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作者：解兴兴南昌大学

学位级别：硕士

目的:初步探究性腺外卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)在小鼠子宫内膜的定位、表达变化及其在妊娠期小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用。方法:1、运用免疫组织化学方法观察分析小鼠妊娠期(D1-D9天)子宫内膜组织中F... 详细信息

目的:初步探究性腺外卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)在小鼠子宫内膜的定位、表达变化及其在妊娠期小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用。方法:1、运用免疫组织化学方法观察分析小鼠妊娠期(D1-D9天)子宫内膜组织中FSHR的表达部位及表达水平的变化。2、使用人工诱导蜕膜化技术构建小鼠人工蜕膜化模型,分析FSHR的表达是否受人工蜕膜化的影响。3、构建去卵巢及用E、P激素处理的子宫模型,观察经激素处理后FSHR在小鼠子宫内膜表达的变化。4、通过离体实验对小鼠子宫内膜基质细胞进行分离、培养及体外诱导,检测在离体状态蜕膜化过程中FSHR和FSH表达水平的变化。5、运用MTS法,观察不同浓度的重组FSH对小鼠子宫内膜基质细胞增殖的影响。6、运用实时荧光定量PCR技术和蛋白免疫印迹技术观察FSH对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响。7、采取RNA干扰技术,观察分析FSHR对小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响。8、运用蛋白免疫印迹技术观察分析FSH对小鼠子宫内膜基质细胞Erk1/2和AKT信号通路的影响。结果:1、通过免疫组织化学方法检测显示,在正常妊娠D1-D4天,FSHR主要定位于子宫内膜的腔上皮和腺上皮细胞。随着蜕膜化的进展(妊娠D5-D9天),植入位点FSHR的表达量均明显增加,且主要表达于围绕胚胎的子宫蜕膜组织,而非植入位点FSHR主要定位于腔上皮和腺上皮细胞。2、在在体人工诱导蜕膜化模型中,假孕第4天时给予一侧子宫角注射芝麻油,与非油侧相比,注射芝麻油一侧的子宫角随妊娠时间的延长(D5-D9天)外形逐渐增大,而非油侧子宫角外形没有明显的变化。在人工诱导蜕膜化的子宫组织中,FSHR表达量随妊娠天数的增加(D5-D9天)而逐渐增加,且主要表达于蜕膜细胞,而非油侧子宫组织中,FSHR没有明显变化,主要表达于腔上皮和腺上皮细胞。3、免疫组织化学方法检测显示,摘除卵巢的子宫组织,经E处理12h和24h后,子宫组织中FSHR主要表达腔上皮和腺上皮细胞,而经E和其拮抗剂Tam共同处理后,FSHR在子宫组织中几乎无表达;经P处理12h和24h的子宫组织中,FSHR表达于腔上皮、腺上皮细胞以及子宫基质细胞,而经P与其拮抗剂RU486联合处理后FSHR仅表达于腔上皮和腺上皮细胞。4、细胞免疫荧光染色检测显示,体外分离培养的子宫内膜基质细胞表达波形蛋白(Vimentin)而不表达角形蛋白(Cytokeratin)。在体外经E和P联合培养24h、48h、72h后,免疫荧光染色结果显示,FSHR蛋白显著表达于子宫内膜基质细胞的胞浆和胞膜;蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示,蜕膜化标记分子Cyclin D3蛋白和prl8a2 mRNA的表达水平在体外培养48h、72h后,与24h相比较,均显著性增加(P<0.05或0.01)。同时,Fshb mRNA和Fshr mRNA的表达水平,也随时间的延长而逐渐增加(P<0.01)。5、通过MTS实验观察分析,培养96h后,与Control组相比,3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml的FSH均明显促进基质细胞的增殖(P<0.05或0.01),而300ng/ml、600ng/ml、1000ng/ml的FSH,与Control组相比,均明显抑制了基质细胞的增殖(P<0.05或0.01)。10ng/ml的FSH在体外培养24h、48h、72h、96h后,与0h相比,均能明显促进基质细胞增殖(P<0.05或0.01)。6、运用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测显示,经FSH、E+P、E+P+FSH处理子宫基质细胞48h和72h后,蜕膜化标记分子Cyclin D3蛋白的表达水平,与Control组相比均明显增加(P<0.05或0.01)。同时,与E+P组相比,E+P+FSH组中蜕膜化标记分子prl8a2 mRNA的表达量显著增高(P<0.01)。7、与Blank Control组相比,转染FSHR siRNA+FSH组的Fshr mRNA和FSHR蛋白表达水平均明显下降(P<0.05或0.01),而转染Scramble siRNA组无明显变化。FSHR基因受干扰的同时,蜕膜化的标记分子prl8a2 mRNA和Cyclin D3蛋白的表达水平也均相应下降(P<0.05或0.01),提示FSHR基因的下调能明显抑制子宫内膜基质细胞蜕膜化的进程。8、蛋白免疫印迹结果显示,与0min相比,随着时间延长,10ng/ml FSH处理子宫内膜基质细胞,能明显增加AKT和Erk1/2磷酸化水平,至60min时,AKT和Erk1/2磷酸化水平均达到最大。结论:在妊娠早期,FSHR时空性的表达于妊娠小鼠子宫内膜母胎界面,且其表达部位和表达量变化受E、P及子宫内膜蜕膜化

