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非修饰靶点发现细胞热位移分析技术的变革与应用进展

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药学学报 2024年第1期59卷 25-34页

作者：刘广苑李亚慧张炜孔德志河北医科大学中西医结合研究所河北石家庄050017

了解药物的蛋白靶点研究方法对于新药研发、药物的临床应用、药物的作用机制和疾病的致病机制都具有十分重要的意义。细胞热位移分析(cellular thermal shift assay,CETSA)作为无修饰分析的靶点研究方法自开发以来就被广泛应用。经过不... 详细信息

了解药物的蛋白靶点研究方法对于新药研发、药物的临床应用、药物的作用机制和疾病的致病机制都具有十分重要的意义。细胞热位移分析(cellular thermal shift assay,CETSA)作为无修饰分析的靶点研究方法自开发以来就被广泛应用。经过不断地演化,现在已经出现了多种基于CETSA的技术结合,如基于质谱的细胞热位移分析(mass spectrometry-based cellular thermal shift assay,MS-CETSA)、结合等温剂量反应实验的细胞热位移分析(isothermal dose response-cellular thermal shift assay,ITDR-CETSA)、结合均相光激化学发光免疫分析的细胞热位移分析(amplified luminescent primity homogeneous assay-cellular thermal shift assay,Alpha-CETSA)等。这些技术融合了各自的优势,进一步扩展了CETSA的应用范围,适用于从药物筛选到监测药物在患者体内的靶点结合和脱靶毒性研究的整个药物开发链。本文结合作者的研究经验,综述了近年来CETSA和相关结合技术的原理及其在靶点发现上的应用、数据处理分析的进展,旨在为CETSA的进一步应用提供参考和借鉴。

关键词：细胞热位移分析热蛋白质组分析靶点发现技术结合

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蛋白质组学数据揭示可变剪接蛋白质变体

生物化学与生物物理进展 2024年

作者：吴怡颖张炜孔德志河北医科大学中西医结合研究所

可变剪接使同一个基因产生多种不同的转录本和蛋白质，增加蛋白质多样性和功能复杂性。转录组学和蛋白质组学是鉴定可变剪接的两种主要途径，分别通过分析RNA测序数据和蛋白质测序数据来鉴定可变剪接事件和相应蛋白质产物。尽管RNA水平... 详细信息

可变剪接使同一个基因产生多种不同的转录本和蛋白质，增加蛋白质多样性和功能复杂性。转录组学和蛋白质组学是鉴定可变剪接的两种主要途径，分别通过分析RNA测序数据和蛋白质测序数据来鉴定可变剪接事件和相应蛋白质产物。尽管RNA水平的可变剪接研究已经取得了一定的进展，但是对于剪接蛋白亚型的检测和区分仍然不足。本文综述了近年来对可变剪接及其生物功能，可变剪接在不同水平检测的研究进展，详细介绍利用“自下而上”的蛋白质组学数据鉴定可变剪接蛋白变体的两种主要方法，序列数据库构建和蛋白质鉴定算法开发。鉴定不同的可变剪接蛋白质有利于我们认识更全面的蛋白质的功能，对发现相关生物标志物和关键药物靶点具有重要意义。

关键词：可变剪接质谱数据分析蛋白质鉴定算法蛋白质序列数据库

基于转录组测序和WGCNA分析挖掘黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤的关键基因

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中药药理与临床 2024年第2期40卷 40-47页

作者：李玉清王洪连胡琼丹樊均明王丽西南医科大学中西医结合学院泸州646000 西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心泸州646000 成都医学院成都610500

目的:基于高通量转录组测序以及加权基因共表达网络(Weighted gene co-expression network,WGCNA)分析挖掘黄芪三七合剂治疗肾缺血再灌注(IRI)急性肾损伤的关键靶基因。方法:将27只C57BL/6小鼠随机分成假手术对照组、模型对照组和黄芪... 详细信息

