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作者：邓莉重庆医科大学

学位级别：硕士

目的牙周炎是指牙周组织受到细菌感染导致的局部炎症反应性疾病,导致牙周组织损伤,随着病程延长可引起牙齿松动甚至缺失,严重影响口腔正常功能。牙龈上皮屏障作为抵御微生物入侵的首道屏障,在牙周炎的发生发展中发挥着重要作用。然而,... 详细信息

目的牙周炎是指牙周组织受到细菌感染导致的局部炎症反应性疾病,导致牙周组织损伤,随着病程延长可引起牙齿松动甚至缺失,严重影响口腔正常功能。牙龈上皮屏障作为抵御微生物入侵的首道屏障,在牙周炎的发生发展中发挥着重要作用。然而,影响牙龈上皮屏障功能的分子机制尚不十分清楚,若能阐明牙龈上皮屏障破坏的具体机制,将对牙周炎的预防与治疗提供新的思路。本课题组基于大数据分析发现MZB1是牙周炎中显著上调,并与牙龈上皮屏障功能密切相关的关键基因之一。本研究旨在通过体内、体外实验探究MZB1对牙龈上皮屏障功能的作用及分子机制。方法在基因表达数据库(GEO)中查询获取人类牙周炎牙龈组织基因表达谱,经归一化和预处理后采用Limma R包分析筛选牙周炎中的差异表达基因,通过Western blot(WB)、免疫组化(IHC)等实验在患者和健康人、牙周炎小鼠中验证该基因的表达,并采用Pg-LPS刺激人牙龈上皮CA9-22细胞,通过WB、RT-qPCR和免疫荧光(IF)检测MZB1在牙龈上皮细胞中的表达及定位。接下来,通过基因探针富集分析(GSEA)预测MZB1在牙周炎中可能富集的KEGG途径,并构建过表达MZB1的稳转CA9-22细胞株,建立体外牙龈上皮屏障细胞模型,检测跨膜电阻值(TEER)和FD4渗透率明确MZB1对牙龈上皮屏障功能的影响,并采用Western blot等实验检测MZB1对紧密连接蛋白ZO-1表达的影响,并探究其相关信号通路。最后通过划痕实验、Transwell实验检测MZB1对CA9-22细胞迁移能力的影响,筛选并验证MZB1影响CA9-22细胞迁移的信号通路。结果Limma分析发现MZB1是牙周炎中显著上调的基因之一,WB和IHC结果显示在牙周炎患者龈沟液、牙龈组织以及丝线结扎牙周炎小鼠模型的牙龈组织中,MZB1均表达上调并定位于小鼠牙龈组织上皮部分,Pg-LPS诱导CA9-22细胞表达MZB1,且定位于胞质中。成功构建过表达对照及过表达MZB1细胞株(Con-ov和MZB1-ov)后,采用CA9-22、Con-ov和MZB1-ov构建上皮细胞屏障模型,MZB1-ov使TEER降低,FD4渗透率升高,且GSEA分析表明MZB1与紧密连接蛋白相关,Western blot、RT-qPCR及IF证实MZB1下调紧密连接蛋白ZO-1的表达并影响其排列,同时MZB1通过ROCK/MLC信号通路抑制ZO-1的表达。Transwell和划痕实验结果表明MZB1通过ERK信号通路促进CA9-22细胞的迁移。结论在牙周炎中,Pg-LPS诱导牙龈上皮细胞高表达MZB1损伤牙龈上皮屏障功能并促进牙龈上皮细胞迁移。

关键词：牙周炎人牙龈上皮细胞上皮屏障迁移

LncRNA-01126通过MEK/ERK信号通路抑制hPDLCs的迁移

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LncRNA-01126通过MEK/ERK信号通路抑制hPDLCs的迁移

作者：朱忆婷重庆医科大学

学位级别：硕士

目的慢性牙周炎是危害牙周支持组织的慢性感染性炎症,能引起牙槽骨丢失,甚至导致牙齿脱落。越来越多的研究表明,长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是牙周炎发生发展过程中的重要调控分子。本研究旨在探讨lncRNA-01126在牙... 详细信息