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缺血预处理改善肝脏缺血再灌注损伤早期LTC4异常增加的分子机制

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作者：洪芬芳南昌大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:肝脏缺血再灌注(ischemia reperfushion,I/R)损伤是一个重大临床问题,在创伤、内毒素休克、重建血管外科、肝移植和肝肿瘤切除外科手术中均存在I/R损伤,是导致肝叶切除、肝移植术后器官功能障碍和衰竭的重要因素,为肝脏... 详细信息

研究背景和目的:肝脏缺血再灌注(ischemia reperfushion,I/R)损伤是一个重大临床问题,在创伤、内毒素休克、重建血管外科、肝移植和肝肿瘤切除外科手术中均存在I/R损伤,是导致肝叶切除、肝移植术后器官功能障碍和衰竭的重要因素,为肝脏外科尚未完全解决的棘手问题。白三烯C4(LTC4)是主要经肝脏代谢的前炎症因子。研究表明,肝脏I/R损伤早期LTC4产物增加与膜脂质过氧化以及肝脏功能和形态组织损伤使LTC4代谢产物排泄减少有关,而LTC4积聚可能加重肝脏I/R导致的早已存在的炎症损伤。我们前期报道I/R早期LTC4堆积与LTC4合酶(LTC4S)表达上调和酶活性增强致LTC4合成增加有关。缺血预处理(ischemia preconditioning,IP)是指肝脏短暂缺血预适应对随后较长时间I/R损伤产生保护作用并提高其再生能力。一系列证据表明IP在与I/R损伤有关的肝移植等重大疾病中有保护作用,包括减少肝切除术中失血,降低氧化反应和过氧化物产生,稳定血流动力学及促进肝再生等。尽管有这些进展,IP减轻肝I/R机制尚未完全阐明。有关一氧化氮(nitric oxide,NO)在肝I/R中的作用已经取得一些进展。外源性的NO供体硝普钠通过保护总肝血流量有效的预防了肝损伤。IP被证明在肝切除术中通过改变NO的生成保护肝实质I/R损伤。本课题通过研究IP对肝脏I/R损伤早期LTC4含量及其合酶LTC4S的影响,并探索NO在其中的作用,进一步阐释IP调控肝脏I/R损伤早期LTC4异常增加的分子机制。为临床治疗肝移植和肝肿瘤切除等重大肝脏疾病提供新的干预靶标和手段。方法:雄性SD大鼠随机均分为4组:假手术(sham)组,肝脏缺血再灌注(I/R)组,缺血预处理(IP)组,IP+L-NAME(L-NAME)组。采用大鼠肝脏部分(70%左右)缺血1h再灌注5h损伤模型,缺血前15min始至复灌5h经颈外静脉输注生理盐水(按3ml/kg/min)。IP组:进行长时间肝脏I/R损伤前,用无创伤动脉夹夹闭供应肝左、中叶动静脉10分钟,再松夹10分钟作为IP,余处理同I/R早期组。L-NAME组:IP前10分钟经颈静脉插管给予NOS的非特异性抑制剂L-NAME(10mg/kg),余处理同IP组。分别以RT-PCR、Western blotting和免疫组化法检查肝微粒体LTC4合酶(LTC4S)基因和蛋白表达,RT-HPLC检查肝组织LTC4含量及LTC4合酶活性,用血清ALT和AST评价肝功能,SOD,MDA和GSH用来评价膜脂质过氧化,HE染色检查肝组织学损伤。结果:与I/R组比较,IP组大鼠肝微粒体LTC4S基因和蛋白表达、微粒体LTC4合酶活性和组织LTC4含量明显下降(P<0.05),免疫组化染色可见LTC4S阳性较少。同时IP组伴有血清ALT、AST和肝组织MDA含量明显降低(P<0.05),SOD活性和GSH含量明显增加(P<0.05);HE染色显示IP组再灌注5h肝脏组织结构破坏较轻。但IP的这些作用在应用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)非特异性抑制剂L-NAME后被完全反转。结论:1、IP抑制LTC4产物增加可能也与其改善肝功能损伤、膜脂质过氧化、氧化应激和组织结构损伤有关。2、首次发现IP在肝脏I/R早期可能通过NO激活途径下调LTC4S的基因和蛋白表达,并抑制LTC4S活性,减少LTC4异常堆积,进而保护肝脏免于I/R损伤。

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DEHP对子宫蜕膜化的影响及其作用机制研究

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作者：沈昕南昌大学

学位级别：硕士

背景和目的:邻苯二甲酸二（2-乙基）已酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）作为增塑剂被广泛使用于聚氯乙烯（PVC）塑料制品中。由于DEHP为亲脂性化合物,不能稳定结合于塑料基质上,故随着塑料产品的反复使用、加热和清洗容易释放... 详细信息

