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DMT1和钙离子通道在星型胶质细胞和脉络丛上皮细胞铅吸收中的作用研究

DMT1和钙离子通道在星型胶质细胞和脉络丛上皮细胞铅吸收中的作用...

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作者：于海波第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景：铅是最常见的环境重金属污染物之一，在大气、水、土壤中广泛存在。铅可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入人体，吸收入血后，经过血液循环分布到各组织，可造成全身几乎所有系统和器官的损害，而其中又以中枢神经毒性作用... 详细信息

研究背景：铅是最常见的环境重金属污染物之一，在大气、水、土壤中广泛存在。铅可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入人体，吸收入血后，经过血液循环分布到各组织，可造成全身几乎所有系统和器官的损害，而其中又以中枢神经毒性作用最为受到关注。铅的神经毒性机制目前尚不完全清楚，而其在大脑中的转运和分布规律、不同组织对铅的亲和性共同影响着铅的毒性效应，因此，铅的转运和分布规律及机制是深入揭示铅神经毒性机制的研究基础和重要线索。关于铅在大脑中转运分布规律和机制目前所知甚少。以往研究发现：二价金属转运体1（divalent metal transporter1, DMT1）、钙离子通道、细胞内吞作用、阴离子交换等均可能参与了细胞的铅转运过程。但是，不同的暴露方式下，不同器官和不同类型细胞中，铅的转运方式存在很大不同，导致铅在不同组织、细胞吸收和分布的巨大差异。因此，研究铅在不同类型神经细胞转运机制的差异及其特点，阐明相关的重要分子机制，并在此基础上探讨可能的防治措施，是预防医学亟待解决的重要课题。研究目的：本研究以SD大鼠、大鼠胶质瘤细胞系C6细胞、大鼠脉络丛上皮细胞系Z310细胞为实验对象，探讨DMT1和钙离子通道在星型胶质细胞和脉络丛上皮细胞铅吸收过程中的不同作用，为阐明铅在大脑不同类型神经细胞中的转运机制、分布规律提供研究基础和科学依据。研究方法：1.建立亚慢性铅暴露大鼠模型：21d初断乳雄性SD大鼠，体重65±15g。铅暴露组饮水法给予100ppm醋酸铅，对照组饮水给予100ppm醋酸钠，无限制饮用8周。2.建立铅染毒细胞模型：大鼠胶质瘤细胞系C6细胞、大鼠永生化脉络丛上皮细胞系Z310细胞、原代星型胶质细胞分别体外培养，铅处理组细胞培养液中加入5μM醋酸铅溶液。3.采用原子吸收分光光度法检测大鼠血液，大脑海马、脉络丛及C6细胞、Z310细胞中铅含量，采用免疫荧光组化方法检测海马、脉络丛及C6细胞、Z310细胞中DMT1的表达水平及铅暴露对其表达水平的影响。4.采用Western blot、Real-time RT-PCR方法检测铅暴露对C6细胞、Z310细胞DMT1蛋白与mRNA表达水平的影响。5.采用钙荧光探针Fluo-3/AM标记技术，激光扫描共聚焦显微镜观察铅对细胞钙离子吸收的影响。研究结果：1.铅暴露后，大鼠血液、脑脊液、大脑组织中的铅水平一致性增高。2.铅对DMT1表达水平的影响：（1）免疫荧光染色结果显示：SD大鼠海马和脉络丛组织中DMT1均有较丰富的表达，低剂量慢性铅暴露并未显著影响DMT1的表达水平，C6细胞和Z310细胞中DMT1表达水平不同，Z310细胞DMT1表达荧光强度显著强于C6细胞（；2）Western-blot、RT-PCR结果显示：铅对上述两种细胞DMT1蛋白和mRNA表达水平均未产生显著影响。3. DMT1在脉络丛上皮细胞和星型胶质细胞铅吸收中的作用：（1）原子吸收分光光度法结果显示：DMT1siRNA干涉后，C6细胞和Z310细胞铅吸收均显著降低，与C6细胞相比，Z310细胞铅吸收的降低幅度更加显著；（2）使用铁螯合剂DFO使细胞处于缺铁状态，两种细胞铅吸收量出现不同程度增加；而补铁24h后，Z310细胞铅吸收量显著降低，C6细胞铅吸收水平与对照组相比无显著性差异。在细胞培养体系中同时加入等量铅与铁时，两种细胞铅吸收水平均显著降低。4.激光共聚焦显微镜结果显示：（1）对照组加入钙离子激动剂Bay K8644后，C6细胞中钙荧光强度增高，之后逐渐减弱。与对照组相比，铅预处理组C6细胞加入Bay K8644后，细胞内钙的荧光强度同样增高，其峰值强度与对照组相近，但之后减弱的速度显著加快；（2）而在铅与Bay K8644同时加入的情况下，细胞内钙荧光强度的峰值比对照组显著减弱，出现峰值的时间后移；（3）Z310细胞对照组加入Bay K8644后，细胞中钙荧光强度同样出现增强现象，但显著弱于C6细胞，之后逐渐减弱至对照组水平。与对照组相比，铅预处理组Z310细胞加入Bay K8644后，细胞内钙的荧光强度仅出现轻微增高；（4）而在铅与Bay K8644同时加入的情况下，Z310细胞内钙荧光强度的峰值与对照组接近，但之后减弱的速度慢于对照组。5.钙离子通道在脉络丛上皮细胞和星型胶质细胞铅吸收中的作用：（1）钙离子通道激动剂处理可引起C6细胞铅吸收水平显著增加，而Z310细胞无显著变化；（2）钙离子通道抑制剂处理后，C6细胞铅吸收水平显著降低，Z310细胞无显著变化。（3）CaCl2预处理未引起两种细胞铅吸收水平的显著变化；CaCl2与铅同时处理细胞时，1mmol/L CaCl2处理组细