目的:基于高通量转录组测序以及加权基因共表达网络(Weighted gene co-expression network,WGCNA)分析挖掘黄芪三七合剂治疗肾缺血再灌注(IRI)急性肾损伤的关键靶基因。方法:将27只C57BL/6小鼠随机分成假手术对照组、模型对照组和黄芪三七合剂3.9 g/kg组,采用夹闭双侧肾蒂处肾动静脉血管45 min后恢复血供的方法建立急性肾损伤模型。术后给予黄芪三七合剂连续灌胃3d后检测肾功能、肾脏病理、炎症因子含量等综合评估黄芪三七合剂对IRI急性肾损伤的治疗效果。此外,每组各随机选取3个肾皮质样本,提取总RNA后进行高通量转录组测序。对测序获得的基因表达数据,使用R中的DESeq2包进行差异分析,WGCNA包执行加权基因共表达分析,确定与黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤相关的共表达模块及关键基因。对挖掘出的关键核心基因进行荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证。同时,还对共表达模块中的核心基因进行基因本体(GO)和京都基因组百科全书注释系统(KOBAS)通路进行富集分析,描述关键核心基因的生物学功能,以揭示黄芪三七合剂治疗急性肾损伤的可能机制。结果:与模型对照组相比,黄芪三七合剂3.9 g/kg显著降低了IRI急性肾损伤小鼠血肌酐、尿素氮的含量和肾组织中白细胞介素-1β(Il1b)、Il6和肿瘤坏死因子-α(Tnfa)的mRNA表达(P<0.01),改善肾小管损伤评分。转录组测序差异分析显示,黄芪三七合剂3.9 g/kg组较模型对照组有259个基因发生显著变化,WGCNA分析共获得23个共表达模块,其中黑色共表达模块基因与黄芪三七合剂干预治疗IRI急性肾损伤(***)呈显著负相关(r=-0.78,P=7×10^(-4))。84个黑色共表达模块中的核心基因与黄芪三七合剂3.9 g/kg组较模型对照组的差异基因取交集得到关键核心基因β-1、4-半乳糖基转移酶5(B4galt5)。对黑色共表达模块核心基因进行蛋白质互作网络(PPI)分析得到关键核心蛋白26S蛋白酶体泛素受体(Adrm1)、泛素1(Ubqln1)、蛋白酶体26S亚基泛素受体(Psmd4)、26S蛋白酶体(Psmc2)。两种方法获得的5个关键核心基因的Real-time PCR验证结果与测序结果一致。对黑色共表达模块的核心基因进行GO分析和KOBAS通路富集分析发现关键核心靶点主要与蛋白糖基化修饰和蛋白酶体介导的代谢过程相关。结论:黄芪三七合剂可能通过靶向B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2等关键核心靶点,参与糖基化修饰或蛋白酶体相关代谢途径治疗IRI急性肾损伤。

关键词：黄芪三七合剂急性肾损伤肾缺血再灌注转录组测序加权基因共表达网络分析

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肾纤康通过调节Smad3介导的铁死亡缓解CKD小鼠肾纤维化

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中国病理生理杂志 2024年第6期40卷 1097-1104页

作者：倪玉芳张璐娜张琼王丽李健春西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心四川泸州646000 西南医科大学附属中医医院肾病科四川泸州646000

目的:观察肾纤康对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)引起的小鼠肾间质纤维化的缓解效果,并探讨其作用机制。方法:将小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量(150 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组和高剂量(450 mg·kg^(... 详细信息

目的:观察肾纤康对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)引起的小鼠肾间质纤维化的缓解效果,并探讨其作用机制。方法:将小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量(150 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组和高剂量(450 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组,每组8只。除假手术组外,其余各组均通过单侧输尿管结扎法建立慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)模型。造模后,分别给予相应剂量的肾纤康,假手术组和模型组则灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续7 d。实验结束后,收集小鼠肾脏组织进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和Masson染色,观察肾脏组织损伤和纤维化程度;利用免疫组化和Western blot技术检测肾脏中纤维化、氧化应激及铁死亡相关蛋白水平的变化;蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)评估肾纤康对转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)与Smad3相互作用的影响。结果:在未经治疗的UUO模型组中,小鼠肾脏出现了如肾小管明显扩张和胶原沉积等典型的病理变化,肾纤康干预组病理改变程度和纤维化明显减轻(P研究和临床应用提供了重要的科学依据。