背景和目的:邻苯二甲酸二（2-乙基）已酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）作为增塑剂被广泛使用于聚氯乙烯（PVC）塑料制品中。由于DEHP为亲脂性化合物,不能稳定结合于塑料基质上,故随着塑料产品的反复使用、加热和清洗容易释放到环境中,并通过皮肤、消化及呼吸等途径进入机体,对人类和动物多个系统造成损害。近年来,有关DEHP对于雌性生殖系统的毒性作用受到广泛关注。有研究表明,妊娠期DEHP暴露可导致生殖系统损害,表现为子宫内膜接受性下降、低妊娠率、高流产率及胎儿体重下降等。然而,这些不良妊娠结局,是否与妊娠期DEHP暴露导致的子宫内膜蜕膜化进程受损密切相关呢?至目前为止,还未见相关研究。因此,我们拟通过建立妊娠动物模型,通过灌胃给药方式,给予不同剂量DEHP,以探究DEHP对妊娠期小鼠子宫内膜蜕膜化的影响及其作用机制。方法:1.构建动物模型和取材:（1）正常妊娠动物模型:将同品系雌性小鼠与雄鼠合笼交配,将检出阴栓视为妊娠第一天（GD 1）。妊娠小鼠随机分为4组（n=10只/组）:对照组、20 mg/kg/d、200 mg/kg/d、500 mg/kg/d DEHP组,并按照分组每天给予植物油以及用植物油配制的不同浓度DEHP,于妊娠第八天（GD 8）处死,收集子宫、卵巢、肝脏、肾脏组织样本。（2）假孕动物模型:将同品系雌性小鼠与结扎公鼠雄笼合笼交配,将检出阴栓视为假孕第一天。假孕小鼠随机分为4组（n=10只/组）:对照组、20 mg/kg/d、200 mg/kg/d、500 mg/kg/d DEHP组并按照分组每天给予植物油以及用植物油配制的不同浓度DEHP,于假孕第四天（GD 4）一侧子宫打油人工诱导蜕膜化,假孕第八天（GD 8）处死,收集子宫、卵巢、肝脏、肾脏组织样本。2.通过HE染色,观察妊娠期间DEHP暴露对GD 8小鼠子宫蜕膜细胞多核化的影响。3.通过免疫组织化学方法,观察妊娠期间DEHP暴露对GD 8小鼠子宫蜕膜细胞蜕膜化和增殖的影响。4.通过酶联免疫吸附方法,观察妊娠期间DEHP暴露对GD 8小鼠血清雌孕激素水平的影响。5.通过免疫组织化学方法,研究妊娠期间DEHP暴露对GD 8小鼠子宫蜕膜雌孕激素受体表达、血管生成及自然杀伤细胞（u NK细胞）数量和成熟性的影响。6.通过实时定量PCR方法,观察妊娠期间DEHP暴露对GD 8小鼠子宫蜕膜组织u NK细胞相关细胞因子基因表达水平的影响。结果:1.在正常妊娠状态下,与对照组相比,不同剂量组DEHP暴露对子宫着床位点数无明显影响（P＞0.05）。然而,子宫重量与体重的比值,在200 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP处理组均显著降低（P＜0.05）,且着床位点平均重量与体重比值,在200 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP处理组也均显著降低（P＜0.05或0.01）。在假孕状态下,与对照组相比,打油侧子宫重量以及其与非打油侧重量的比值,在500 mg/kg/d DEHP处理组均显著降低（P＜0.05或0.01）。***染色结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,随着DEHP浓度的增加,蜕膜组织中多核化的蜕膜细胞数,均显著减少（P＜0.01或0.001）。3.免疫组化结果显示,在正常妊娠组和假孕状态下,与对照组相比,各DEHP处理组Cyclin D3阳性细胞数显著减少（P＜0.05或0.01）。与对照组相比,各DEHP剂量组PCNA阳性细胞数与对照组相比显著减少（P＜0.01或0.001）。4.酶联免疫吸附测定的结果显示,与对照组相比,各DEHP处理组血清雌激素水平无明显差异,然而在200 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP处理组,孕激素水平明显升高（P＜0.05或0.001）。5.免疫组化结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,200 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP处理组,小鼠子宫蜕膜雌孕激素受体表达水平显著下降（P＜0.01或0.001）。6.免疫组化结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,200 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP剂量组,小鼠子宫蜕膜组织血管管腔面积均显著减小（P＜0.05或0.001）。7.免疫组化结果显示,在正常妊娠状态下,与对照组相比,20 mg/kg/d DEHP处理组u NK细胞数无显著差异,而200 mg/kg/d和500 mg/kg/d DEHP处理组u NK细胞数均显著减少（P＜0.01或0.001）。在假孕状态下,与对照组相比,各DEHP处理组u NK细胞数显著减少（P＜0.05或0.01）。在正常妊娠和假孕状态下,随着DEHP浓度的增加,u NK细胞逐渐变小,细胞呈现不完全成熟状态。8.实时荧光定量PC

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性激素结合球蛋白与性激素在鉴别女童特发性中枢性性早熟和单纯性乳房早发育中的应用

性激素结合球蛋白与性激素在鉴别女童特发性中枢性性早熟和单纯性...

