SPINK1作为潜在的非小细胞肺癌生物标志物的鉴定及作用机制初探

作     者：张欣欣 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何於娟

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：非小细胞肺癌 生物信息学 SPINK1 信号途径 

摘      要：目的肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是导致肿瘤相关死亡的最主要原因。晚期诊断和早期转移使肺癌患者五年生存率不足18%。就病理组织学分型而言,大约85%的肺癌患者属于非小细胞肺癌(NSCLC)。因此,寻找与非小细胞肺癌发生发展相关的新的生物靶标对肺癌患者的早期诊断和临床治疗尤为重要。方法1.在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中下载四个数据集(GSE19804、GSE18842、GSE27262、GSE43458)的mRNA表达谱,采用GEO2R方法分析人非小细胞肺癌组织中差异表达的基因(DEGs)。应用韦恩图(Venn Diagram)寻找四个数据集中共同差异表达的基因,应用FUNRICH对筛选所得的差异表达基因进行功能注释,应用STRING数据库对筛选所得的差异表达基因进行蛋白-蛋白互作(PPI)分析寻找NSCLC发生发展中调控节点蛋白。2.筛选目标基因SPINK1作为研究对象,并在TCGA(The Cancer Genome Atlas)、GTEx(The Genotype-Tissue Expression)和IST(In Silico Transcriptomics)在线数据库中进一步验证目标基因SPINK1的mRNA表达水平。在细胞实验中,应用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测候选基因SPINK1在人正常支气管上皮细胞株HBE和人肺腺癌上皮细胞株A549、H1299,人肺鳞状细胞癌上皮细胞株SK-MES-1,人肺大细胞癌细胞株H460中的mRNA和蛋白表达水平。收集20例正常成人外周血血清,38例非小细胞肺癌患者外周血血清及11例非小细胞肺癌患者胸腔积液,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测候选基因SPINK1在正常对照和非小细胞肺癌患者体液中的表达水平。3.3.采用CCK8及生长曲线检测候选基因SPINK1对非小细胞肺癌细胞系增殖的影响。应用流式细胞术和免疫印迹技术检测候选基因SPINK1对细胞周期和凋亡的影响。应用划痕实验和Transwell实验检测SPINK1对细胞迁移能力的影响。应用免疫印迹技术检测候选基因SPINK1对细胞自噬的影响。应用免疫印迹技术检测参与SPINK1发挥生物学效应的相关信号通路。结果1.在GEO数据库四个数据集(GSE19804、GSE18842、GSE27262、GSE43458)中,以p值1.5为筛选标准,共筛选出23个共同上调基因和121个共同下调基因。对以上144个差异表达基因进行功能注释,提示这些差异表达基因主要表达于细胞膜、细胞质、细胞核及细胞外,作为细胞黏附分子、金属肽酶和受体参与细胞通讯、信号转导、生长支持、代谢过程等多种生物学过程。此外,这些基因在乳腺癌、肝癌、肾癌、头颈部肿瘤中也有异常表达。对以上DEGs进行蛋白-蛋白互作分析,发现IL-6,SPP1,VWF,CDH5,CAV1和PECAM1发挥中心调控节点作用,与多种蛋白质相互作用发挥生物学功能。2.筛选所得144个DEGs中,SPINK1在NSCLC中表达显著增加,并在TCGA、GTEx和IST在线数据库中得到进一步验证。细胞实验中,SPINK1在人非小细胞肺癌细胞株中的mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常支气管上皮细胞株HBE。在所测临床样本中,正常成人外周血血清中SPINK1平均浓度644.5pg/mL,非小细胞肺癌患者外周血血清中SPINK1平均浓度1092.9pg/mL,非小细胞肺癌患者胸腔积液中SPINK1平均浓度为1928.8pg/mL。3.沉默SPINK1显著抑制A549和H1299细胞增殖,外源加入rhSPINK1(5ng/mL)可部分回复因内源敲低SPINK1而受抑的细胞增殖。外源添加rhSPINK1(1ng/mL)刺激H460细胞增殖。敲低SPINK1导致细胞周期停滞,G期细胞比例增加,S期细胞比例下降,降低细胞周期检测点蛋白CDK4的表达。此外,沉默SPINK1可诱导自噬和细胞凋亡。SPINK1通过MEK/ERK和PI3K/AKT信号途径参与非小细胞肺癌发生发展进程。结论本研究通过整合的生物信息学分析筛选出NSCLC中144个差异表达的基因,确定SPINK1在非小细胞肺癌组织及体液中显著上调,并通过MEK/ERK和PI3K/AKT信号途径促进非小细胞肺癌发生发展进程。