关键词：肾纤康慢性肾脏病铁死亡 Smad3蛋白转录激活因子3

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温阳解郁汤对脑卒中后抑郁患者血清炎症因子和单胺类递质水平及肠道菌群的影响

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中华中医药学刊 2024年

作者：黄俊东吴升伟卢秋伶章慧李一兰广州医科大学附属脑科医院中西医结合科广州医科大学附属脑科医院中西医结合科脑血管病科广州医科大学附属脑科医院中西医结合科针灸科

目的：探讨温阳解郁汤对脑卒中后抑郁（Post stroke depression，PSD）患者血清炎症因子和单胺类递质水平及肠道菌群的影响。方法：选择我院于2020年1月-2023年3月收治的PSD患者90例，采用随机数字表法将其分为对照组（n=45）与观察组（... 详细信息

目的：探讨温阳解郁汤对脑卒中后抑郁（Post stroke depression，PSD）患者血清炎症因子和单胺类递质水平及肠道菌群的影响。方法：选择我院于2020年1月-2023年3月收治的PSD患者90例，采用随机数字表法将其分为对照组（n=45）与观察组（n=45）。对照组口服盐酸帕罗西汀片，观察组在对照组基础上服用温阳解郁汤。2组治疗周期8周。比较2组治疗疗效；治疗前后日常生活能力、抑郁情绪和神经功能，炎症因子，单胺类神经递质和肠道菌群变化。结果：观察组PSD患者总有效率高于对照组（P＜0.05）。2组治疗后PSD患者日常生活活动能力（Daily Activity Level，ADL）评分高于治疗前，而汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Scale，HAMD）评分和美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）评分低于治疗前（P＜0.05）；观察组治疗后PSD患者ADL评分高于对照组，而HAMD评分和NIHSS评分低于对照组（P＜0.05）。2组治疗后PSD患者血清肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor- α，TNF-α）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactiveprotein，hs-CRP）和白介素-6（Interleukin-6 ，IL-6）水平低于治疗前（P＜0.05）；观察组治疗后PSD患者血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平低于对照组（P＜0.05）。2组治疗后PSD患者血清NE、5-HT和DA水平高于治疗前（P＜0.05）；观察组治疗后PSD患者血清去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和多巴胺（Dopamine，DA）水平高于对照组（P＜0.05）。2组治疗后PSD患者乳酸杆菌和双歧杆菌高于治疗前，而肠球菌和大肠埃希菌低于治疗前（P＜0.05）；观察组治疗后PSD患者乳酸杆菌和双歧杆菌高于对照组，而肠球菌和大肠埃希菌低于对照组（P＜0.05）。结论：温阳解郁汤对PSD患者疗效良好，可显著减轻患者炎症反应，调节单胺类递质水平，及改善肠道菌群变化。

关键词：温阳解郁汤脑卒中抑郁炎症因子单胺类神经递质肠道菌群

利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系

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生物技术通报 2024年第2期40卷 73-79页

作者：张宏民龙雯劳筱清陈雯妍商雪梅王洪连王丽粟宏伟沈宏萍沈宏春西南医科大学中西医结合学院泸州646000 西南医科大学附属中医医院泸州646000

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pme... 详细信息

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pmepa1基因组序列的sgRNA序列,构建pX333载体并转染进入TCMK1细胞,采用流式分选m Cherry阳性细胞、单克隆细胞扩增和测序鉴定Pmepa1敲除细胞,Western blot验证Pmepa1基因敲除情况。采用RT-PCR和Western blot分析Pmepa1敲除对TGF-β1诱导的R-Smad的活化和纤维化的影响。【结果】将sgRNA设计在Pmepa1第2个外显子,pX333-Pmepa1质粒转染TCMK1细胞48 h后,观察到mCherry荧光蛋白的表达,流式细胞分析转染效率约为17%,pX333-Pmepa1质粒转染阳性细胞经流式分选和单克隆扩增培养,得到19个细胞克隆,对Pmepa1基因位点上sgRNA靶点序列PCR扩增测序分析发现2个双等位基因移码突变细胞,Western blot验证Pmepa1蛋白表达缺失,表明Pmepa1基因敲除TCMK1细胞株构建成功,与未敲除细胞相比,Pmepa1敲除细胞在TGF-β1刺激下,p-Smad2和p-Smad3的表达显著升高,并且促进纤维化基因Fibronectin和Collagen I的表达。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功构建Pmepa1基因敲除TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,为Pmepa1蛋白的功能研究建立了细胞模型以及Pmepa1在纤维化中的重要作用。

