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猴痘病毒A29L-A35R-M1R融合蛋白的原核表达、纯化及免疫原性初步分析

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病毒学报 2024年第5期40卷 970-977页

作者：张晓凤高志峰王紫研夏伯阳马鸣潇费东亮锦州医科大学畜牧兽医学院锦州121000 辽宁省农业发展服务中心沈阳110015

猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)是一种能够感染人和动物的痘病毒,已对人类公共卫生安全构成巨大威胁,安全高效的疫苗能够有效预防和控制病毒的传播。本研究选取MPXV A29L、A35R和M1R氨基酸序列通过柔性Linker(GGGGS)连接设计融合蛋白,... 详细信息

猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)是一种能够感染人和动物的痘病毒,已对人类公共卫生安全构成巨大威胁,安全高效的疫苗能够有效预防和控制病毒的传播。本研究选取MPXV A29L、A35R和M1R氨基酸序列通过柔性Linker(GGGGS)连接设计融合蛋白,并根据大肠杆菌密码子偏嗜性对其密码子优化后合成全基因,插入pET-28a载体,构建pET28a-A29L-A35R-M1R重组质粒。转化至*** BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,经SDSPAGE和Western blot进行鉴定,并确定最佳诱导条件。在此基础上,对融合蛋白rA29L-A35R-M1R进行Ni-NTA亲和层析柱纯化后,免疫小鼠。通过ELISA方法检测抗MPXV A29L、A35R和M1R特异性IgG和细胞因子(IFN-γ、IL-2和IL-4)水平,评价融合蛋白免疫原性。实验结果显示:重组质粒pET-28a-A29L-A35R-M1R在*** BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,最佳表达条件为37℃、0.25 mmol/L IPTG诱导5 h;将纯化的融合蛋白rA29LA35R-M1R免疫小鼠3次后,能够产生抗A29L、A35R和M1R特异性IgG,其中anti-rA29L-A35R-M1R IgG水平最高,且融合蛋白rA29L-A35R-M1R能够刺激机体产生高水平IFN-γ,IL-2和IL-4,与对照组差异均具有统计学意义(P<0.01)。由此表明,融合蛋白rA29L-A35R-M1R具有良好的免疫原性。为猴痘病毒新型疫苗和治疗性生物制剂的研发提供理论依据。

关键词：猴痘病毒融合蛋白原核表达免疫原性

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葡萄籽原花青素(GSP)对肉鸡生长性能、屠宰性能及血脂的影响

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饲料研究 2024年第10期47卷 55-58页

作者：单嘉华姜毅峰王密锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121000

试验旨在探讨饲粮中添加葡萄籽原花青素(GSP)对AA肉鸡生长性能、屠宰性能和血脂的影响。选取1日龄AA肉鸡360只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础饲粮,GSP-L组和GSP-H组分别在基础饲粮中添加250、500 mg/kg葡萄... 详细信息

试验旨在探讨饲粮中添加葡萄籽原花青素(GSP)对AA肉鸡生长性能、屠宰性能和血脂的影响。选取1日龄AA肉鸡360只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础饲粮,GSP-L组和GSP-H组分别在基础饲粮中添加250、500 mg/kg葡萄籽原花青素。试验期42 d。结果表明:与对照组相比,GSP-H组肉鸡1~42日龄平均日采食量和平均日增重显著增加(P0.05);GSP-H组和GSP-L组肉鸡腹脂率显著降低(P<0.05);GSP-H组肉鸡血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量显著降低(P<0.05)。研究表明,葡萄籽原花青素能有效改善肉鸡的生长性能、屠宰性能和血脂水平,适宜添加量为500 mg/kg。

关键词：葡萄籽花青素肉鸡生长性能屠宰性能

有机硒对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉品质及抗氧化性能的影响

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饲料研究 2024年第11期47卷 51-55页

作者：姜毅峰王密锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121000

试验旨在研究有机硒对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉品质及抗氧化性能的影响。选取1日龄罗斯308肉鸡360只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡。Na_(2)SeO_(3)组、Se-Met组和Nano-Se组分别以0.4 mg/kg硒水平添加亚硒酸钠、硒代蛋氨... 详细信息