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作者：冯绪芬南昌大学

学位级别：硕士

背景和目的:女性性早熟(precocious puberty,PP)是指女童在10岁前月经来潮或8岁前出现乳房发育、阴毛和腋毛生长等第二性征,是儿童青春期常见的内分泌疾病之一。性早熟可分为真性性早熟(临床绝大多数真性性早熟为特发性中枢性性早熟,idi... 详细信息

背景和目的:女性性早熟(precocious puberty,PP)是指女童在10岁前月经来潮或8岁前出现乳房发育、阴毛和腋毛生长等第二性征,是儿童青春期常见的内分泌疾病之一。性早熟可分为真性性早熟(临床绝大多数真性性早熟为特发性中枢性性早熟,idiopathic central precocious puberty,ICPP)、假性性早熟和部分性性早熟(临床大多数部分性性早熟为单纯性乳房早发育,premature thelarche,PT)。尽早的诊断和预防,对于性早熟的治疗具有重要意义。目前性早熟的诊断主要通过X线骨龄测定、乳腺和子宫超声检查以及GnRH兴奋实验,但由于放射和超声检测重复性不良,且放射检测短时间内不宜反复进行。另外GnRH兴奋实验需要在短时间内反复抽血,患儿常有抵触情绪,且该方法只能鉴别患儿是否已经发展成为真性性早熟,缺乏预警机制,错过了最佳干预期,故寻找一种更合适的检测指标显得尤其重要。近年来受环境和饮食等因素的影响,性早熟有明显上升趋势,且大部分的性早熟患儿均存在营养过剩的现象。有研究显示,性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin,SHBG)与代谢综合征、肥胖及胰岛素抵抗呈负相关,且在真性性早熟患者血清中SHBG明显下降,但有关SHBG在特发性中枢性性早熟和单纯性乳房早发育中是否可作为一个诊断指标,以及其灵敏度和特异度如何,未见相关研究报道。本研究拟运用血清SHBG联合性激素测定探讨SHBG在鉴别女童ICPP和PT方面的临床价值。方法:收集2018年4月至2019年7月在赣州市妇幼保健院儿童性早熟内分泌门诊诊治的ICPP组134例女童和PT组128例女童为研究对象,选择同期在院就诊的正常青春期女童(puberty control,PC)26例和正常青春期前女童(prepuberty control,PPC)68例为对照组。所有受试者均采用免疫发光分析法测定血清SHBG、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成激素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E)及催乳素(pituitary prolactin,PRL)的含量,分析各组间结果的差异性及临床诊断价值。结果:(1)ICPP组的SHBG水平显著低于PT组(P0.05)。(2)ICPP组与PC组的LH、FSH及E水平均高于PT组和PPC组,差异具有统计学意义(P0.05)。(4)当使用SHBG来预测诊断ICPP(Cut Off值为72.22nmol/L)时,预测诊断灵敏度和特异度分别为0.778和0.985(AUC=0.986);当使用FSH来预测诊断ICPP(Cut Off值为2.395U/L)时,预测诊断灵敏度和特异度分别为0.683和0.738(AUC=0.746);当使用LH来预测诊断ICPP(Cut Off值为0.205U/L)时,预测诊断灵敏度和特异度分别为0.675和0.985(AUC=0.973);当使用E来预测诊断ICPP(Cut Off值为24.4pg/mL)时,预测诊断灵敏度和特异度分别为0.742和0.759(AUC=0.818)。血清中SHBG、FSH、LH、E的AUC均大于0.5,尤其SHBG和LH的AUC更是在0.9以上,并且灵敏度和特异度均较高,具有明显的临床诊断价值。结论:特发性中枢性性早熟患儿血清SHBG水平明显低于单纯乳房早发育女童和青春期前女童,临床上SHBG联合传统性激素检测能更好的区别性早熟情况。

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KiSS-1/GPR54系统在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用及其机制

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作者：张鹏南昌大学

学位级别：硕士

目的：探讨KiSS-1/GPR54系统在子宫内膜的表达、定位及其在蜕膜化中作用。方法： 1、通过实时定量PCR、免疫组织化学等方法观察小鼠围植入期子宫内膜组织中KiSS-1和GPR54的表达水平及表达部位变化。 2、运用在体人工蜕膜化模型，观察K... 详细信息

目的：探讨KiSS-1/GPR54系统在子宫内膜的表达、定位及其在蜕膜化中作用。方法： 1、通过实时定量PCR、免疫组织化学等方法观察小鼠围植入期子宫内膜组织中KiSS-1和GPR54的表达水平及表达部位变化。 2、运用在体人工蜕膜化模型，观察KiSS-1、GPR54的表达是否受活化胚胎的影响。 3、构建去卵巢及性甾体激素处理的子宫模型，观察甾体激素对KiSS-1和GPR54表达的影响。 4、通过子宫内膜基质细胞分离、培养及体外诱导分化，检测在离休状态下蜕膜化过程中KiSS-1、GPR54表达水平的变化。 5、通过RNA干扰技术，观察KiSS-1对小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响。结果： 1、实时定量PCR结果显示，在妊娠D1-D5天，KiSS-1、GPR54mRNA表达量均较低。随着蜕膜化的进程（妊娠D6-D8天），与妊娠D1天相比，KiSS-1和GPR54mRNA的表达量均显著性增加（P0.05);E2与其拮抗剂Tam共同处理组，则进一步增强E2对KiSS-1mRNA表达上调的效应(P<0.05)。 4、分离培养的小鼠子宫内膜基质细胞，免疫荧光法检测显示，基质细胞表达Vimentin而不表达Cytokeratin。在体外经E2和P4联合处理24-72h后，基质细胞表现出的形态符合蜕膜细胞的特异性形态学特征;免疫印迹法和定量PCR检测显示，蜕膜化的标记分子，包括Cyclin D3蛋白、PR蛋白以及dPRP mRNA的表达水平在体外培养48h、72h后均显著性增加。同时KiSS-1和GPR54mRNA的表达水平也随时间逐渐增加。 5、在体外培养的子宫基质细胞蜕膜化模型中，转染KiSS-1siRNA后，与对照组相比(无义序列组)，在培养后24h、48h、72h，KiSS-1mRNA表达水平均显著性下降(P<0.01,0.05)，说明KiSS-1siRNA能特异性抑制了KiSS-1mRNA的表达。KiSS-1基因下调同时，蜕膜化的标记分子dPRP (mRNA)、Cyclin D3(蛋白)和PR(蛋白)的表达水平也均相应下调，提示KiSS-1基因的下调能抑制子宫基质细胞蜕膜化进程。结论：在妊娠早期，KiSS-1/GPR54系统时空性的表达于母胎界面，且受E2、P4及子宫内膜蜕膜化的影响;干涉KiSS-1后子宫内膜基质细胞的蜕膜化受到明显抑制，说明KiSS-1/GPR54系统具有促进子宫内膜的蜕膜化作用。