关键词：铅 C6胶质瘤细胞永生化脉络丛上皮细胞 DMT1 钙离子通道

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粘结剂使用方式对全酸蚀树脂水门汀粘结性能影响的研究

粘结剂使用方式对全酸蚀树脂水门汀粘结性能影响的研究

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作者：高宇第四军医大学

学位级别：硕士

q现代粘结技术的发展使得微创治疗和美容修复成为可能。粘结技术的广泛开展不仅从最大程度上保存了牙体牙髓组织,同时也满足了人们对美的追求。因此,这一领域成为现代口腔医学研究最为热门的领域之一。树脂水门汀作为粘结材料的一种,... 详细信息

q现代粘结技术的发展使得微创治疗和美容修复成为可能。粘结技术的广泛开展不仅从最大程度上保存了牙体牙髓组织,同时也满足了人们对美的追求。因此,这一领域成为现代口腔医学研究最为热门的领域之一。树脂水门汀作为粘结材料的一种,由于其良好的生物安全性,优越的美学性能及与多种修复材料的可粘结性,刚一出现便得到临床工作者的广泛关注。如何充分发挥树脂水门汀的粘结优势及对其粘结性能的深入探讨已成为当前口腔粘结学研究的热点之一。根据粘结前对牙面预处理的不同,树脂水门汀可分为三类:全酸蚀粘结系统、自酸蚀粘结系统及自粘结系统。自粘结树脂水门汀系统使用前无需对牙面进行预处理,临床操作技术敏感性低。全酸蚀粘结系统虽然需要预处理牙体组织粘结面,增加了操作步骤,但文献报道多步骤粘结体系的粘结强度优于自粘结系统,使其成为美容修复的首选粘结材料。以往的研究已证实,在窝洞的直接修复中,流动性树脂可代替粘结剂在牙本质与复合树脂间形成一层坚硬不透光的物质并能获得可靠的粘结强度和粘结界面的微观形貌。同时,大量文献也报道了粘结剂与低粘度树脂水门汀之间热膨胀系数的差异、粘结剂光照时表面形成的不完全聚合层等都会对粘结界面的质量产生影响,从而降低粘结强度。但是,对于全酸蚀系统的树脂水门汀是否可脱离粘结剂直接用于间接修复体的粘结,以及粘结剂光照与否对全酸蚀树脂水门汀的粘结强度有何影响目前仍缺乏系统研究。本课题通过选用三种临床常用全酸蚀树脂水门汀,对其粘结剂不同使用方式(不使用粘结剂、粘结剂不光照固化、粘结剂光照固化)下全酸蚀树脂水门汀与牙釉质、牙本质粘结强度及粘结界面微观形态的研究,系统评价粘结剂不同使用方式对全酸蚀树脂水门汀粘结性能的影响,为临床上更合理的应用全酸蚀树脂水门汀提供理论依据。本研究结果表明: 1.对于三种树脂水门汀,粘结剂不同使用方式对其牙本质粘结性能均有显著影响。酸蚀后的牙本质表面不使用粘结剂无法与树脂水门汀形成良好粘结,SEM观察显示脱矿后的牙本质小管不能被水门汀渗入形成树脂突;粘结剂不光照固化组的粘结强度高于粘结剂光照固化组,SEM观察粘结剂光照固化组虽能形成致密的杂化层,但杂化层与树脂水门汀交界处有明显裂隙存在,粘结剂不光照固化组树脂突顶部显示致密高密度影,且与水门汀连接紧密无裂隙。 2.对于三种树脂水门汀,粘结剂不同使用方式对其牙釉质的粘结性能亦有显著影响。Rely X ARC及Calibra,无粘结剂组的粘结强度显著低于粘结剂不光照固化组和粘接剂光照固化组(p0.05)。SEM观察无粘结剂组树脂突数量较少、粗细不均,且水门汀与牙体组织间形成的结构较为疏松,而使用粘结剂的两组间粘结界面无明显差异。 3、老化试验后,三种树脂水门汀与牙本质的粘结强度,粘结剂不光照固化组仍高于粘结剂光照固化组。SEM观察显示,粘结剂不光照固化组粘结界面仍可观察到致密的高密度影像,且无明显裂隙出现;粘结剂光照固化组虽可观察到杂化层的存在,但与循环前相比,水门汀内部及其与杂化层之间的裂隙明显增大。 4、老化试验后,三种树脂水门汀与牙釉质的粘结强度,粘结剂不光照固化组度仍显著高于粘结剂光照固化组和不使用粘结剂组。SEM观察粘结剂不光照固化组的粘结界面较循环前无显著变化,而粘结剂光照固化组粘结界面微裂隙增大增多,不使用粘结剂组树脂突顶部有明显断裂现象发生。表明使用粘结剂但不单独固化有助于提高全酸蚀树脂水门汀的粘结耐久性。