试验旨在研究有机硒对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉品质及抗氧化性能的影响。选取1日龄罗斯308肉鸡360只,随机分为3组,每组6个重复,每个重复20只鸡。Na_(2)SeO_(3)组、Se-Met组和Nano-Se组分别以0.4 mg/kg硒水平添加亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒。试验期42 d。结果显示,1~21日龄,Se-Met组料重比显著低于Na_(2)SeO_(3)组(P<0.05)。Nano-Se组和Se-Met组的腹脂率显著低于Na_(2)SeO_(3)组(P<0.05)。与Na_(2)SeO_(3)组相比,Nano-Se组肉鸡的胸肌a^(*)值显著增加(P<0.05),Se-Met组和Nano-Se组肉鸡的胸肌系水力显著增加(P<0.05)。与Na_(2)SeO_(3)组相比,Nano-Se组肉鸡的胸肌总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著增加(P<0.05),Se-Met组和Nano-Se组肉鸡的胸肌丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05)。研究表明,有机硒能够有效改善肉鸡的生长性能、屠宰性能、肉品质和抗氧化能力,其中纳米硒效果优于硒代蛋氨酸。

关键词：有机硒肉鸡生长性能屠宰性能肉品质抗氧化性能

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小鼠仙台病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2024年第9期 66-70页

作者：李泽睿王霄孙莉费东亮马跃宇马鸣潇李明锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121011

为了制备小鼠仙台病毒(Sendai virus,SeV)HN蛋白单克隆抗体,试验采用SeV参考毒株HN基因(GenBank登录号为NC_001552.1)对编码HN蛋白的基因密码子优化后克隆重组至原核表达载体pGEX-6P-1上获得重组质粒pGEX-6P-1-HN,将其转化至大肠杆菌BL2... 详细信息

为了制备小鼠仙台病毒(Sendai virus,SeV)HN蛋白单克隆抗体,试验采用SeV参考毒株HN基因(GenBank登录号为NC_001552.1)对编码HN蛋白的基因密码子优化后克隆重组至原核表达载体pGEX-6P-1上获得重组质粒pGEX-6P-1-HN,将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对纯化的重组蛋白rHN进行SDS-PAGE分析。用重组蛋白rHN免疫Balb/c小鼠6次,取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过亚克隆技术和间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,然后注入小鼠腹腔制备抗HN蛋白单克隆抗体,分析单克隆抗体的免疫活性、特异性和稳定性。结果表明:获得3株分泌抗SeV HN蛋白抗体的杂交瘤细胞2F9、5D8、10H2,分泌的抗体效价均为1∶16 000左右。3株单克隆抗体的亚型均为IgG1,均可特异性识别SeV,并不与其他小鼠病毒产生交叉反应,具有良好的特异性。经过10次传代,3株单克隆抗体的效价均在1∶8 000以上,稳定性较好。说明试验成功制备了具备良好免疫活性、特异性和稳定性的抗SeV HN蛋白单克隆抗体,可以为SeV的检测提供有效试剂。

关键词：小鼠仙台病毒 HN蛋白单克隆抗体原核表达杂交瘤细胞

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纳米硒对AA肉鸡生长性能和肉品质的影响

饲料研究 2024年第15期47卷 40-44页

作者：姜毅峰王密锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121000

试验旨在研究纳米硒对AA肉鸡生长性能和肉品质的影响。选取1日龄AA肉鸡480只,随机分为3组,每组8个重复,每个重复20只鸡。对照组在基础饲粮中添加0.4 mg/kg亚硒酸钠,试验1组在基础饲粮中添加0.3 mg/kg纳米硒,试验2组在基础饲粮中添加0.5 ... 详细信息

试验旨在研究纳米硒对AA肉鸡生长性能和肉品质的影响。选取1日龄AA肉鸡480只,随机分为3组,每组8个重复,每个重复20只鸡。对照组在基础饲粮中添加0.4 mg/kg亚硒酸钠,试验1组在基础饲粮中添加0.3 mg/kg纳米硒,试验2组在基础饲粮中添加0.5 mg/kg纳米硒。试验期42 d。结果显示:与对照组相比,22~42日龄,试验1组和试验2组肉鸡平均日采食量显著降低(P<0.05),试验2组肉鸡料重比显著降低(P<0.05);试验2组肉色红度(a*值)显著提高(P<0.05),试验1组和试验2组胸肌剪切力显著降低(P<0.05);试验2组肉鸡胸肌谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著提高(P<0.05),试验1组和试验2组肉鸡胸肌总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著提高(P<0.05);试验2组肉鸡胸肌重组与合成蛋白(Nrf2)表达量显著降低(P<0.05),醌氧化还原酶1(NQO1)表达量显著增加(P<0.05);试验1和试验2组肉鸡胸肌谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、血红素氧化酶-1(HO1)表达量显著增加(P<0.05)。研究表明,饲粮中添加纳米硒可以提高AA肉鸡肌肉的抗氧化能力,改善肉品质,其中添加0.5 mg/kg纳米硒的效果较好。