目的慢性牙周炎是危害牙周支持组织的慢性感染性炎症,能引起牙槽骨丢失,甚至导致牙齿脱落。越来越多的研究表明,长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是牙周炎发生发展过程中的重要调控分子。本研究旨在探讨lncRNA-01126在牙周炎过程中的生物学作用和机制。方法1.通过lncRNA表达谱芯片筛选牙周炎患者与健康人牙龈组织中差异表达的lncRNA,并用Q-PCR技术验证。采用结扎法建立牙周炎小鼠模型及P.g处理牙周膜细胞后,进一步验证lncRNA-01126的表达。2.在牙周膜细胞中分别过表达和敲低lncRNA-01126后研究lncRNA-01126对牙周膜细胞的生物学的影响。通过CCK8实验检测lncRNA-01126对牙周膜细胞增殖能力的影响、应用细胞划痕实验和Transwell实验检测lncRNA-01126对牙周膜细胞迁移能力的影响、以及应用流式细胞术检测lncRNA-01126对牙周膜细胞凋亡能力的影响。3.采用蛋白质印迹（Western Blot,WB）技术检测lncRNA-01126参与调控的相关信号通路,并用信号通路抑制剂进一步验证其功能。结果***表达谱芯片分析发现,在牙周炎患者中,lncRNA-01126、lncRNA-545726、lncRNA-KLLP、lncRNA-FIFH等lncRNA较正常人牙龈组织表达明显增高,其中lncRNA-01126的升高最为显著。并且,P.g感染的牙周膜细胞lncRNA-01126表达增高。在小鼠牙周炎模型中,牙周炎小鼠的牙龈组织中lncRNA-01126也高表达,与芯片结果一致。2.过表达lncRNA-01126的牙周膜细胞迁移能力受抑制,但细胞的增殖能力及凋亡不受影响。相反,siRNA沉默lncRNA-01126后,促进了牙周膜细胞的迁移,同样,也不影响牙周膜细胞的增殖和凋亡。3.牙周膜细胞过表达lncRNA-01126后,p-MEK和p-ERK表达降低,MEK/ERK信号通路受到抑制,相反,沉默lncRNA-01126后,p-MEK和p-ERK表达增高,MEK/ERK信号通路被激活。沉默lncRNA-01126后再加入U0126（MEK抑制剂）,被促进的细胞迁移又再次受到了抑制,提示lncRNA-01126通过抑制MEK/ERK信号通路抑制牙周膜细胞的迁移,从而影响牙周炎的进程。结论本研究筛选出lncRNA-01126作为牙周炎的潜在靶点,证实其通过MEK/ERK信号通路,对hPDLCs的迁移起着关键的抑制作用。

关键词：牙周炎 lncRNA-01126 迁移 MEK/ERK信号通路

Toll样受体2在肺炎链球菌所致的小鼠中耳炎发病机制中的作用研究

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Toll样受体2在肺炎链球菌所致的小鼠中耳炎发病机制中的作用研究

作者：黄益飞重庆医科大学

学位级别：硕士

背景中耳炎是儿童时期最常见的感染性疾病之一,肺炎链球菌为其主要致病菌。临床上大部分中耳炎表现为急性自限性过程,但仍有部分患儿病情转归为危害巨大的复发性或持续性中耳炎;而具体哪些因素参与这一现象目前尚不清楚。最近研究指出,T... 详细信息

背景中耳炎是儿童时期最常见的感染性疾病之一,肺炎链球菌为其主要致病菌。临床上大部分中耳炎表现为急性自限性过程,但仍有部分患儿病情转归为危害巨大的复发性或持续性中耳炎;而具体哪些因素参与这一现象目前尚不清楚。最近研究指出,Toll样受体基因遗传多态性可能与中耳炎反复发作,迁延不愈相关。因此,本研究尝试探究Toll样受体2在肺炎链球菌性中耳炎发病机制中的作用。方法应用听泡穿刺注射方法构建肺炎链球菌性小鼠中耳炎模型,并监测建模后WT及TLR2-/-小鼠中耳组织炎症反应及细菌清除过程。结果我们成功应用听泡穿刺注射方法构建了小鼠中耳炎模型,为后续中耳炎发病机制及防治措施研究奠定了基础。我们发现WT小鼠中耳组织组成性地表达少量TLR2,其表达量在***感染后明显增加。相对于WT小鼠,TLR2"/-小鼠中耳炎症反应的启动并未受到影响。但在晚期阶段,我们发现TLR2-/--小鼠***清除显著下降,中耳炎症反应慢性迁延,而这可能与单核巨噬细胞募集减少有关。结论我们的结果表明TLR2可能在***中耳感染的发病机制及病程转归中发挥重要作用。

