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吲哚胺2,3-双加氧酶基因修饰BMSCs在大鼠同种异体复合组织移植免疫排斥反应中的作用研究

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中国修复重建外科杂志 2014年第6期28卷 745-751页

作者：韩夫王耀军王耘川贾艳慧杨龙龙贾文斌方小兵白晓智胡大海第四军医大学西京医院全军烧伤中心西安710032

目的探讨吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）基因转染修饰大鼠BMSCs对同种异体复合组织移植免疫排斥反应的影响及其机制。方法以IDO过表达慢病毒IDO[绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）1-Lenti转染供... 详细信息

目的探讨吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）基因转染修饰大鼠BMSCs对同种异体复合组织移植免疫排斥反应的影响及其机制。方法以IDO过表达慢病毒IDO[绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）1-Lenti转染供体4～6周龄BN大鼠来源的第3代BMSCs，筛选目的基因高表达、具有生物活性的细胞株IDO-BMSCs。行RT-PCR、Westernblot检测基因修饰前后BMSCs中IDOmRNA及蛋白表达，通过测量培养上清犬尿氨酸生成量检测IDO生物学活性。在混合淋巴细胞反应体系中以IDO-BMSCs、反应细胞（受体4～6周龄LEWIS大鼠来源外周血单个核细胞）和刺激细胞（供体BN大鼠来源外周血单个核细胞）混合培养，细胞比例分别为1：5：5、1：10：10、1：50：50及1：100：100（实验组1、2、3、4）：每个反应体系另设IDO阻断孔，加入1mmol／LIDO特异性抑制剂1-甲基色氨酸（***，1-MT）；以IDO-BMSCs与反应细胞（1：5）培养为阴性对照组，刺激细胞与反应细胞（1：1）培养为阳性对照组，IDO-BMSCs在RPMll640培养基中单独培养作为空白对照组。于培养5d，采用MTT法检测T淋巴细胞增殖情况。进一步制备大鼠同种异体肢体移植模型，将GFP-BMSCs（A组）、IDO-BMSCs（B组）及生理盐水（C组）分别经尾静脉输入移植模型，观察移植物存活时间及免疫排斥反应。结果基因修饰后，BMSCs中IDOmRNA及蛋白表达显著提高。IDO-BMSCs较GFP-BMSCs可明显提高培养上清中犬尿氨酸含量（P〈0．05）。加入1-MT前，实验组1、2、3的T淋巴细胞增殖率随IDO-BMSCs与反应细胞比例逐渐减少而不断增加，组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；实验组4的T淋巴细胞增殖率与阳性对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。加入1-MT后，除实验组4的T淋巴细胞增殖率与加入前比较差异无统计学意义（P〉0．05）外，其余各实验组均高于加入前（P〈0．05）。体内输入后，IDO—BMSCs可在移植物内定植，抑制免疫排斥反应的发生；A、B、C组移植物存活时间分别为（11．5±0．6）、（14．5±0．8）、（9．0±0.3）d，B组存活时间明显长于A、C组，A组长于C组（P〈0．05）。结论ID0-BMSCs可促进大鼠同种异体复合组织移植物的成活，其机制与抑制T淋巴细胞增殖、促进BMSCs向移植物内定植有关。

关键词： BMSCs 吲哚胺2 3-双加氧酶 T淋巴细胞同种异体复合组织移植免疫排斥反应大鼠

人颅骨电阻抗频率特性及其与解剖结构关系研究

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中国生物医学工程学报 2003年第6期22卷 493-497页

作者：吴小明董秀珍秦明新付峰尤富生刘锐岗史学涛向海燕汤孟兴刘飞第四军医大学生物医学工程系西安710032 第四军医大学西京医院神经外科西安710032

在电阻抗断层成像 (EIT)技术应用于脑部成像的研究中 ,颅骨的电阻抗对驱动电流的屏蔽效应非常严重 ,严重影响了成像效果 (特别是中心区域 )。本研究采用离体人颅骨 ,二电极法 ,用频响分析仪 (Solartron12 5 5B)经电阻抗接口 (Solartron ... 详细信息