关键词：纳米硒肉鸡生长性能肉品质抗氧化性能

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施马伦贝格病毒实时荧光RT-RAA快检方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3740-3744页

作者：陈嘉仪黄晓琪王炜杰莫竣喻王苏艳丹珍翁姆陈劲松张瑞周泷李彦敏张志东西南民族大学畜牧兽医学院成都610041

旨在建立一种快速检测施马伦贝格病毒(SBV)的方法。本研究对于SBV S基因,设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在38℃条件下,8 min内即可特异性检出SBV,与口... 详细信息

旨在建立一种快速检测施马伦贝格病毒(SBV)的方法。本研究对于SBV S基因,设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立SBV反转录重组酶介导核酸恒温扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在38℃条件下,8 min内即可特异性检出SBV,与口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲马瘟病毒(AHSV)、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)无交叉反应,其敏感性为103拷贝/反应,且批内和批间重复性变异系数均小于5%。对模拟阳性和阴性绵羊样品的检出率为100%,与SBV的RT-qPCR检测结果一致。本研究成功建立了一种快速、敏感、特异的SBV实时荧光RT-RAA方法,为SBV防控提供新技术手段。

关键词：施马伦贝格病毒重组酶介导核酸恒温扩增方法快速检测

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甘露糖化碳纳米管包裹蕨麻多糖作为REV核酸疫苗免疫佐剂的研究

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黑龙江畜牧兽医 2024年第16期 89-96页

作者：肖乃依李杭雨刘鸿瑞金圣涵房笑淞赵永新封海波西南民族大学畜牧兽医学院成都610041

为了研究甘露糖化碳纳米管包裹蕨麻多糖作为禽网状内皮组织增生症病毒(REV)核酸疫苗免疫佐剂对雏鸡免疫功能的影响,试验利用REV特异性抗原基因gp90与真核表达载体pTT5构建重组质粒pTT5-gp90,提取蕨麻多糖并测定其多糖含量,利用傅里叶红... 详细信息

为了研究甘露糖化碳纳米管包裹蕨麻多糖作为禽网状内皮组织增生症病毒(REV)核酸疫苗免疫佐剂对雏鸡免疫功能的影响,试验利用REV特异性抗原基因gp90与真核表达载体pTT5构建重组质粒pTT5-gp90,提取蕨麻多糖并测定其多糖含量,利用傅里叶红外光谱对甘露糖化碳纳米管进行检测,然后采用CCK-8法测定鸡巨噬细胞(HD11)活性,确定重组质粒pTT5-gp90、蕨麻多糖及甘露糖化碳纳米管使用的质量浓度;将80只未感染REV的1日龄雌性三黄鸡分为对照组、重组质粒pTT5-gp90组、质粒与多糖PAP-gp90组、混合物PAP-gp90@M-M组,分别进行免疫接种、攻毒,免疫后第0,7,14,21天采集血液,检测白细胞介素-4(IL-4)与γ干扰素(IFN-γ)质量浓度、REV抗体效价;攻毒后第7,14,21天饲喂前称量体重并统计累计死亡率,解剖后取脾脏和肝脏,计算脏器指数。结果表明:重组质粒pTT5-gp90、蕨麻多糖、甘露糖化碳纳米管质量浓度分别为100,500,30μg/mL时,HD11细胞活性较高;免疫后第7,14,21,28天,与对照组比较,混合物PAP-gp90@M-M组血清IL-4与IFN-γ质量浓度及REV抗体效价明显上调;攻毒后第3,10天雏鸡体重升高,累计死亡率降低;肝脏指数低于重组质粒pTT5-gp90组,高于对照组,但均差异不显著(P>0.05);脾脏指数显著低于重组质粒pTT5-gp90组(P0.05)。说明甘露糖化碳纳米管包裹蕨麻多糖可作为REV核酸疫苗的免疫佐剂,该佐剂可通过增强雏鸡免疫力、诱导免疫应答、降低死亡率来提高REV核酸疫苗的免疫效果。

关键词：甘露糖化碳纳米管蕨麻多糖禽网状内皮组织增生症病毒核酸疫苗免疫佐剂

中华蜜蜂幼虫响应中蜂囊状幼虫病毒感染的MicroRNAs分析

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病毒学报 2024年

作者：李一肖宇婷马跃宇李明费东亮马鸣潇锦州医科大学畜牧兽医学院锦州医科大学实验动物中心

为了研究中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）感染中华蜜蜂幼虫后体内MicroRNAs(miRNA)表达谱变化，探讨差异miRNAs(DEmiRNAs)在中蜂幼虫响应CSBV应答中的功能。本研究分别对感染CSBV24h和48h中蜂幼虫进行Illumina高通量... 详细信息