关键词：动物疾病模型中耳炎肺炎链球菌感染 Toll样受体

SPINK1作为潜在的非小细胞肺癌生物标志物的鉴定及作用机制初探

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SPINK1作为潜在的非小细胞肺癌生物标志物的鉴定及作用机制初探

作者：张欣欣重庆医科大学

学位级别：硕士

目的肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是导致肿瘤相关死亡的最主要原因。晚期诊断和早期转移使肺癌患者五年生存率不足18%。就病理组织学分型而言,大约85%的肺癌患者属于非小细胞肺癌(NSCLC)。因此,寻找与非小细胞肺癌发生发展相关... 详细信息

目的肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是导致肿瘤相关死亡的最主要原因。晚期诊断和早期转移使肺癌患者五年生存率不足18%。就病理组织学分型而言,大约85%的肺癌患者属于非小细胞肺癌(NSCLC)。因此,寻找与非小细胞肺癌发生发展相关的新的生物靶标对肺癌患者的早期诊断和临床治疗尤为重要。方法1.在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中下载四个数据集(GSE19804、GSE18842、GSE27262、GSE43458)的mRNA表达谱,采用GEO2R方法分析人非小细胞肺癌组织中差异表达的基因(DEGs)。应用韦恩图(Venn Diagram)寻找四个数据集中共同差异表达的基因,应用FUNRICH对筛选所得的差异表达基因进行功能注释,应用STRING数据库对筛选所得的差异表达基因进行蛋白-蛋白互作(PPI)分析寻找NSCLC发生发展中调控节点蛋白。2.筛选目标基因SPINK1作为研究对象,并在TCGA(The Cancer Genome Atlas)、GTEx(The Genotype-Tissue Expression)和IST(In Silico Transcriptomics)在线数据库中进一步验证目标基因SPINK1的mRNA表达水平。在细胞实验中,应用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测候选基因SPINK1在人正常支气管上皮细胞株HBE和人肺腺癌上皮细胞株A549、H1299,人肺鳞状细胞癌上皮细胞株SK-MES-1,人肺大细胞癌细胞株H460中的mRNA和蛋白表达水平。收集20例正常成人外周血血清,38例非小细胞肺癌患者外周血血清及11例非小细胞肺癌患者胸腔积液,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测候选基因SPINK1在正常对照和非小细胞肺癌患者体液中的表达水平。3.3.采用CCK8及生长曲线检测候选基因SPINK1对非小细胞肺癌细胞系增殖的影响。应用流式细胞术和免疫印迹技术检测候选基因SPINK1对细胞周期和凋亡的影响。应用划痕实验和Transwell实验检测SPINK1对细胞迁移能力的影响。应用免疫印迹技术检测候选基因SPINK1对细胞自噬的影响。应用免疫印迹技术检测参与SPINK1发挥生物学效应的相关信号通路。结果1.在GEO数据库四个数据集(GSE19804、GSE18842、GSE27262、GSE43458)中,以p值1.5为筛选标准,共筛选出23个共同上调基因和121个共同下调基因。对以上144个差异表达基因进行功能注释,提示这些差异表达基因主要表达于细胞膜、细胞质、细胞核及细胞外,作为细胞黏附分子、金属肽酶和受体参与细胞通讯、信号转导、生长支持、代谢过程等多种生物学过程。此外,这些基因在乳腺癌、肝癌、肾癌、头颈部肿瘤中也有异常表达。对以上DEGs进行蛋白-蛋白互作分析,发现IL-6,SPP1,VWF,CDH5,CAV1和PECAM1发挥中心调控节点作用,与多种蛋白质相互作用发挥生物学功能。2.筛选所得144个DEGs中,SPINK1在NSCLC中表达显著增加,并在TCGA、GTEx和IST在线数据库中得到进一步验证。细胞实验中,SPINK1在人非小细胞肺癌细胞株中的mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常支气管上皮细胞株HBE。在所测临床样本中,正常成人外周血血清中SPINK1平均浓度644.5pg/mL,非小细胞肺癌患者外周血血清中SPINK1平均浓度1092.9pg/mL,非小细胞肺癌患者胸腔积液中SPINK1平均浓度为1928.8pg/mL。3.沉默SPINK1显著抑制A549和H1299细胞增殖,外源加入rhSPINK1(5ng/mL)可部分回复因内源敲低SPINK1而受抑的细胞增殖。外源添加rhSPINK1(1ng/mL)刺激H460细胞增殖。敲低SPINK1导致细胞周期停滞,G期细胞比例增加,S期细胞比例下降,降低细胞周期检测点蛋白CDK4的表达。此外,沉默SPINK1可诱导自噬和细胞凋亡。SPINK1通过MEK/ERK和PI3K/AKT信号途径参与非小细胞肺癌发生发展进程。结论本研究通过整合的生物信息学分析筛选出NSCLC中144个差异表达的基因,确定SPINK1在非小细胞肺癌组织及体液中显著上调,并通过MEK/ERK和PI3K/AKT信号途径促进非小细胞肺癌发生发展进程。