关键词： CRISPR/Cas9技术 Pmepa1 TCMK1细胞系纤维化

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中华危重病急救医学 2024年第4期36卷 377-380页

作者：刘沙沙董树安史佳刘华洋高巧营余剑波天津医科大学附属南开医院麻醉科与重症医学科天津市中西医结合急腹症研究所天津市急腹症器官损伤与中西医修复重点实验室天津300100 天津医科大学附属南开医院检验科天津市中西医结合急腹症研究所天津市急腹症器官损伤与中西医修复重点实验室天津300100

目的探讨内毒素致急性肺损伤(ALI)时核因子E2相关因子2(Nrf2)对细胞紧密连接蛋白Claudin-18的影响。方法将18只健康雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为对照组、内毒素致ALI模型组(ALI组)及Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(tBHQ)预处理组(tBHQ+... 详细信息

目的探讨内毒素致急性肺损伤(ALI)时核因子E2相关因子2(Nrf2)对细胞紧密连接蛋白Claudin-18的影响。方法将18只健康雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为对照组、内毒素致ALI模型组(ALI组)及Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(tBHQ)预处理组(tBHQ+ALI组),每组6只。通过腹腔注射脂多糖(LPS)15 mg/kg制备小鼠内毒素致ALI模型;对照组注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)。tBHQ+ALI组于制模前3 h分3次腹腔注射tBHQ,每次间隔1 h(合计50 mg/kg),最后一次注射tBHQ的同时给予LPS 15 mg/kg;对照组和模型组给予等量PBS,最后一次给药时分别注射PBS或LPS。注射LPS后12 h处死小鼠取肺组织,苏木素-伊红(HE)染色后,光镜下观察肺组织病理学改变,并计算肺损伤评分;测定肺湿/干质量比值(W/D);采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肺组织Nrf2蛋白表达;采用免疫组化法检测肺组织Claudin-18阳性表达。结果对照组肺组织结构完整,无明显病理学改变。与对照组相比,ALI组肺泡间隔增宽,伴有炎症细胞浸润、毛细血管充血及组织水肿,肺损伤评分及肺W/D比值均明显升高〔肺损伤评分(分):6.50±1.05比1.83±0.75,肺W/D比值:3.79±0.22比3.20±0.14,均P<0.01〕,且肺组织Nrf2蛋白表达及Claudin-18阳性表达均明显降低〔Nrf2蛋白(Nrf2/β-actin):0.41±0.33比1.22±0.33,Claudin-18(A值):0.28±0.07比0.44±0.10,均P<0.05〕。tBHQ预处理后,肺组织病理损伤程度较ALI组明显减轻,肺泡间隔轻度异常,炎症细胞浸润及组织水肿减轻,肺损伤评分及肺W/D比值均明显降低〔肺损伤评分(分):3.00±0.89比6.50±1.05,肺W/D比值:3.28±0.19比3.79±0.22,均P<0.01〕,且肺组织Nrf2蛋白表达及Claudin-18阳性表达均明显升高〔Nrf2蛋白(Nrf2/β-actin):1.26±0.09比0.41±0.33,Claudin-18(A值):0.45±0.04比0.28±0.07,均P<0.05〕。结论Nrf2能通过上调Claudin-18表达减轻肺水肿,从而改善内毒素致ALI。

关键词：急性肺损伤叔丁基对苯二酚核因子E2相关因子2 紧密连接蛋白Claudin-18

蛭龙活血通瘀胶囊通过调控NLRP3信号途径对高血压心肌纤维化的作用研究

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中药药理与临床 2024年第5期40卷 23-30页

作者：刘颜刘孟楠杨廷富刘佳丽陈浩王美措任维罗钢杨思进西南医科大学附属中医医院-国家中医药临床研究基地及心血管内科泸州646000 西南医科大学中西医结合研究所泸州646000

