行具体分析之后,笔者认为相对总额说更符合刑事违法所得制度的本质,值得提倡。关于共同犯罪违法所得数额的划分,在对国内外的学说与做法进行比较评析的基础上,确立了本文的观点,即当共犯之间的违法所得数额分配不明时,可以以各共犯在具体案件中的地位、作用、犯罪情节、犯罪手段等量刑因素为评价标准划分违法所得的数额。

关键词：违法所得投资收益犯罪所得共同犯罪

舒伯特《即兴曲Op.142No.3》的创作特征与演奏诠释

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舒伯特《即兴曲Op.142No.3》的创作特征与演奏诠释

作者：孙欣悦哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

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歌剧选段《爱永在》演唱处理探究

歌剧选段《爱永在》演唱处理探究

作者：张国力河北大学

学位级别：硕士

大型民族歌剧《沂蒙山》是新时代红色经典的史诗级歌剧,《爱永在》是其中承上启下的选段。本文通过对作品背景、曲式以及歌词特点进行概述,重点分析了《爱永在》的演唱技巧与演唱情感。文章从气息、咬字及共鸣等角度对该作品的演唱技巧... 详细信息

大型民族歌剧《沂蒙山》是新时代红色经典的史诗级歌剧,《爱永在》是其中承上启下的选段。本文通过对作品背景、曲式以及歌词特点进行概述,重点分析了《爱永在》的演唱技巧与演唱情感。文章从气息、咬字及共鸣等角度对该作品的演唱技巧做出阐述,能够用正确的演唱技巧在舞台上表达歌曲;以歌曲表达的情感来划分不同的情绪从而进行演唱分析,以此来促进演唱者对作品的把握。综上所述,希望为今后演唱此类歌剧选段的作品做参考,为更多演唱此歌曲的音乐爱好者提供帮助。

关键词：爱永在演唱技术演唱情感

褪黑素经ROS/HIF-1α/GLUT1轴抑制肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化减轻脓毒症ARDS

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褪黑素经ROS/HIF-1α/GLUT1轴抑制肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化...

作者：郑莉安徽医科大学

学位级别：硕士

背景脓毒症相关急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床常见的急危重病,患者病死率高且预后较差,目前仍缺乏可靠有效的防治措施。褪黑素(melatonin,MEL)是一种内源性的神经胺类激素,因其具有较强的抗炎及... 详细信息

