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邻苯二甲酸二乙酯诱导的大鼠尿道下裂与Mafb的表达相关:基于转录组测序结果

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南方医科大学学报 2019年第4期39卷 456-463页

作者：向涵王绍周玥刘星沈炼桔龙春兰张德迎何大维林涛魏光辉儿童泌尿生殖发育与组织工程重庆市重点实验室重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科重庆400014

目的通过转录组测序筛选大鼠尿道发育过程中相关差异基因,并进行验证;探究邻苯二甲酸二乙酯(DEHP)诱导SD大鼠尿道下裂的发生机制。方法 40只成年SD孕鼠随机分成4组(n=10),前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16 d(GD16组)和GD19 d(GD19... 详细信息

目的通过转录组测序筛选大鼠尿道发育过程中相关差异基因,并进行验证;探究邻苯二甲酸二乙酯(DEHP)诱导SD大鼠尿道下裂的发生机制。方法 40只成年SD孕鼠随机分成4组(n=10),前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16 d(GD16组)和GD19 d(GD19组)剖宫产取出雄性胎鼠,将收集好的胎鼠阴茎组织进行转录组测序,lllumina HiSeq 2000筛选出差异表达基因(DEGs),然后对DEGs进行差异基因功能(GO)和pathway显著富集性分析;选取其中的DEG(Mafb)进行免疫荧光验证。后两组分别予以玉米油(对照组)和DEHP [750 mg/(kg·d)](DEHP暴露组)于GD12 d至GD19 d每日灌胃处理,GD19 d剖宫产取出雄性胎鼠,并判断有无尿道下裂的发生。扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态学改变,免疫荧光和Western blot检验阴茎组织中Mafb、β-catenin的表达水平。结果 GD19组胎鼠阴茎组织与GD16组胎鼠阴茎组织转录组测序结果示1360个DEGs(其中上调797个,下调563个),差异基因主要富集于细胞粘着斑信号通路、轴突导向信号通路、细胞外基质受体作用信号通路等,选取DEG(Mafb)进行免疫荧光验证,发现Mafb的表达随发育显著增加,与测序结果相符。而DEHP暴露组胎鼠阴茎组织与对照组胎鼠阴茎组织相比,Mafb、β-catenin表达水平显著下调(P组织的正常发育,Mafb的表达逐渐增加;而DEHP暴露组较对照组Mafb、β-catenin表达显著下调,提示β-catenin信号通路影响Mafb表达可能与DEHP诱导大鼠尿道下裂发生相关。

关键词：尿道下裂邻苯二甲酸二乙酯转录组测序 Mafb

TNF-α对肿瘤微环境中BMSCs生物学特性的影响

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解放军医学杂志 2018年第12期43卷 1002-1008页

作者：向中平崔向荣谭彬田杰朱静重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室重庆400014

目的探讨C6脑胶质瘤细胞微环境中肿瘤坏死因子α(TNF-α)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性的影响。方法将BMSCs与C6脑胶质瘤细胞非接触间接共培养7d,将细胞分为BMSCs组、共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组及共培养+5ng/mlTNF... 详细信息

目的探讨C6脑胶质瘤细胞微环境中肿瘤坏死因子α(TNF-α)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性的影响。方法将BMSCs与C6脑胶质瘤细胞非接触间接共培养7d,将细胞分为BMSCs组、共培养组、共培养+0.5ng/ml TNF-α组及共培养+5ng/mlTNF-α组(在共培养基础上分别加入0.5ng/mlTNF-α及5ng/mlTNF-α)。ELISA分别检测BMSCs、共培养细胞上清中游离TNF-α蛋白的表达情况。采用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化;采用CCK8法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell检测细胞迁移能力;采用Real-time PCR检测细胞中c-Myc、CyclinD1mRNA的表达,Westernblotting检测细胞中NF-κB/P65、c-Myc、CyclinD1蛋白的表达。结果共培养细胞上清中游离TNF-α表达水平[(162.45±31.82)pg/ml]明显低于BMSCs细胞上清[(467.90±150.98)pg/ml](P所占比例以及迁移能力均高于BMSCs组(P所占比例以及迁移能力均明显低于共培养组、共培养+0.5ng/mlTNF-α组(P<0.05),CyclinD1、c-Myc mRNA及蛋白水平表达明显低于共培养组、共培养+0.5ng/mlTNF-α组(P<0.05)。结论 C6脑胶质瘤微环境使BMSCs产生肿瘤相关生物学特性的改变,且共培养后TNF-α表达降低可能是引发其生物学特性改变的重要因素,加入高浓度的TNF-α对于维持干细胞本身生物学特性的稳定性有重要意义。