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妊娠早期三丁基锡暴露对小鼠子宫蜕膜化的影响及其机制的研究

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作者：杨传珍南昌大学

学位级别：硕士

背景和目的:三丁基锡(Tributyltin)是一类具有杀菌防污、防水阻燃作用的有机锡化合物,被广泛运用于轮船涂料、木材防腐和食品包装等领域。大量文献报道三丁基锡通过食物链、水体、生活用品等进入人体,引起内分泌干扰、免疫抑制、肝肾毒... 详细信息

背景和目的:三丁基锡(Tributyltin)是一类具有杀菌防污、防水阻燃作用的有机锡化合物,被广泛运用于轮船涂料、木材防腐和食品包装等领域。大量文献报道三丁基锡通过食物链、水体、生活用品等进入人体,引起内分泌干扰、免疫抑制、肝肾毒性、黏膜损伤等危害。作为一种典型的环境雄激素,三丁基锡使雌性腹足类动物出现雄性特征的叠加,产生性畸变,由此引发人们对其生殖毒性的关注。已有的研究发现,三丁基锡导致雄性睾丸下降延迟、精子畸形率增加、性腺发育异常;其还抑制雌性排卵功能,减少黄体数目,促进卵泡闭锁,使子宫内膜纤维化。三丁基锡宫内暴露将导致胎儿体重下降、流产等不良妊娠结局的发生。子宫蜕膜化是子宫内膜容受性的一部分,为胚胎植入和胎儿生存提供必要的条件,子宫蜕膜化障碍将导致妊娠失败。三丁基锡暴露出现的不良妊娠结局是否由于子宫内膜蜕膜化障碍所致,目前尚不清楚。故本研究拟探讨妊娠早期三丁基锡暴露对小鼠子宫蜕膜化的影响及其作用机制。方法:在正常妊娠或假孕状态下,从妊娠第1天至妊娠第8天,通过灌胃方法给予孕鼠不同剂量的三丁基锡(0 mg/kg/day,对照组;0.2 mg/kg/day,低剂量组;2mg/kg/day,高剂量组),于第8天下午16:00处死小鼠,收集血清、子宫、卵巢等实验标本。然后通过HE染色、免疫组织化学、实时荧光定量PCR、放射免疫和免疫印迹等方法,观察三丁基锡暴露对小鼠子宫蜕膜化的影响及其作用机制。结果:1.与对照组相比,低剂量三丁基锡对小鼠胚胎植入数和妊娠子宫重量均没有明显影响,但高剂量的三丁基锡可显著减少胚胎植入数和妊娠子宫重量。另外,低剂量三丁基锡对人工诱导蜕膜化子宫重量也没有明显影响,但高剂量的三丁基锡显著减少了人工诱导蜕膜化子宫重量。***染色结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,低剂量和高剂量的三丁基锡均显著减少小鼠子宫多核化蜕膜细胞数。3.免疫组化结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,三丁基锡可显著减少小鼠子宫蜕膜PCNA阳性细胞数。4.在正常妊娠和假孕状态下,三丁基锡处理可明显降低子宫cyclin D3和Prl8a2 m RNA表达水平。免疫组化染色结果显示,三丁基锡处理可显著降低子宫蜕膜cyclin D3和Desmin蛋白的表达水平。5.放射免疫分析显示,正常妊娠状态下,低剂量三丁基锡对血清E水平无明显影响,但显著降低了血清P水平。高剂量三丁基锡使血清E水平显著减少,但对血清P水平无明显影响。另外,免疫组化染色结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,三丁基锡处理均显著降低子宫蜕膜细胞ER蛋白和PR蛋白的表达水平。6.在正常妊娠和假孕状态下,高剂量的三丁基锡可显著性降低小鼠子宫的GSH、CAT和SOD的含量,同时显著增加了HO和MDA的浓度。7.在正常妊娠和假孕状态下,高剂量的三丁基锡可显著性增加小鼠子宫铁的含量和COX-2蛋白的表达量,同时降低GPX4蛋白的表达水平。结论:妊娠早期三丁基锡暴露可明显抑制小鼠子宫内膜蜕膜化,其作用机制可能涉及内分泌功能紊乱、氧化应激和铁死亡。