关键词：非小细胞肺癌生物信息学 SPINK1 信号途径

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TNF-α在继发性中耳炎免疫防御中的作用

TNF-α在继发性中耳炎免疫防御中的作用

作者：范芳梅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的中耳炎(Otitis Media,OM)是儿童最常见的感染性疾病之一,具有高发病率和高复发率。呼吸道病毒流行时往往伴随肺炎、中耳炎的高发生率。许多儿童在罹患中耳炎之前都有上呼吸道病毒感染病史,A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是致O... 详细信息

目的中耳炎(Otitis Media,OM)是儿童最常见的感染性疾病之一,具有高发病率和高复发率。呼吸道病毒流行时往往伴随肺炎、中耳炎的高发生率。许多儿童在罹患中耳炎之前都有上呼吸道病毒感染病史,A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是致OM的最主要呼吸道病毒之一,而肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,***)是致OM最主要的致病菌之一。流行病学调查、临床和实验研究都证实了先前的IAV呼吸道感染与OM的发生具有高度相关性。因此,建立IAV感染后继发***感染性中耳炎(简称继发性中耳炎)小鼠模型对深入研究OM的发病机制具有重要的科学意义。方法1.经鼻感染不同剂量H1N1甲型流感病毒PR8,感染后第5天听泡穿刺接种*** 19F建立C57BL/6小鼠继发性中耳炎模型,观察小鼠体质量变化和生存率;于建模后不同时间点处死小鼠,制备中耳组织切片HE染色,收集中耳灌洗液进行细胞及细菌计数。通过比较继发性中耳炎与单纯中耳炎免疫应答反应的差异探索继发性中耳炎小鼠模型的合适PR8和***剂量。***和TNF-α鼠先经鼻感染550 TCID流感病毒PR8后,第5天听泡穿刺接种10 CFU *** 19F建立C57BL/6小鼠继发感染中耳炎模型,检测中耳灌洗液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和杀菌物质一氧化氮(Nitric oxide,NO)的水平,初步探索PR8在继发性中耳炎中的作用。3.建立WT和TNF-α鼠继发性中耳炎模型,观察WT和TNF-α鼠体质量变化和生存率、计数中耳灌洗液细菌载量、制备中耳组织切片HE染色明确TNF-α在继发性中耳炎小鼠模型中的作用。结果***8预感染可导致***感染性中耳炎小鼠死亡,而单纯***感染组无一例死亡,小鼠体质量变化及生存率与病毒剂量呈剂量依赖方式;PR8感染后继发***感染组中耳腔炎症细胞浸润明显多于单纯***感染组,且细菌载量明显增加;当PR8的剂量为550 TCID和***为10 CFU时PR8+***的生存率为80%,与单纯***相比差异无显著性,故可作为继发性中耳炎的合适剂量,表明成功建立了继发性中耳炎。2.与单纯***感染组比,PR8+***组TNF-α、NO显著增加,而IL-1β显著降低;IL-6、IFN-γ差异无统计学意义。TNF-α介导了NO的产生,与单纯***组相比,PR8+***组高水平的TNF-α在OM早期加重了中耳组织损伤。***-α后PR8+***组小鼠死亡率明显增加;TNF-α抑制中耳及肺对***的清除;TNF-α加重了继发性中耳炎中耳及肺损伤,TNF-α对中耳MPO的产生没有明显影响而肺组织中MPO的产生减少。结论本研究成功建立了继发性中耳炎C57BL/6小鼠模型,阐明在继发性中耳炎中,尽管过多的TNF-α产生会导致早期中耳组织损伤加重,但就OM的整个过程而言TNF-α仍然以发挥免疫保护作用为主。