关键词：骨髓间充质干细胞肿瘤坏死因子-α 生物学特性

环状RNA在儿童肾母细胞瘤中的表达谱、生物学功能和临床意义

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生物化学与生物物理进展 2023年第3期50卷 463-472页

作者：田小毛向彬刘丰魏光辉重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室儿童发育疾病研究教育部重点实验室国家儿童健康与疾病临床医学研究中心儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地儿科学重庆市重点实验室重庆400014

肾母细胞瘤(Wilms瘤)是儿童时期最常见的肾脏恶性肿瘤。传统的分层诊疗方案无法实现指导精准风险分层的目标,尤其是对于那些没有高危因素的患儿。例如,具有相同临床表型并接受相同治疗的患儿可能存在明显不同的预后,这表明该疾病比以前... 详细信息

肾母细胞瘤(Wilms瘤)是儿童时期最常见的肾脏恶性肿瘤。传统的分层诊疗方案无法实现指导精准风险分层的目标,尤其是对于那些没有高危因素的患儿。例如,具有相同临床表型并接受相同治疗的患儿可能存在明显不同的预后,这表明该疾病比以前认识的要复杂得多。这种个体异质性需要更深入的分子表型研究来确定新的标志物和靶点。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是一类新发现的非编码RNA。大量研究报道,失调的环状RNA主要依赖mi RNA“海绵”机制调节癌细胞的多种表型,包括增殖、侵袭、迁移、周期阻滞或化疗耐药等。该分子也有希望成为癌症诊断标志物和治疗靶点。与成人癌症相比,对肾母细胞瘤中环状RNA的研究仍处于起步阶段。本文基于现有文献,系统综述了环状RNA在肾母细胞瘤中的表达模式、生物学功能和临床意义等方面的最新进展,并探讨了目前研究的局限性和今后的研究方向。

关键词： Wilms瘤肾母细胞瘤环状RNA 竞争内源性RNA

刺五加苷诱导大鼠间充质干细胞成骨分化的作用

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解放军医学杂志 2019年第3期44卷 215-221页

作者：黄月颜亮崔向荣龙春兰周琴田杰朱静重庆医科大学附属儿童医院儿童发育与疾病研究教育部重点实验室儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地重庆400014

目的探讨刺五加苷诱导大鼠间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用。方法提取SD大鼠的BMSCs,培养3代后采用流式细胞术鉴定表面抗原CD45、CD29、CD90的表达;在经典成骨培养液中加入不同浓度的刺五加苷而分为9组:A组(1×10^(–4)mol/L),B组(1... 详细信息

目的探讨刺五加苷诱导大鼠间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用。方法提取SD大鼠的BMSCs,培养3代后采用流式细胞术鉴定表面抗原CD45、CD29、CD90的表达;在经典成骨培养液中加入不同浓度的刺五加苷而分为9组:A组(1×10^(–4)mol/L),B组(1×10^(–5)mol/L),C组(1×10^(–6)mol/L),D组(1×10–7mol/L),E组(1×10^(–8)mol/L),F组(1×10^(–9)mol/L),G组(1×10^(–10)mol/L),H组(经典成骨组),I组(阴性对照组)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖能力,反转录定量PCR(RT-qPCR)检测骨形成蛋白(BMP)表达情况,筛选出刺五加苷的最佳诱导浓度。以最佳诱导浓度培养12d后,RT-qPCR检测成骨分化相关基因Runt相关转录因子(RUNX)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)的mRNA表达水平,Western blotting检测Notch跨膜受体蛋白1(Notch1)、毛发增强分裂蛋白(Hes1)的蛋白表达水平;第21天时行矿化钙结节茜素红染色。结果第3代BMSCs表面抗原符合干细胞鉴定标准。CCK-8检测结果显示,A、B两组在培养120h后明显抑制了BMSCs的增殖,后期培养中将舍弃A、B两组;而RTqPCR结果显示,添加有刺五加苷的C～G组中,E组BMP表达量最高(4.91±0.46),因此选择1×10^(–8)mol/L作为刺五加苷的最佳诱导浓度进行后续实验。RT-qPCR检测结果显示,E组OSX表达量(30.72±1.96)明显高于I组(1.02±0.27)和H组(9.99±0.59,P<0.05),BSP表达量(8.15±0.47)高于I组(1.09±0.31)和H组(6.03±0.8,P<0.05),OCN表达量(5.91±0.68)高于I组(1.18±2.91)和H组(3.05±0.53,P<0.05),RUNX表达量(1.99±0.09)虽高于I组(1.02±0.19),却低于H组(2.51±0.06,P<0.05)。Westernblotting检测结果显示,E组成骨诱导后Notch1表达量(4608±103)较I组(2638±308)高,却低于H组(5218±182,P<0.05),Hes1表达量(8885±17)较I组(6241±461)增高,却低于H组(12 289±629,P<0.05)。茜素红染色结果显示刺五加苷浓度为10–8mol/L时矿化钙结节多于经典成骨组,提示该浓度刺五加苷成骨诱导效果较经典成骨组更佳。结论刺五加苷能协同地塞米松促进BMSCs的成骨分化,其作用可能与Notch通路有关。