在电阻抗断层成像 (EIT)技术应用于脑部成像的研究中 ,颅骨的电阻抗对驱动电流的屏蔽效应非常严重 ,严重影响了成像效果 (特别是中心区域 )。本研究采用离体人颅骨 ,二电极法 ,用频响分析仪 (Solartron12 5 5B)经电阻抗接口 (Solartron 12 94 ) ,在 0 .1Hz～ 1MHz频率范围内进行测量 ,描记出颅骨电阻抗频响特性曲线 ,初步观察了颅骨电阻抗随时间变化的趋势 ,研究了颅骨解剖结构同其电阻抗之间的关系。结果表明 :颅骨电阻抗幅值随时间明显增大 ;其特征频率应在 10KHz附近 ,颅骨组织的解剖结构对颅骨电阻抗有重要的影响 ,含有板障层的厚颅骨由于颅骨内、外板中富含毛细血管的原因 ,其电阻抗较不含板障层的薄颅骨电阻抗小。本研究结果为解决颅骨高阻抗的屏蔽效应问题提供了可能的参考和依据。

关键词：颅骨板障电阻抗频率响应电阻抗断层成像 EIT 解剖结构人脑功能

多单位核酶对慢性粒细胞白血病细胞的增殖抑制及凋亡诱导效应研究

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中华肿瘤杂志 2002年第5期24卷 435-439页

作者：冯琦孙秉中孙凯尚振川王莎王玮赵永同颜真韩苇张英起第四军医大学西京医院血液内科西安710033 西京医院肝胆外科第四军医大学西京医院生物技术中心西安710033

目的　探讨多单位核酶体外净化慢性粒细胞白血病 (慢粒 )骨髓的可能性 ,研究多单位核酶的体外切割活性及对慢粒细胞恶性表型的逆转作用。方法　针对慢粒发病中起重要作用的bcr abl融合基因 ,在融合位点两侧 4 4碱基范围内设计、合成 3... 详细信息

目的　探讨多单位核酶体外净化慢性粒细胞白血病 (慢粒 )骨髓的可能性 ,研究多单位核酶的体外切割活性及对慢粒细胞恶性表型的逆转作用。方法　针对慢粒发病中起重要作用的bcr abl融合基因 ,在融合位点两侧 4 4碱基范围内设计、合成 3个核酶 ,其中 2个切割位点位于bcr基因 ,1个位于abl基因。通过基因重组构建多单位核酶体外转录载体及逆转录病毒表达载体 ,鉴定其体外切割活性。将多单位核酶逆转录病毒表达载体转染K5 6 2细胞 ,应用MTT、3 H TdR掺入、RT PCR、斑点杂交、流式细胞仪、透射及扫描电镜等方法 ,检测多单位核酶对慢粒细胞增殖活性及细胞超微结构、细胞周期、凋亡等的影响。结果　多单位核酶的体外切割活性为 70 .8% ,逆转录病毒载体转染慢粒K5 6 2细胞系后 ,细胞DNA合成及细胞增殖受到明显抑制 ,转染后 96h抑制率达 5 0 %左右。多单位核酶转染细胞后能够有效切割细胞RNA ,使转染细胞RNA减少 10 0 0倍左右。流式细胞仪检测显示多单位核酶转染 72h后 ,18.4 %的细胞发生凋亡 ,大多数细胞被阻滞于G期 ,分裂期 (S期 )细胞数减少约 4 1.9%。透射、扫描电镜见转染细胞出现核固缩、凋亡小体等细胞凋亡的特异性表现。结论　多单位核酶不仅具有较高的体外切割活性 ,而且其逆转录病毒载体能够有效转染慢?