关键词： H1N1甲型流感病毒继发性中耳炎肿瘤坏死因子一氧化氮

肺炎链球菌性中耳炎中TLR4调控NETs形成的机制研究

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肺炎链球菌性中耳炎中TLR4调控NETs形成的机制研究

作者：董益麟重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:中耳炎(OM)是最常见的儿科疾病之一,肺炎链球菌(***)是引起细菌性中耳炎的主要致病菌,其高发病率和复发率对儿童听力健康造成严重困扰。中性粒细胞是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,除了脱颗粒和吞噬作用外,中性细胞胞外捕获... 详细信息

背景:中耳炎(OM)是最常见的儿科疾病之一,肺炎链球菌(***)是引起细菌性中耳炎的主要致病菌,其高发病率和复发率对儿童听力健康造成严重困扰。中性粒细胞是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,除了脱颗粒和吞噬作用外,中性细胞胞外捕获网(NETs)是2004年发现的一种中性粒细胞新的抗微生物策略,即NETosis。我们在由***诱导的急性中耳炎(AOM)中发现有NETs形成,但NETs形成的机制尚不完全清楚。方法:1、听泡穿刺接种***建立急性中耳炎模型,建模后24小时断颈处死小鼠取中耳,提取中耳灌洗液细胞总mRNA,测定TLR4表达量;制作中耳印片行免疫荧光染色观察NETs形成;接种***同时用3-MA、DPI或DNase I处理小鼠,建模后24小时收集中耳灌洗液,计数灌洗液细胞,定量检测胞外游离DNA,并铺板计数细菌载量。2、分离WT小鼠骨髓中性粒细胞,PMA处理2.5小时诱导NETs产生,加入FITC标记的***,荧光显微镜观察NETs捕获情况;诱导NETs产生后,加入cytD或DNase I抑制细胞吞噬作用或者降解DNA网状结构,然后加入***处理后铺板计数***载量。3、分离WT和TLR2和TLR4小鼠骨髓中性粒细胞,与***共同培养0小时,定量检测胞外游离DNA,制作细胞爬片,免疫荧光染色观察NETs结构;***刺激0.5小时和2小时后分别收集细胞,提取蛋白,免疫印迹法检测LC3-II表达;用3-MA或DPI预处理WT中性粒细胞,***刺激后0.5小时和2小时收集细胞总蛋白,检测LC3-II表达;***刺激后0.5小时和2小时定量测定ROS。结果:1、***在体内体外都能诱导中性粒细胞产生NETs,体外用***刺激中性粒细胞时,2小时NETs产生达到峰值。2、在体外实验中,荧光染色结果显示NETs可以捕获***,铺板计数结果显示DNase I降解NETs后细菌计数显著升高,提示NETs对***有杀菌作用。3、***刺激中性粒细胞2小时后,ROS产生显著增加,自噬激活显著增强,用DPI或3-MA预处理抑制ROS和自噬后,NETs形成被明显抑制;TLR4的中性粒细胞表现出ROS产生和自噬激活受损,提示TLR4可通过ROS和自噬来调控NETs的形成。结论:在***性AOM中,TLR4通过上调ROS和自噬促进NETs形成以抵抗***。

关键词： NETs TLR4 ROS 自噬细菌清除

肺炎链球菌性急性中耳炎中性粒细胞胞外捕获网形成机制的初步研究

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肺炎链球菌性急性中耳炎中性粒细胞胞外捕获网形成机制的初步研究

作者：金春芳重庆医科大学

学位级别：硕士

中耳炎(OM)是儿科常见感染性疾病之一,肺炎链球菌(***)为主要致病菌。感染过程中,中性粒细胞首先募集到炎症部位,发挥重要抗菌作用,其抗菌机制包括吞噬、脱颗粒及释放中性粒细胞胞外捕获网(NETs)。NETs被证实能够捕获微生物并限制其扩散... 详细信息