目的:观察蛭龙活血通瘀胶囊通过调控NLRP3信号途径对高血压心肌纤维化小鼠的影响及机制研究。方法:经皮下渗透压缓释泵持续性灌注外源性Ang II 1.46 mg/kg 28 d制备高血压心肌纤维化小鼠模型,造模后随机分为:模型对照组、蛭龙活血通瘀胶... 详细信息

目的:观察蛭龙活血通瘀胶囊通过调控NLRP3信号途径对高血压心肌纤维化小鼠的影响及机制研究。方法:经皮下渗透压缓释泵持续性灌注外源性Ang II 1.46 mg/kg 28 d制备高血压心肌纤维化小鼠模型,造模后随机分为:模型对照组、蛭龙活血通瘀胶囊1.56、3.12、6.24 g/kg组、福辛普利钠2.6×10^(-3)g/kg组,另设正常对照组。各组分别给予相应药物或生理盐水,1次/d,持续4 w,每周测量血压,根据动脉收缩压水平是否达150 mmHg以上和马松染色结果评估造模结果。第4 w后测量并分析左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左心室收缩末期内径(LVESD)和左心室舒张末期内径(LVEDD)等心功能指标;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中脑钠肽(BNP)和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;HE、Masson染色观察心肌细胞形态及胶原纤维的变化;免疫组织化学染色检测纤维连接蛋白(FN)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)的阳性表达;蛋白质免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分别检测FN、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、IL-1β、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)等mRNA和蛋白表达。结果:输注Ang II后小鼠收缩压均达150 mmHg,Masson结果显示心肌出现大量蓝色胶原纤维,表明造模成功;与正常对照组比较,模型对照组小鼠的LVEF、LVFS指数显著减低,LVEDD、LVESD指数显著升高(P<0.01),心肌细胞肥大,排列紊乱,可见大量蓝色胶原纤维,BNP、IL-1β含量显著增高(P<0.01),Fn、Asma、Nlrp3、Caspase1、Il1b、Asc的mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,各药物组的LVEF、LVFS显著升高(P<0.01),LVEDD、LVESD指数明显降低(P<0.05),心肌细胞肥大及排列紊乱明显改善,心肌蓝色胶原纤维面积明显减少,BNP、IL-1β含量显著降低(P<0.01),Fn、Asma、Nlrp3、Caspase1、Il1b、Asc的mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:蛭龙活血通瘀胶囊可以改善高血压心肌纤维小鼠的心功能损伤,其作用机制可能与调控NLRP3信号通路,抑制NLRP3炎症小体的激活,进而减轻炎症因子的浸润有关。

关键词：蛭龙活血通瘀胶囊高血压心肌纤维化炎症反应炎症小体心肌损伤细胞焦亡

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急性胆石性胰腺炎病因学的研究进展

中华肝胆外科杂志 2024年第2期30卷 156-160页

作者：张雅男王奥张莉郭贤德李宁天津大学中西医结合医院肝胆胰外科天津300100 天津医科大学南开临床学院天津300100 天津大学中西医结合医院内镜中心天津300100

急性胆石性胰腺炎(AGP)是一种由胆结石引起的急性胰腺炎,其病因学复杂,解剖基础和始动因素对发病具有协同作用,需要共同研究。胆胰管汇合方式、扩张的主胰管、相对狭小的乳头开口以及小结石或微小结石可能共同参与了AGP的发病过程,其中... 详细信息

急性胆石性胰腺炎(AGP)是一种由胆结石引起的急性胰腺炎,其病因学复杂,解剖基础和始动因素对发病具有协同作用,需要共同研究。胆胰管汇合方式、扩张的主胰管、相对狭小的乳头开口以及小结石或微小结石可能共同参与了AGP的发病过程,其中小结石最为重要。对AGP应做到病因诊断和临床治疗同步进行,针对不同病因及时选择相应的治疗方式能最大程度上缓解患者病情并降低治疗成本。目前AGP的预测指标难以统一,发病过程和相关防治方法有待研究。本文就AGP发病的解剖基础、始动因素、发病机理及自身防御等方面进行综述,为治疗提供参考。

关键词：胰腺炎胆结石病因学