关键词：刺五加苷成骨分化骨髓间充质干细胞

源于TARGET、ArrayExpress和GEO数据库构建神经母细胞瘤中铜死亡相关预后模型

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陆军军医大学学报 2023年第4期45卷 307-317页

作者：向彬陈美玲曹礼剑何雪予田小毛刘丰魏光辉重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室国家儿童健康疾病临床医学研究中心重庆400014

目的基于铜死亡相关基因(cuproptosis-related genes,CRGs)构建神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)预后模型,以改善神经母细胞瘤患者的个体化管理。方法从公开的数据库中收集具有相关完整临床信息的铜死亡基因表达数据。获得来自基因表达... 详细信息

目的基于铜死亡相关基因(cuproptosis-related genes,CRGs)构建神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)预后模型,以改善神经母细胞瘤患者的个体化管理。方法从公开的数据库中收集具有相关完整临床信息的铜死亡基因表达数据。获得来自基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)的GSE49711队列、来自开放有效治疗方法的治疗性研究数据库(therapeutically applicable research to generate effective treatments,TARGET)的TARGET-NB队列和来自功能基因组学公共存储库ArrayExpress数据库的E-MTAB-8248队列。排除随访信息缺失的患者,最终纳入968例进行分析。选择GSE49711队列作为“训练集”构建预后模型,其余两个数据集作为“验证集”。使用Log-rank检验筛选有预后意义的变量,再使用LASSO-Cox回归分析建立最佳多基因预后模型。采用ROC曲线、列线图、校准曲线和DCA曲线评估预后模型的准确性。使用RT-qPCR验证风险基因在神经母细胞系中的表达水平,并选择关键风险基因PDHA1进行功能分析。结果通过训练集首次建立了预后模型[风险评分公式为(1.573)×PDHA1+(-0.561)×GLS+(0.320)×LIAS+(0.088)×MTF1+(0.301)×PDHB]。根据风险评分中位值将患者分为高风险组和低风险组。生存分析显示高风险组中的NB患者的生存率明显低于低风险组(P实验验证了风险模型中基因的表达水平和关键基因PDHA1的功能。结论基于铜死亡相关基因构建了预测神经母细胞瘤患者生存率的预后模型,并在两个外部数据集中验证了该模型的准确性。

关键词：神经母细胞瘤铜死亡预后模型列线图

邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯对血睾屏障完整性的损伤及机制

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南方医科大学学报 2017年第9期37卷 1178-1182页

作者：沈炼桔唐向亮龙春兰曹希宁魏仪王养才孙茫周玥刘洋刘博黄方圆魏光辉重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所//儿童泌尿生殖发育与组织工程重庆市重点实验室//儿童发育疾病研究教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//儿科学重庆市重点实验室重庆400014

目的探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)破坏睾丸血睾屏障完整性的机制研究。方法将出生后60 d的SD雄鼠随机分为两组,即玉米油对照组和DEHP暴露组,DEHP的用药剂量为750 mg/kg,采用灌胃的方式给药,每天1次,连续处理30 d,并于最后1次处... 详细信息