中耳炎(OM)是儿科常见感染性疾病之一,肺炎链球菌(***)为主要致病菌。感染过程中,中性粒细胞首先募集到炎症部位,发挥重要抗菌作用,其抗菌机制包括吞噬、脱颗粒及释放中性粒细胞胞外捕获网(NETs)。NETs被证实能够捕获微生物并限制其扩散,但***能通过多种途径逃避NETs杀伤作用,NETs甚至可能导致细菌的持续存在和疾病的慢性化。在此基础上,本研究初步探究了肺炎链球菌性急性中耳炎中NETs的形成机制。本研究首先分离小鼠骨髓中性粒细胞并用***直接刺激中性粒细胞,建立稳定的体外实验操作方法,然后建立急性中耳炎(AOM)模型,比较野生鼠与TLR4缺陷鼠之间形成NETs的差异,并在体外实验验证。本研究发现,***刺激中性粒细胞释放NETs,DNase降解NETs结构,阻断ROS生成后NETs形成受抑。在***诱导的小鼠AOM时,中耳腔中有NETs形成,TLR4缺陷小鼠NETs形成能力受损,同时中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)表达降低。综上所述,TLR4参与介导肺炎链球菌性AOM中NETs的形成,且可能是通过影响NE的表达来进行调节。

关键词：急性中耳炎肺炎链球菌中性粒细胞中性粒细胞胞外捕获网

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川楝素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制

川楝素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制

作者：王进重庆医科大学

学位级别：硕士

目的川楝素是从我国传统中药楝科植物川楝子和苦楝皮中提取出的一种四环三萜类化合物,具有广泛的药理作用。近几年来研究证明,川楝素在体外可明显抑制多种肿瘤细胞的增殖,但其机制仅有初步探讨。本论文通过体外细胞培养,体内建立荷瘤小... 详细信息

目的川楝素是从我国传统中药楝科植物川楝子和苦楝皮中提取出的一种四环三萜类化合物,具有广泛的药理作用。近几年来研究证明,川楝素在体外可明显抑制多种肿瘤细胞的增殖,但其机制仅有初步探讨。本论文通过体外细胞培养,体内建立荷瘤小鼠模型,全面系统地研究川楝素对实体肿瘤肝癌的抗肿瘤作用,并进一步探讨川楝素的作用机制及毒副作用。同时,考虑到在治疗方法上血液系统恶性肿瘤有别与实体癌,因此,以人慢性髓系白血病K562细胞为研究对象,从增殖抑制、分化、凋亡三方面对川楝素药理作用及其机制进行初步探讨。方法1.以人肝癌SMMC-7721(P53﹢)、Hep3B(P53﹣)细胞为实验对象,从以下几个方面研究川楝素在体外对人肝癌细胞生长的抑制作用及机制:细胞计数法和MTT法检测川楝素对SMMC-7721、Hep3B细胞和正常肝细胞IAR-20、LO2生长曲线的影响并计算增殖抑制率;观察SMMC-7721、Hep3B细胞形态学改变;AnnexinV法检测早期凋亡率;比色法检测Caspase-3、8、9相对活性改变;免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表达变化。2.建立H22荷瘤小鼠模型,从以下几个方面观察川楝素在体内对小鼠肿瘤生长的抑制作用及机制:量取肿瘤体积,观察肿瘤的生长曲线;剥瘤后称重计算小鼠的肿瘤抑制率;肿瘤组织行病理形态学及HE染色观察;透射电镜观察超微结构改变;观察川楝素对荷瘤小鼠心、肝、脾、肾、胸腺、睾丸组织的影响;免疫组化方法检测肿瘤组织内Bcl-2、Bax和Fas蛋白的表达。