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妊娠期丙烯酰胺暴露对小鼠胎盘生长与发育的影响

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作者：余带男南昌大学

学位级别：硕士

背景和目的:丙烯酰胺(Acrylamide),是一种在现实生活中广泛被使用的化工材料,近几年来有学者报道显示,富含碳水化合物的食品在高温加工的过程中会产生大量的丙烯酰胺。研究表明该化合物可以通过皮肤、呼吸道和消化道等方式进入机体内,... 详细信息

背景和目的:丙烯酰胺(Acrylamide),是一种在现实生活中广泛被使用的化工材料,近几年来有学者报道显示,富含碳水化合物的食品在高温加工的过程中会产生大量的丙烯酰胺。研究表明该化合物可以通过皮肤、呼吸道和消化道等方式进入机体内,并对人类或动物的各个系统造成损害,尤其是生殖系统。已有研究显示,妊娠期间丙烯酰胺的暴露会引起流产率升高、胎儿的体重下降和畸形胎儿数量增加。然而,这些不良妊娠结局的出现是否与妊娠期丙烯酰胺暴露导致胎盘的生长发育障碍密切相关呢?至目前为止,还未见相关的研究。因此,我们拟通过建立妊娠动物模型,采用强制性灌胃给予不同剂量丙烯酰胺的方式,来探究丙烯酰胺对妊娠期小鼠胎盘生长发育的影响及其作用机制。方法:1.构建动物模型及取材:将昆明品种的成年雌性和雄性小鼠(25-30 g)交配,并以在阴道口检出阴栓为标准作为妊娠第一天(GD 1)。从妊娠第3天(GD 3)开始,根据实验小鼠的体重,通过强制性灌胃的方式给予小鼠不同剂量的丙烯酰胺(0,对照组;10 mg/kg/day,低剂量组;50 mg/kg/day,高剂量组),并分别在妊娠第八天(GD 8)和妊娠第十三天(GD 13)时留取小鼠子宫、胎盘、卵巢、肝脏及肾脏标本。2.通过HE染色研究妊娠期间丙烯酰胺暴露对GD 8和GD 13小鼠胎盘组织结构的影响。3.通过实时定量PCR研究妊娠期间丙烯酰胺暴露对GD 8和GD 13小鼠胎盘发育相关基因表达水平的影响。4.通过免疫组织化学研究妊娠期间丙烯酰胺暴露对GD 13小鼠胎盘迷路层血管的影响。5.通过免疫组织化学研究妊娠期间丙烯酰胺暴露对GD 8和GD 13小鼠胎盘细胞增殖的影响。6.通过Western blot检测妊娠期间丙烯酰胺暴露对GD 8和GD 13小鼠胎盘细胞凋亡和MAPK信号通路的影响。结果:1.与对照组相比,GD 8和GD 13的小鼠暴露于不同剂量丙烯酰胺后,其肝脏和肾脏的重量及其脏器系数,均未表现出显著性差异(P>0.05);而卵巢重量及其脏器系数显著降低(P0.05)。然而,在GD 13,高剂量组小鼠的存活胚胎数明显低于对照组(P0.05),而高剂量组的阳性细胞数量与对照组相比显著减少(P0.05),而高剂量组的磷酸化Erk1/2水平明显增加并具有显著的统计学意义(P<0.01)。结论:妊娠期丙烯酰胺的暴露抑制了小鼠胎盘的生长与发育,其主要通过破坏胎盘迷路层血管的生成、下调胎盘发育相关基因、抑制胎盘细胞增殖和诱导细胞凋亡等途径实现。

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高泌乳素血症通过Kiss1/GPR54系统对大鼠卵巢黄体细胞内分泌功能的影响及其机制

高泌乳素血症通过Kiss1/GPR54系统对大鼠卵巢黄体细胞内分泌功能...

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作者：赖丽丹南昌大学

学位级别：硕士

背景和目的:高泌乳素血症(Hyperprolactinemia,HPRL)是指由各种原因导致的血清泌乳素(Prolactin,PRL)异常升高(大于1.14 nmol/L或25μg/L)的一类内分泌疾病,其主要的临床表现为溢乳、月经稀发、闭经以及内分泌功能紊乱。但有关高泌乳素... 详细信息