背景脓毒症相关急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床常见的急危重病,患者病死率高且预后较差,目前仍缺乏可靠有效的防治措施。褪黑素(melatonin,MEL)是一种内源性的神经胺类激素,因其具有较强的抗炎及免疫调节作用,在多项研究中已被证实可以有效减轻脓毒症引发的ARDS,但其调控机制尚不完全清楚。研究表明,肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMs)经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后引起细胞内NLRP3炎性小体活化,从而促进炎症因子释放,进一步加重肺内炎症反应的级联扩大,最终导致ARDS肺损伤的发生。此外,近年研究显示下调巨噬细胞糖酵解水平可以显著抑制NLRP3炎性小体活化,从而减轻炎症反应。因此,本研究旨在深入探讨MEL是否能通过调控肺泡巨噬细胞糖酵解水平抑制NLRP3炎性小体活化,从而减轻脓毒症ARDS,以期为ARDS的临床治疗寻求新的靶点并提供理论依据。方法本研究采用LPS刺激小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)模型及腹腔注射LPS构建小鼠ARDS动物模型;使用GLUT1抑制剂STF-31抑制细胞和组织GLUT1的表达;通过慢病毒转染实现MH-S细胞内GLUT1过表达;使用PX-478抑制细胞低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达;使用DMOG促进细胞和组织HIF-1α的表达;使用ROS的供体-HO促进细胞ROS的生成;使用4-P-PDOT、Luzindole抑制细胞褪黑素2型受体(melatonin receptor 1B,MT2)的表达;运用小干扰RNA技术抑制细胞褪黑素1型受体(melatonin receptor 1A,MT1)的表达;使用western blot检测MT1、HIF-1α、GLUT1、NLRP3、pro IL-1β、mature IL-1β及cleaved caspase-1的蛋白水平;使用免疫组化检测小鼠肺组织中GLUT1的表达情况;使用ELISA试剂盒检测细胞培养基及小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中IL-1β的含量;使用乳酸(LA)检测试剂盒测定细胞培养基及血清中乳酸的水平;使用葡萄糖(Glu)检测试剂盒测定培养基及血清中葡萄糖含量,以评估细胞和组织对葡萄糖的摄取功能;并使用2-NBDG荧光标记法检测肺泡巨噬细胞对葡萄糖的转运功能;荧光显微镜下评估肺泡巨噬细胞ROS的水平;组织病理学检测评估肺组织损伤情况。结果我们发现,在LPS刺激的MH-S细胞中,MEL与STF-31均可显著抑制GLUT1、NLRP3、pro IL-1β、mature IL-1β、cleaved caspased-1的上调,并显著抑制LPS处理后MH-S细胞的乳酸释放及葡萄糖摄取;通过慢病毒转染实现MH-S细胞GLUT1的过表达后,MEL抑制上述指标上调的作用明显减弱。分别使用HIF-1α的抑制剂(PX-478)和激动剂(DMOG)进一步研究发现:MEL与PX-478均可抑制MH-S细胞HIF-1α、GLUT1、NLRP3、pro IL-1β、mature IL-1β、cleaved caspased-1的表达,并抑制LPS处理后MH-S细胞乳酸的释放及对葡萄糖的摄取,而DMOG预处理MH-S后,MEL对上述指标的调控作用明显减弱;HO预处理MH-S细胞可显著提高细胞ROS的水平,并抑制MEL对HIF-1α/GLUT1轴的调控作用,从而使MEL抑制肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体激活的作用减弱。有趣的是,我们发现MT2受体抑制剂的使用并不影响MEL对上述指标的调控作用,而通过小干扰RNA转染使MH-S细胞MT1表达下调后,MEL的这一保护作用减弱。此外,我们在腹腔注射LPS的小鼠模型中证实MEL可以明显改善LPS诱导的肺组织损伤并提高小鼠生存率。在动物水平分别使用GLUT1抑制剂STF-31及HIF-1α的激动剂DMOG,并检测小鼠组织标本中上述指标的改变。进一步在体内证实MEL可以通过调控HIF-1α/GLUT1通路抑制糖酵解水平从而抑制LPS诱导的肺组织NLRP3炎性小体活化,进而减轻LPS诱导的ARDS。结论MEL可以通过调控ROS/HIF-1α/GLUT1轴下调糖酵解水平,进而抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化,最终缓解脓毒症引发的ARDS。此外,我们还发现MEL通过ROS/HIF-1α/GLUT1轴抑制肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化的作用与其作用于MT1受体有关。该研究可为ARDS的防治提供新的实验基础及理论依据。

关键词：褪黑素急性呼吸窘迫综合征 GLUT1 NLRP3炎性小体 HIF-1α

骨髓间充质干细胞外泌体经糖酵解途径调控肺泡巨噬细胞极化减轻脓毒症相关ARDS

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骨髓间充质干细胞外泌体经糖酵解途径调控肺泡巨噬细胞极化减轻脓...