3.以人慢性髓系白血病细胞K562(P53﹣)为研究对象,从以下几个方面研究川楝素在体外对K562细胞增殖、分化、凋亡作用的影响及其机制:MTT法检测川楝素对K562细胞和正常人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖的影响;观察K562细胞形态学变化和超微结构的改变;AnnexinV法检测早期凋亡率;DNA ladder分析;联苯胺和POX染色法观察红系和粒系分化情况;比色法检测Caspase-3、8、9相对活性改变;免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表达。结果1.肝癌细胞系体外实验中,0.5μmol/L川楝素可明显抑制肝癌SMMC-7721、Hep3B细胞增殖,且抑制作用呈时间和剂量依赖性,而对正常肝细胞IAR-20、LO2增殖影响较小;川楝素处理后SMMC-7721、Hep3B细胞黏附力降低,部分细胞皱缩变圆;流式细胞术检测到0.5μmol/L川楝素作用SMMC-7721、Hep3B细胞72h的凋亡率分别为21.55%、13.35%,经caspase抑制剂z-VAD-fmk处理后,细胞凋亡率降低,TSN+z-VAD-fmk组与TSN组比较有显著性差异(P< 0.05);川楝素处理SMMC-7721细胞后,Caspase-3、8、9活性均增高,Bcl-2表达减弱,Bax和Fas表达较对照组增强;川楝素处理Hep3B细胞,Caspase-3、Caspase-9活性增高,Caspase-8活性无明显变化,Bcl-2表达减弱,Bax表达增强,而Fas表达无明显变化。2.动物实验显示,川楝素可显著抑制小鼠体内肿瘤的生长,川楝素低剂量组(0.173mg/kg)、高剂量组(0.69mg/kg)的抑瘤率分别为66.23%、87.01%(P<0.05);肿瘤组织超微结构透射电镜观察可见凋亡小体;HE染色显示小鼠心、肝、脾、肾、睾丸脏器形态正常,而胸腺组织可见胸腺小叶的数量及面积减少甚至消失;免疫组化证实,小鼠肿瘤组织内Bcl-2蛋白表达下调,Bax、Fas蛋白表达上调(P<0.05)。3.人慢性髓系白血病细胞体外实验中,川楝素对K562细胞有明显增殖抑制作用,呈时间和浓度依赖性,而对PBMC几乎无影响;普通光镜可见K562细胞典型的凋亡形态学改变;超微结构显示凋亡细胞和凋亡小体;10,30,50 nmol/L川楝素处理K562细胞72 h后的早期凋亡率分别为9.66%,26.06%,52.70%(P<0.01);琼脂糖凝胶电泳可见典型“梯状”条带;联苯胺和POX染色结果阴性;激活K562细胞Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活性;凋亡相关蛋白Bcl-xl表达降低,Bax,Fas表达增强(P<0.05)。结论1.体内体外实验均表明:川楝素对肝癌细胞有较强的抑制增殖和诱导凋亡作用,涉及线粒体途径的参与。2.体外实验表明:川楝素对人慢性髓系白血病K562细胞具有抑制增殖,诱导凋亡的药理效应,诱导凋亡的机制涉及线粒体途径和死亡受体途径共同参与;川楝素对K562细胞无诱导其向红系、粒系分化的作用。