目的探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)破坏睾丸血睾屏障完整性的机制研究。方法将出生后60 d的SD雄鼠随机分为两组,即玉米油对照组和DEHP暴露组,DEHP的用药剂量为750 mg/kg,采用灌胃的方式给药,每天1次,连续处理30 d,并于最后1次处理后麻醉处死。HE染色观察睾丸的组织病理学改变情况;Western blot检测睾丸组织中构成血睾屏障的关键连接蛋白N-cadherin、β-catenin、occludin和connexin43(Cx43)的膜蛋白表达水平;MTT检测睾丸支持细胞(Sertoli cell)的活力,活性氧检测试剂盒检测细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成水平;Western blot检测抗氧化应激蛋白Nrf2以及p-p38的蛋白表达水平。结果与对照组相比,DEHP暴露后的睾丸曲细精管结构紊乱,管腔中可见圆形的精子细胞,精子排列失去极性;Western blot结果表明occludin和connexin43的表达明显降低,N-cadherin和β-catenin表达明显升高(P<0.05);Sertoli细胞随着DEHP暴露浓度的增加,活力显著降低,ROS生成水平明显增加,Nrf2和p-p38的蛋白表达明显增高(P<0.05)。结论 DEHP暴露可通过氧化应激激活p38 MAPK信号通路,破坏血睾屏障完整性,并最终损伤生精功能。

关键词：血睾屏障氧化应激损伤 p38 邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯

冻融联合灌注法优化大鼠肾脏脱细胞支架的制备

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生物工程学报 2019年第2期35卷 307-318页

作者：胡东张德迎刘博周宇余熠杭沈炼桔龙春兰刘星林涛何大维魏光辉重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科儿童泌尿生殖发育与组织工程重点实验室儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室重庆400014

本研究旨在探索优化肾脏脱细胞支架的制备方法,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理研究提供实验基础。取大鼠肾脏灌注PBS作为对照组(Control组),在不同流速下分别以十二烷基磺酸钠(Sodiumdodecyl sulfate,SDS)灌注(S组),Triton X-100联... 详细信息

本研究旨在探索优化肾脏脱细胞支架的制备方法,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理研究提供实验基础。取大鼠肾脏灌注PBS作为对照组(Control组),在不同流速下分别以十二烷基磺酸钠(Sodiumdodecyl sulfate,SDS)灌注(S组),Triton X-100联合SDS灌注(TS组),反复冻融后Triton X-100联合SDS灌注(FTS组),制备肾脏脱细胞支架,并测定其流体分布及脉管阻力。HE染色、DAPI染色、DNA定量检测脱细胞支架脱细胞程度,Masson染色、PAS染色、免疫组织化学染色检测脱细胞支架主要成分的保留和结构的完整,扫描电镜检测支架的超微结构,MTT法检测支架的细胞毒性,ELISA检测支架中生长因子的含量。结果显示,FTS组脱细胞用时较S组、TS组少,10 mL/min组支架脉管阻力较低,S组、TS组、FTS组流体分布与Control组存在差异。HE染色和DAPI染色显示各组支架未见细胞成分残留,DNA含量组织化学染色见Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、层粘连蛋白(Laminin)表达。扫描电镜见支架呈蜂窝状结构。MTT法检测支架细胞毒性分级在0–1级之间。ELISA检测提示FTS组VEGF、EGF、IGF-1、PDGF含量明显高于S组和TS组。综上,联合冻融和灌注法能够制备更为理想且有效的大鼠肾脏整器官脱细胞支架,为肾脏组织工程及肾脏体外病理、毒理学研究奠定基础。

关键词：组织工程肾脏脱细胞支架冻融法灌注法

Piwi互作RNA的筛选及其在儿童肾母细胞瘤组织中的表达

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第二军医大学学报 2020年第2期41卷 167-175页

作者：王璋张丹张朝霞王钊颖谭小军卢虹旭沈炼桔龙春兰魏光辉何大维重庆医科大学附属儿童医院儿童泌尿生殖发育与组织工程重庆市重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科学重庆市重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院国家儿童健康与疾病临床医学研究中心重庆400014