背景和目的:高泌乳素血症(Hyperprolactinemia,HPRL)是指由各种原因导致的血清泌乳素(Prolactin,PRL)异常升高(大于1.14 nmol/L或25μg/L)的一类内分泌疾病,其主要的临床表现为溢乳、月经稀发、闭经以及内分泌功能紊乱。但有关高泌乳素血症导致的生殖内分泌紊乱的作用途径及机理还不十分清楚。已有研究提示,PRL可通过作用于促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing Hormone,GnRH)神经元,抑制GnRH释放,导致FSH和LH分泌减少,从而抑制雌二醇和孕酮分泌。然而,现有研究显示,仅少量泌乳素受体表达于GnRH神经细胞,而大部分泌乳素受体表达于kisspeptin神经元以及卵巢、睾丸等外周组织。另外,我们前期研究显示,Kiss1/GPR54系统也表达于卵巢黄体组织,并参与卵巢黄体内分泌功能的调节,这提示HPRL可能通过Kiss1/GPR54系统来影响卵巢黄体的内分泌功能。故本研究拟通过腹腔注射盐酸甲氧氯普胺(Metoclopramide,MC)诱导HPRL模型和离体黄体细胞培养,来观察HPRL是否通过外周卵巢Kiss1/GPR54系统影响大鼠卵巢黄体的内分泌功能以及其相关的作用机制。方法:1、通过间接免疫荧光染色法观察Kiss1与PRLR蛋白在正常大鼠卵巢黄体组织及细胞中的表达及相互关系。2、构建在体HPRL模型,观察HPRL对大鼠卵巢黄体组织结构及其内分泌功能的影响。3、采用免疫组织化学和实时定量PCR技术观察HPRL对大鼠卵巢组织Kiss1和GPR54表达水平的影响。4、运用离体细胞培养技术和放射免疫方法观察kisspeptin与PRL对hCG诱导的大鼠卵巢黄体细胞雌二醇与孕酮分泌的影响。5、采用实时定量PCR技术观察kisspeptin与PRL对hCG诱导的大鼠卵巢黄体细胞类固醇激素合成关键酶mRNA表达水平的影响。6、运用酶联免疫分析法观察kisspeptin与PRL对hCG诱导的大鼠卵巢黄体细胞PGF和PGE分泌的影响。7、采用免疫印迹技术观察kisspeptin与PRL对hCG诱导的大鼠卵巢黄体细胞Erk1/2磷酸化的影响。结果:1、间接免疫荧光染色结果表明:未成年大鼠卵巢组织黄体化后,Kiss1蛋白和PRLR蛋白共表达于卵巢黄体组织细胞。2、HE染色结果显示,与对照组相比,HPRL对大鼠卵巢重量、黄体的数量及其面积没有明显的影响(P>0.05)。然而,放射免疫结果显示HPRL大鼠血清雌二醇和孕酮水平明显下降(P0.05)。5、在离体黄体细胞培养中,与对照组相比,高浓度PRL对hCG诱导的大鼠黄体细胞类固醇激素合成几个关键酶(St AR,3β-HSD,CYP11A)mRNA表达水平均具有明显的抑制作用(P<0.05);相比PRL组,黄体细胞液中加入PRL+kisspeptin-10能显著增加几个关键酶mRNA水平的表达(P<0.05)。6、酶联免疫分析结果显示,与对照组相比,高浓度PRL明显可增加hCG诱导的大鼠黄体细胞PGF分泌水平(P<0.01),而kisspeptin-10可明显降低其对黄体细胞PGF水平的促进作用(P<0.01);并且,高浓度PRL可明显抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞PGE的分泌(P<0.01),kisspeptin-10可明显改善其对黄体细胞PGE分泌水平的抑制作用(P<0.05)。7、免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,高浓度PRL明显可减少Erk1/2的磷酸化;相比PRL组,黄体细胞液中加入PRL+kisspeptin-10能显著增加Erk1/2的磷酸化。结论:HPRL可明显抑制大鼠卵巢黄体细胞的内分泌功能,这种效应可能部分通过下调卵巢黄体组织Kiss1/GPR54的表达实现。

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神经病靶酯酶在子痫前期疾病发生中的作用及其机制的研究

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作者：钟婷南昌大学

学位级别：硕士

目的：滋养层细胞侵入异常是子痫前期发病的重要环节，其病因未明。近年，研究显示神经病靶酯酶（neuropathy target esterase，NTE）与胎盘的发育密切相关，其代谢调节的磷脂酰胆碱，注射至妊娠小鼠体内可诱导出子痫前期的模型，且与... 详细信息

目的：滋养层细胞侵入异常是子痫前期发病的重要环节，其病因未明。近年，研究显示神经病靶酯酶（neuropathy target esterase，NTE）与胎盘的发育密切相关，其代谢调节的磷脂酰胆碱，注射至妊娠小鼠体内可诱导出子痫前期的模型，且与滋养层细胞侵润密切相关，故推测NTE可能参与子痫前期疾病的发生。本研究拟探讨NTE在子痫前期表达变化及其对胎盘滋养层细胞迁移及侵润的影响和作用机制。方法：（1）通过实时定量PCR方法和免疫组化技术，检测NTE mRNA和蛋白在正常妊娠和子痫前期胎盘组织表达变化;（2）通过转染pEGFP-N3-NTE和pGenesil-1-shNTE质粒，在人HTR-8/SV-neo滋养层细胞的产生NTE过表达或抑制;（3）通过划痕实验和Transwell方法，观察NTE对HTR-8/SVneo滋养层细胞迁移和侵润的影响;通过MTS实验，观察NTE过表达或抑制后对HTR-8/SVneo滋养层细胞增殖的影响;（4）通过明胶酶谱和ELISA方法检测细胞上清液MMP-2，9和TIMP-1，2的变化;（5）通过Western blot方法，观察NTE对HTR-8/SVneo滋养层细胞ERK-1/2和AKT信号通路的影响. 结果：（1）通过实时定量PCR检测显示，相对于正常妊娠的胎盘组织，在子痫前期胎盘组织中，NTE mRNA表达水平明显下降（p0.05）。相对于Control shRNA组，NTE shRNA组，NTE mRNA（p0.05）。相对于Control shRNA组，NTE shRNA组HTR-8/SVneo细胞迁移和侵润能力均明显减弱（p0.05）。（6）通过明胶酶谱实验分析显示，转染后24h和48h，相对于未转染Bla-nk组， pGenesil-1组和Control shRNA组，HTR-8/SVneo分泌MMP-9均无明显变化（p>0.05）。相对于Control shRNA组，NTE shRNA组HTR-8/SVneo细胞分泌MMP-9显著性减少（p0.05）。（8）Western blot检测显示，转染后48h，相对于未转染Blank组，pGenesil-1组和Control shRNA组，HTR-8/SVneo细胞ERK1/2和AKT磷酸化均无显著影响（p>0.05）。相对于Control shRNA组，NTE shRNA组能显著抑制HTR-8/SVneo细胞ERK1/2磷酸化（p<0.01）和AKT磷酸化（p<0.05）。相对于pGenesil-1组，NTE-EGFP组明显促进HTR-8/SVneo细胞ERK1/2磷酸化（p<0.01）和AKT磷酸化（p<0.001）。结论：（1）相对于正常妊娠的胎盘组织，在