关键词：慢性粒细胞白血病 bcr-abl基因核酶细胞凋亡基因治疗

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Y染色体微缺失与男性不育相关

第四军医大学学报 2002年第14期23卷 1325-1327页

作者：刘芳陈必良苏明权王德堂第四军医大学西京医院妇产科陕西西安710033 第四军医大学西京医院分子生物研究中心陕西西安710033

目的　探讨 Y染色体微缺失与原因不明性无精症、少精症所致男性不育的相关性 .方法　特发性少精症 18例、特发性严重少精症 12例、特发性无精症 5例及正常已生育健康男性 10例作为研究对象和正常对照 .应用多重 PCR技术 ,对精液基因组 ... 详细信息

目的　探讨 Y染色体微缺失与原因不明性无精症、少精症所致男性不育的相关性 .方法　特发性少精症 18例、特发性严重少精症 12例、特发性无精症 5例及正常已生育健康男性 10例作为研究对象和正常对照 .应用多重 PCR技术 ,对精液基因组 DNA进行 Y染色体上连续的 18个序列标记位点检测 .结果　少精症 18例中发现 Y染色体微缺失 2例 ,严重少精症 12例中发现 Y染色体微缺失 3例 .无精症 5例和正常已生育男性 10例均末发现 Y染色体微缺失 .缺失形式 3种 .结论　

关键词： Y染色体微缺失男性不良基因

bFGF和硫糖铝在持续恒压扩张术中局部联合应用对组织细胞增殖的影响

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中华整形外科杂志 2003年第3期19卷 203-206页

作者：胡亚兰郭树忠鲁开化第四军医大学西京医院整形外科中心

目的　研究bFGF和硫糖铝在扩张术中局部应用对细胞增殖的影响。方法　白色小猪 9只 ,自身对照 ,分为实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、对照组 ,扩张术中分别注入bFGF和硫糖铝、bFGF、硫糖铝、生理盐水。各动物于术后第 1～ 14天取出扩张器后 6周取材... 详细信息

目的　研究bFGF和硫糖铝在扩张术中局部应用对细胞增殖的影响。方法　白色小猪 9只 ,自身对照 ,分为实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、对照组 ,扩张术中分别注入bFGF和硫糖铝、bFGF、硫糖铝、生理盐水。各动物于术后第 1～ 14天取出扩张器后 6周取材作免疫组织化学检查。结果　持续恒压扩张术同时加用bFGF和硫糖铝后 ,表皮层基底细胞增殖更早更明显 ,尤其以第 3天最为显著 ,14d基底细胞增殖指数最低但也高于对照组 (持续恒压扩张组 ) ;真皮层成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、毛囊上皮细胞、汗腺上皮细胞增殖更明显 ,早于对照组 ,7d达高峰 ,14d明显减少但仍高于对照组 ,6周基本恢复正常。实验Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异无显著性意义。结论　bFGF和硫糖铝联合局部应用于扩张术 ,促细胞增殖作用强 ,从而在扩张早期有效地诱导皮肤细胞分裂增殖 ,促进皮肤软组织生物性生长。

关键词：硫糖铝 FGF 扩张术对照组术中细胞增殖基底细胞动物腺上皮细胞分裂

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组织工程人工血管支架的预构

中华整形外科杂志 2003年第1期19卷 44-46页

作者：潘勇黄蔚艾玉峰熊猛张琳西彭湃第四军医大学西京医院整形外科中心西安710032 第四军医大学西京医院眼科研究所西安710032

目的　探讨具有血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMCS)活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法　①将聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合 ,构建组织工程血管。②... 详细信息

目的　探讨具有血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMCS)活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法　①将聚羟基乙酸 (polyglycolicacid ,PGA)纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合 ,构建组织工程血管。②将VSMCS 置入胶原凝胶中 ,观察VSMCS 的生长状况。③观察VSMCS 胶原悬液滴入该支架材料中的生长。结果　①VSMCS 在胶原凝胶中的位置固定 ,分布于不同层次 ,约 3～ 4h逐渐形成多个胞质突起。随时间推移 ,胞质突起继续伸展 ,部分细胞呈梭形、纺锤形。②VSMCS 胶原悬液滴入胶原包埋处理的PGA支架中后 ,大部分细胞随胶原凝胶状态的形成 ,滞留于支架材料网孔中 ,细胞可沿PGA纤维表面生长。结论　胶原包埋处理的PGA纤维无纺网是良好的携带VSMCS 的多孔生物降解材料。