目的探讨Piwi互作RNA(piRNA)在儿童肾母细胞瘤中的表达及临床意义。方法对Piwi样蛋白2(Piwil2)基因重编程人成纤维细胞所形成的肿瘤样干细胞进行高通量测序,筛选出差异表达piRNA,并利用miRanda软件预测其靶基因,对靶基因进行基因本体(GO... 详细信息

目的探讨Piwi互作RNA(piRNA)在儿童肾母细胞瘤中的表达及临床意义。方法对Piwi样蛋白2(Piwil2)基因重编程人成纤维细胞所形成的肿瘤样干细胞进行高通量测序,筛选出差异表达piRNA,并利用miRanda软件预测其靶基因,对靶基因进行基因本体(GO)功能分析。采用qRT-PCR检测差异表达piRNA及其靶基因在34例肾母细胞瘤患儿肿瘤组织及癌旁正常肾组织标本中的表达,并分析差异表达piRNA及其靶基因与肾母细胞瘤临床病理特征的关系。结果通过高通量测序筛选出230个差异表达piRNA,利用miRanda软件预测出43个靶基因,经GO分析发现其参与的生物学过程主要为调节细胞钙离子浓度,分子功能主要为参与ATP酶的活动及多聚A尾RNA结合。选取5个未知的差异表达piRNA及其靶基因检测其在肾母细胞瘤肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达情况,结果显示第13位未知上调piRNA(NU13)表达量在肿瘤组织中下调(P组织和癌旁正常组织中差异表达无统计学意义(P=0.58);第9位未知上调piRNA(NU9)表达量在肿瘤组织中下调(P组织和癌旁正常组织中差异表达无统计学意义(P=0.29);第5、7、9位未知下调piRNA(ND5、ND7、ND9)及其共同靶基因MT-RNR2样蛋白1(MTRNR2L1)基因的表达量在肿瘤组织中均下调(P均儿童肾母细胞瘤组织中出现差异表达的piRNA及其靶基因与患儿年龄、性别、肿瘤临床分期、病理分型无明显相关性(P均>0.05)。结论piRNA NU9、NU13、ND5、ND7、ND9及靶基因MTRNR2L1在儿童肾母细胞瘤组织中出现差异表达,有望成为鉴别肾母细胞瘤与正常肾组织的标志物。

关键词：高通量测序肿瘤干细胞 Piwi互作RNA 肾母细胞瘤

Mafb基因敲除小鼠的构建及其尿道下裂表型初步分析

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海军军医大学学报 2022年第2期43卷 152-159页

作者：刘振忞孔晓燕沈炼桔龙春兰刘星魏光辉重庆医科大学附属儿童医院儿童泌尿生殖发育与组织工程重庆市重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科学重庆市重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院国家儿童健康与疾病临床医学研究中心重庆400014

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白9(Cas9)构建v-maf肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物B(Mafb)基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因敲除F0代C57BL/6J小鼠;经PC... 详细信息

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白9(Cas9)构建v-maf肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物B(Mafb)基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因敲除F0代C57BL/6J小鼠;经PCR及基因测序鉴定阳性的F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配繁殖,获得F1代Mafb基因敲除杂合子(Mafb^(+/-))小鼠;Mafb^(+/-)小鼠间进行交配繁殖,获得Mafb基因敲除纯合子(Mafb^(-/-))胎鼠。收集雄性Mafb^(-/-)胎鼠阴茎组织,通过免疫荧光技术检测阴茎组织中Mafb蛋白表达情况及尿道缝处上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况,扫描电子显微镜及石蜡切片H-E染色观察阴茎组织形态。结果成功构建、繁育Mafb^(+/-)小鼠并得到雄性Mafb^(-/-)胎鼠。免疫荧光检测结果显示雄性Mafb^(-/-)胎鼠阴茎组织中几乎不存在Mafb蛋白表达,且相较于野生型小鼠其尿道缝处E-cadherin蛋白表达明显降低、α-SMA蛋白表达明显增高;扫描电子显微镜及H-E染色显示雄性Mafb^(-/-)胎鼠为尿道下裂表型。结论成功构建Mafb基因敲除小鼠模型,该基因敲除可导致小鼠出现尿道下裂表型及尿道缝处细胞中E-cadherin和α-SMA的表达差异,为进一步研究该基因在尿道下裂发生机制中的作用奠定了基础。

关键词： v-maf肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物B 基因敲除基因型鉴定尿道下裂动物模型