为了研究中蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus,CSBV）感染中华蜜蜂幼虫后体内MicroRNAs(miRNA)表达谱变化，探讨差异miRNAs(DEmiRNAs)在中蜂幼虫响应CSBV应答中的功能。本研究分别对感染CSBV24h和48h中蜂幼虫进行Illumina高通量测序，通过生物信息学软件分析DEmiRNAs及其靶基因，并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。通过RT-qPCR对测序结果进行验证。结果显示：对CSBV感染前后中蜂幼虫测序共筛选出140个已知miRNAs和预测到5个新miRNAs。其中，L24I组（CSBV感染24h幼虫）和L24H组（健康幼虫）对比发现18个DEmiRNAs，其中有12个表达上调，有6个表达下调；L48I组（CSBV感染48h幼虫）和L48H组（健康幼虫）筛选到47个DEmiRNAs，其中有30个表达上调，有17个表达下调。GO分析表明，部分DEmiRNAs及相关靶基因参与免疫系统过程和刺激反应等功能；KEGG通路分析显示，除涉及物质和能量代谢通路外，主要的免疫通路包括MAPK、溶酶体、Hippo、凋亡信号通路等。选取对蜜蜂调控具有重要作用和将要研究的8个miRNAs进行RT-qPCR验证结果表明，结果表明其表达水平与测序结果高度一致，表明测序准确可靠。通过本研究，不仅有助于我们深入认识CSBV感染中蜂幼虫过程中宿主miRNA变化情况，也为探究中华蜜蜂和CSBV相互作用时miRNA发挥的功能提供帮助。

关键词： CSBV 中华蜜蜂幼虫 MicroRNA 测序

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牦牛胃溶菌酶抗小鼠腹泻的研究

动物营养学报 2024年第3期36卷 1952-1963页

作者：杨杜基袁小迪李飙张雨寒孙鸿炜刘益丽袁国荣江明锋西南民族大学畜牧兽医学院成都610041 茂县科学技术和农业畜牧局茂县623200

本研究采用PichiaPink^(TM)毕赤酵母表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,以探索提高重组牦牛胃溶菌酶表达量的方法以及重组牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌O111所致小鼠腹泻的治疗作用。试验选取10只体重相近的无特定病原体昆明小鼠,用大肠杆菌... 详细信息

本研究采用PichiaPink^(TM)毕赤酵母表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,以探索提高重组牦牛胃溶菌酶表达量的方法以及重组牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌O111所致小鼠腹泻的治疗作用。试验选取10只体重相近的无特定病原体昆明小鼠,用大肠杆菌O111建立小鼠腹泻模型;建模成功后取30只小鼠随机分为6组,每组5只,设对照组、腹泻模型组、牦牛胃溶菌酶组、重组牦牛胃溶菌酶组、抗生素治疗组、溶菌酶产品治疗组,除对照组和腹泻模型组外其余各组灌胃给药,记录小鼠采食量及体重;第4天采血后全部扑杀,取小鼠十二指肠组织制切片做形态学观察;取肠道内容物进行肠道菌群Alpha和Beta多样性分析。结果表明:重组牦牛胃溶菌酶在诱导96 h时表达量最高,分子质量约为15.6 ku,比活性为1428.58 U/mg。攻毒后腹泻模型组、溶菌酶产品治疗组与对照组相比采食量显著降低(P<0.05);腹泻模型组与对照组相比,白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数均有极显著升高(P<0.01);十二指肠病理解剖观察发现,牦牛胃溶菌酶组肠道绒毛有所增长且厚度增加;重组牦牛胃溶菌酶组肠绒毛有所恢复。Alpha多样性分析发现,牦牛胃溶菌酶组的Simpson指数与对照组相比显著增加(P<0.05);腹泻模型组的变形菌门和弯曲杆菌门相对丰度显著增加(P<0.05);重组牦牛胃溶菌酶组和牦牛胃溶菌酶组的厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度有所增加。本研究表明,牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌引起的腹泻有较好的治疗效果。由于牦牛胃溶菌酶具备较强抗胃蛋白酶能力,其原酶及重组酶在饲料添加剂以及在食品加工和医疗卫生等领域具有一定的应用潜力。

关键词：牦牛胃溶菌酶 PichiaPinkTM毕赤酵母表达系统重组牦牛溶菌酶肠道菌群小鼠腹泻