藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定

作     者：岳晨莉 史皆然 师长宏 张海 赵雷 张廷芬 赵勇 席丽 YUE Chen-li;Shi Jie-ran;SHI Chang-hong;ZHANG Hai;ZHAO Lei;ZHANG Ting-fen;ZHAO Yong;XI Li

作者机构：第四军医大学西京医院呼吸科西安710032 第四军医大学实验动物中心 

出 版 物：《中华结核和呼吸杂志》 (Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases)

年 卷 期：2008年第31卷第10期

页      面：761-765页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

基　　金：国家“863”高技术研究发展计划基金资助项目(2007AA02Z473) 国家自然科学基金资助项目(30670116) 陕西省自然科学基金资助项目(2006C218) 

主　　题：分枝杆菌,耻垢 微球菌,藤黄 Rpf结构域 突变体 生物学活性 

摘      要：目的克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子（Rpf）结构域及其突变体基因，评价其生物学活性。方法采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K，用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中，将测序正确的基因插入到pGEX-4T-1表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，经异丙基-β—D硫代半乳糖（IPTG）诱导，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达蛋白，利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析。用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白，将纯化的蛋白加入到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性。结果获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因，测序结果与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同，突变位点与设定一致；表达蛋白相对分子质量与文献报道一致；Western blot结果显示，在相对分子质量约32000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带。通过GS-4B系统，得到纯化的GST融合蛋白，并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用，突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用。结论获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白，明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用。