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妊娠期纳米二氧化钛暴露对小鼠胎盘生长与发育的影响

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作者：张璐南昌大学

学位级别：硕士

背景和目的:20世纪80年代末诞生并崛起一种新兴的高科技——纳米技术,随着纳米时代的到来,纳米材料广泛应用于工农业、食品和医疗等领域。纳米二氧化钛(Titanium dioxide nanoparticles,TiO NPS)是应用广泛、年生产量与消耗量较大的纳... 详细信息

背景和目的:20世纪80年代末诞生并崛起一种新兴的高科技——纳米技术,随着纳米时代的到来,纳米材料广泛应用于工农业、食品和医疗等领域。纳米二氧化钛(Titanium dioxide nanoparticles,TiO NPS)是应用广泛、年生产量与消耗量较大的纳米材料之一。近些年来,人们开始广泛关注和重视它对生物系统产生的影响和效应。目前通过大量的在体、离体模型就纳米二氧化钛的生物学效应和安全性分析进行了相当多的研究,且已有的研究显示妊娠期TiO NPS暴露能显著增加胎鼠的畸形率和死亡率。然而,有关妊娠期TiO NPS暴露对小鼠胎盘生长发育的潜在影响尚未确定。因此,我们拟通过强制性灌胃方法探讨妊娠期TiONPS暴露对小鼠胎盘生长与发育的影响及其作用机制。方法:1、构建模型及取材:从雌性昆明小鼠妊娠第1天(GD1)起,通过强制性灌胃方法给予不同剂量的TiO NPS(0,1,10 mg/kg/day),在妊娠第13天(GD13)取小鼠肝脏、脾脏、肾脏、卵巢及胎盘脏器标本。2、通过HE染色观察妊娠期TiO NPS暴露对GD13小鼠胎盘组织结构的影响。3、采用实时荧光定量PCR技术分析妊娠期TiO NPS暴露对GD13小鼠胎盘生长与发育标志性基因表达水平的影响。4、运用免疫组织化学方法,观察妊娠期TiO NPS暴露对GD13小鼠胎盘迷路层血管、蜕膜层uNK细胞以及胎盘细胞增殖的影响。5、通过透射电子显微镜(TEM)观察妊娠期TiO NPS暴露对GD13小鼠胎盘组织超微结构的影响。6、通过蛋白免疫印迹(western blot)技术分析妊娠期TiO NPS暴露对GD13小鼠胎盘凋亡蛋白的影响及可能的信号通路。结果:1、不同剂量TiO NPS暴露后对GD13小鼠肝脏、脾脏、肾脏、卵巢的重量及脏器系数,与对照组相比,均无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,不同剂量TiO NPS暴露后对GD13小鼠胚胎着床数、吸收胚胎数、胎盘重量,也均无明显变化(P>0.05)。然而,1 mg/kg/day TiO NPS暴露后可显著降低GD13小鼠胎盘脏器系数(P<0.05)。2、HE染色结果显示,与对照组相比,10 mg/kg/day TiO NPS暴露后显著增加GD13小鼠胎盘海绵层滋养细胞的面积(P<0.05),同时降低迷路层滋养细胞的面积(P<0.05)。3、实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,TiO NPS暴露后明显抑制GD13小鼠胎盘中Hand1、Esx1、Eomes、Hand2、Ascl2、Fra1 mRNA的表达水平(P<0.001)。4、免疫组织化学结果显示,与对照组相比,TiO NPS暴露后致GD13小鼠胎盘迷路层血管网格结构消失,血管塌陷、闭锁;GD13小鼠胎盘蜕膜层uNK细胞数明显减少(P<0.001);GD13小鼠胎盘的PCNA阳性细胞数呈剂量依赖性降低(P<0.05或P<0.001)。5、透射电子显微镜(TEM)结果显示,与对照组相比,TiO NPS暴露后GD13小鼠胎盘组织细胞出现核固缩、滑面内质网扩张、粗面内质网核糖体脱落的改变。6、蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,1 mg/kg/day和10 mg/kg/day TiONPS暴露后均使Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01或P<0.001)、Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.001)、Caspase-3蛋白被激活,10 mg/kg/day TiO NPS暴露后明显增加Erk1/2磷酸化水平(P<0.001)。结论:妊娠期纳米二氧化钛暴露,显著地破坏小鼠胎盘的生长与发育,其机制可能是通过影响胎盘血管形成、细胞增殖与凋亡途径来实现。

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