作者：胡松皖南医学院

学位级别：硕士

目的:探究骨髓间充质干细胞来源的外泌体(bone marrow mesenchymal stem cells derived exosome,BMSCs-exo)能否通过抑制糖酵解调控肺泡巨噬细胞极化从而减轻脓毒症相关急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)以及相关机制。方法:体外实验中,使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S细胞,观察不同时间点MH-S细胞M1/M2极化指标和糖酵解水平的变化。使用外泌体抑制剂GW4869预处理BMSCs,明确BMSCs是否通过分泌外泌体抑制MH-S细胞糖酵解及M1极化。通过超速离心结合外泌体试剂盒法提取BMSCs-exo,使用PKH26标记BMSCs-exo,观察其是否能够进入MH-S细胞发挥生物学功能。使用糖酵解抑制剂2-DG和糖酵解激动剂Glucose确定BMSCs-exo是否经糖酵解途径发挥抗炎作用。通过双荧光素酶报告基因检测实验观察HOXA9对HK2和GLUT1基因是否具有调控活性。最后,使用小干扰RNA敲低MH-S细胞内HOXA9蛋白表达,探究HOXA9在BMSCs-exo抑制LPS刺激MH-S细胞糖酵解中的作用机制。体内实验中,通过腹腔注射LPS诱导脓毒症相关ARDS小鼠模型,使用小动物成像示踪观察BMSCs-exo是否能经尾静脉进入脓毒症小鼠肺内,根据组织病理学观察脓毒症相关ARDS小鼠肺损伤情况,测定肺湿干比、小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中总蛋白含量和炎性细胞数量、BALF和血清中炎症因子水平及乳酸含量。最后观察BMSCs-exo能否提高脓毒症相关ARDS小鼠7天生存率,并测定小鼠肺组织细胞糖酵解相关蛋白表达水平及巨噬细胞极化指标。结果:体外实验结果显示,经LPS刺激后的MH-S细胞,M1型极化相关标志物IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达显著升高,而M2型极化相关标志物Arg1、Ym1、CD206的m RNA表达显著降低,糖酵解相关基因HK2、PKM2、GLUT1、LDHA的蛋白表达显著升高,葡萄糖消耗量和乳酸含量显著增加,均呈时间依赖性。MH-S细胞与BMSCs以1:2比例共培养可显著抑制MH-S细胞糖酵解相关基因HK2、PKM2、GLUT1、LDHA的蛋白表达,同时减少MH-S细胞葡萄糖消耗量和乳酸含量。经GW4869预处理后的BMSCs,对LPS刺激引起MH-S细胞糖酵解的抑制作用明显减弱,对LPS刺激引起MH-S细胞M1型极化的抑制作用和M2型极化的促进作用也明显减弱,提示BMSCs是通过分泌外泌体来抑制LPS刺激引起的MH-S细胞糖酵解及调控其极化平衡。在MH-S细胞中加入BMSCs-exo后,发现其能进入MH-S细胞抑制LPS刺激引起的糖酵解,并进一步调控MH-S细胞的极化平衡。此外,在LPS刺激的相同条件下,BMSCs-exo发挥了和糖酵解抑制剂2-DG相同的作用,抑制了LPS刺激引起的MH-S细胞M1极化;而在加入糖酵解激动剂Glucose后,BMSCs-exo的这种抗炎作用被减弱。通过HOXA9 si RNA的转染减弱了BMSCs-exo对LPS刺激引起的MH-S细胞糖酵解的抑制作用以及BMSCs-exo促M2极化抗炎作用。在体内实验中,观察到BMSCs-exo可经尾静脉进入脓毒症相关ARDS模型小鼠肺内,显著提高脓毒症小鼠7天生存率。通过H&E染色观察到BMSCs-exo可显著减轻脓毒症相关ARDS小鼠早期肺部炎症情况。此外,与LPS组相比,BMSCs-exo组小鼠肺湿干比,BALF中总蛋白含量、炎性细胞数量,BALF和血清中炎症因子如IL-1β、TNF-α水平均显著降低;BMSCs-exo组小鼠肺组织细胞糖酵解相关基因HK2、PKM2、GLUT1的蛋白表达显著降低,而HOXA9基因的蛋白表达显著升高;BMSCs-exo组小鼠BALF和血清中的乳酸含量显著减少;BMSCs-exo组小鼠巨噬细胞M1型极化相关标志物IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达显著降低,M2型极化相关标志物Arg1、Ym1、CD206的m RNA表达显著升高。结论:BMSCs-exo能够进入LPS刺激的MH-S细胞并显著抑制其糖酵解水平,促进MH-S细胞向M2型极化而抑制其向M1极化从而抑制炎症反应发生。HOXA9可调控糖酵解途径重要限速酶HK2和GLUT1的表达,在BMSCs-exo抑制LPS刺激引起的MH-S细胞糖酵解及促进巨噬细胞极化平衡中发挥重要作用。此外,BMSCs-exo可进入脓毒症相关ARDS模型小鼠肺内,显著提高脓毒症小鼠7天生存率,减轻脓毒症相关ARDS早期肺组织急性炎症症状,抑制脓毒症小鼠肺组织细胞糖酵解水平及调控巨噬细胞极化平衡,最终缓解脓毒症小鼠相关ARDS。

关键词：脓毒症急性呼吸窘迫综合征骨髓间充质干细胞外泌体糖酵解巨噬细胞极化