关键词：组织工程聚羟基乙酸血管平滑肌细胞胶原人工血管支架

人表皮生长因子受体在大肠杆菌菌膜上功能性表达

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生物化学与生物物理进展 1997年第6期24卷 557-559页

作者：王雨田胡家露高磊陈苏民杨胜利龚毅樊代明张学庸第四军医大学西京医院西安710033 第四军医大学生物化学教研室西安710032 中国科学院上海生物工程研究中心上海200233

为将人表皮生长因子 (EGF)受体膜外第Ⅲ功能区 (hEGF RⅢ )表达于大肠杆菌菌膜上 ,重组构建了EGF RⅢ表达载体 ,并转化获得大肠杆菌表达株 .放射性受体分析发现12 5I EGF可与表达菌特异性结合 ,其特异性结合量随反应的时间和温度而变化 ... 详细信息

为将人表皮生长因子 (EGF)受体膜外第Ⅲ功能区 (hEGF RⅢ )表达于大肠杆菌菌膜上 ,重组构建了EGF RⅢ表达载体 ,并转化获得大肠杆菌表达株 .放射性受体分析发现12 5I EGF可与表达菌特异性结合 ,其特异性结合量随反应的时间和温度而变化 ,Scatchard分析显示表达菌表达单一亲和性受体 ,其解离常数为 3 0× 1 0 - 11mol/L ,每个细菌约有 738个结合位点 .免疫电镜显示EGF

关键词：生长因子受体大肠杆菌功能性表达

藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定

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中华结核和呼吸杂志 2008年第10期31卷 761-765页

作者：岳晨莉史皆然师长宏张海赵雷张廷芬赵勇席丽第四军医大学西京医院呼吸科西安710032 第四军医大学实验动物中心

目的克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子（Rpf）结构域及其突变体基因，评价其生物学活性。方法采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K，用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中，将测序正确的基因... 详细信息

目的克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子（Rpf）结构域及其突变体基因，评价其生物学活性。方法采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K，用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中，将测序正确的基因插入到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，经异丙基-β—D硫代半乳糖（IPTG）诱导，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达蛋白，利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析。用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白，将纯化的蛋白加入到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性。结果获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因，测序结果与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同，突变位点与设定一致；表达蛋白相对分子质量与文献报道一致；Western blot结果显示，在相对分子质量约32000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带。通过GS-4B系统，得到纯化的GST融合蛋白，并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用，突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用。结论获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白，明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用。

关键词：分枝杆菌,耻垢微球菌,藤黄 Rpf结构域突变体生物学活性

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野生型MTS1基因导入对人膀胱癌细胞系生长抑制作用的研究

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中华泌尿外科杂志 1997年第9期18卷 545-548页

作者：袁建林惠宏襄王建波于茂生柴玉波邵国兴王中琨王成济辛建国西安第四军医大学西京医院泌尿外科第四军医大学分子生物学研究所第四军医大学病理教研室

通过逆转录病毒载体将外源野生型ＭＴＳ１基因导入该基因功能丧失的人膀胱癌细胞系Ｔ２４中，结果发现，转染ＭＴＳ１基因的膀胱癌细胞的生长速率减低，流式细胞仪检测显示Ｓ期指数及增殖指数明显降低，电镜观察显示超微结构出现生长抑... 详细信息

通过逆转录病毒载体将外源野生型ＭＴＳ１基因导入该基因功能丧失的人膀胱癌细胞系Ｔ２４中，结果发现，转染ＭＴＳ１基因的膀胱癌细胞的生长速率减低，流式细胞仪检测显示Ｓ期指数及增殖指数明显降低，电镜观察显示超微结构出现生长抑制特征，接种裸鼠无致瘤性。

关键词：膀胱肿瘤野生型 MTS1基因基因疗法