关键词：川楝素凋亡 SMMC-7721细胞 Hep3B细胞 K562细胞

TMEM100在非小细胞肺癌中的作用及机制研究

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TMEM100在非小细胞肺癌中的作用及机制研究

作者：何纤重庆医科大学

学位级别：硕士

目的肺癌是中国乃至全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,每年约有160万人死于肺癌,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%以上,随着吸烟和环境污染的加剧,肺癌的发生率也在逐年增高。NSCLC是一种复杂的异质性病变,部分患者表现为KRAS突变,T... 详细信息

目的肺癌是中国乃至全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,每年约有160万人死于肺癌,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%以上,随着吸烟和环境污染的加剧,肺癌的发生率也在逐年增高。NSCLC是一种复杂的异质性病变,部分患者表现为KRAS突变,TP53突变,LKB1突变,EGFR突变或ALK重组等分子改变。因此,尽管分子靶向药物已应用于临床治疗并取得了一定的成效,但由于肺癌的晚期诊断及早期转移,分子靶向药物的非广谱性及广泛存在的个体差异,使得肺癌患者的五年生存率仍低于15%。因此,深入研究NSCLC发生发展的分子机制和寻找相关的新型分子靶标对于NSCLC的早期诊断和治疗尤为重要。方法1.下载GEO数据库中NSCLC表达谱芯片数据,筛选出肿瘤组织和对照组织的差异基因,对差异基因进行GO、KEGG和蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析,确定候选基因,并在TCGA、CCLE中对候选差异基因进行表达验证,同时在Kaplan-Meier Plotter中分析候选差异基因对NSCLC患者生存的影响。2.分别在NSCLC组织和细胞系中通过免疫组化和Q-PCR验证候选差异基因的表达。在NSCLC细胞中过表达和干扰候选基因后通过CCK8、集落形成实验、细胞周期分析探索候选基因对NSCLC细胞增殖、周期的影响,采用流式细胞术和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测候选基因对细胞凋亡的作用,通过划痕实验和Transwell实验明确候选基因对细胞迁移的效应。3.在NSCLC细胞中过表达和干扰候选基因后检测其对细胞自噬的影响,并探索自噬与凋亡的关系。4.对过表达候选基因的A549细胞和对照细胞进行全转录组测序分析,为后续机制研究提供线索。5.构建候选基因稳定表达细胞株进行动物实验。结果1.以P值小于0.01,logFC绝对值大于等于1.5为标准,从4个人NSCLC相关的GEO数据集(GSE19804、GSE27262、GSE43458、GSE18842)中筛选出23个共同上调基因和121个共同下调基因。其中TMEM100是下调最显著的基因之一,其在4个数据集中的logFC绝对值均大于3。GO分析显示TMEM100主要涉及内皮细胞分化和发育、血管形成、蛋白激酶B(PKB)信号通路、间质细胞分化、上皮间质转变(EMT)、BMP信号通路等,这些生物过程均与肿瘤的发生发展密切相关。同时TMEM100在NSCLC中的低表达在TCGA、CCLE数据库中也得到了验证,且TMEM100的表达还和患者的分期呈负相关,和生存率呈正相关,表明TMEM100可能是潜在的抑癌基因,在NSCLC中发挥作用。2.在人NSCLC组织样本和细胞系中同样发现TMEM100呈低表达状态。过表达TMEM100显著抑制A549细胞增殖、集落形成,引起细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。在H460细胞中干扰TMEM100后得到相反的结果。用稳定过表达TMEM100的A549和对照细胞进行裸鼠成瘤实验,发现TMEM100能抑制裸鼠皮下瘤生长。3.过表达TMEM100后A549细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值增加,p62水平降低,且TMEM100能显著抑制PI3K和AKT的磷酸化水平,在H460中干扰TMEM100后得到相反的结果。用巴弗洛霉素(Baf-A1)抑制自噬后能促进TMEM100诱导的A549细胞凋亡。4.全转录组测序结果显示过表达TMEM100后有1767个基因上调,1092个基因下调(P<0.05,|logFC|≥1为阈值),GO分析发现这些差异基因富集的生物学过程很多与内质网应激和内质网未折叠蛋白应答相关,KEGG通路分析也显示富集的信号通路中最具显著性的为内质网蛋白加工,对内质网应激相关基因的差异表达分析发现CHOP,GADD34,PERK等显著降低。定位分析也显示TMEM10主要位于内质网和细胞膜。过表达TMEM100能抑制A549内质网应激相关蛋白如CHOP、XBP1的表达,在H460中干扰TMEM100得到相反的结果。提示TMEM100可能通过抑制内质网应激发挥作用,但机制有待进一步研究。结论本研究筛选出TMEM100作为潜在的抑癌基因,证实其能通过激活自噬和抑制内质网应激反应抑制NSCLC的发生发展。

关键词：非小细胞肺癌 TMEM100 自噬内质网应激

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血栓弹力图在重度血小板减少患者中的应用

血栓弹力图在重度血小板减少患者中的应用

作者：左艳重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究重度血小板减少患者(PLT≤20×109/L)的血栓弹力图指标与出血的关系。方法:根据临床诊断将108例PLT≤20×10～9/L的患者分为出血组和不出血组,并对他们的血小板计数及血栓弹力图检测结果的差异进行统计学分析。结果:重度血小... 详细信息

目的:研究重度血小板减少患者(PLT≤20×109/L)的血栓弹力图指标与出血的关系。方法:根据临床诊断将108例PLT≤20×10～9/L的患者分为出血组和不出血组,并对他们的血小板计数及血栓弹力图检测结果的差异进行统计学分析。结果:重度血小板减少时,两组患者的性别、年龄、血小板减少类型、凝血象(PT、APTT、TT、Fib)及血栓弹力图参数中的R、K、ANGLE、CI、LY30无统计学差异(P>0.05),但出血组的血小板及血栓弹力图参数中的MA值明显低于不出血组(P<0.05),采用Logistic回归以及ROC曲线分析得到出血=1.253-0.13PLT-0.042MA,界值点取-1.4785时,灵敏度、特异度分别为0.667、0.833,且大于该值的患者出血的可能性为有93.3%。结论:血栓弹力图指标中的MA值在预测重度血小板减少患者的出血倾向时有重要作用。

关键词：血栓弹力图血小板减少出血