关键词：全酸蚀树脂水门汀牙釉质牙本质微拉伸粘结强度扫描电镜

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糖尿病及其并发症氧化损伤机理研究

糖尿病及其并发症氧化损伤机理研究

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作者：刘树元第四军医大学

学位级别：硕士

目的 DM已成为继癌症、心血管疾病后的第三大威胁人类健康的疾病。近年来，一系列动物实验及临床研究提示氧化损伤是DM及其并发症发生发展的共同机制之一，但目前对于DM氧化损伤机理的系统研究尚未给予足够重视，尚缺乏不同层次氧化损... 详细信息

目的 DM已成为继癌症、心血管疾病后的第三大威胁人类健康的疾病。近年来，一系列动物实验及临床研究提示氧化损伤是DM及其并发症发生发展的共同机制之一，但目前对于DM氧化损伤机理的系统研究尚未给予足够重视，尚缺乏不同层次氧化损伤的系统资料。另外，动物模型是DM研究的重要前提之一，目前以STZ为基础建立的模型最为常用。近年来部分实验对STZ特异性胰岛B细胞损伤提出挑战。因此，本课题拟通过部分实验深入探讨不同层次的ROS诱发因素、发生部位、反应特点、作用阶段、损伤类型、致病过程;进一步认识DM氧化损伤机理;探讨STZ是否存在胰岛外损伤作用。方法本课题通过体外水介质体系实验，建立蛋白糖基化反应体系，研究不同干预因素对体外蛋白糖基化的影响;通过建立微粒体LPO模型系统，研究不同干预因素在亚细胞水平上对LPO的影响;通过分离、培养原代大鼠肝细胞，研究不同干预因素对肝细胞氧化／抗氧化系统及受体的影响：通过复制STZ动物DM模型，研究、验证STZ在动物整体水平胰岛外损伤作用及其机理。结果体外水介质体系实验表明：HO与ROS激发剂(CHP和VitC／Fe)对蛋白糖基化均有显著影响，呈现一定的时间-效应关系及剂量-效应关系;体外制备的AGEs在EM 440～450nm范围内具有特征性荧光光谱;GSH、LA与蛋白糖基化反应体系共育后AGEs含量均显著下降，GSH强于LA的作用，但对体系内羰基含量无明显影响;Ins糖基化反应体系中AGEs含量显著升高。肝微粒体模型系统实验结果表明：随着STZ浓度的增高，三类微粒体模型MDA含量亦相应增加;随着微粒体中D-Glu血清溶液终浓度的升高，MDA含量亦相应增加，而未观察到其水溶液有此作用：AGEs原液组MDA含量明显高于对照组和其它浓度组。细胞实验表第四军医大学硕十学位论文明:原代分离后的肝细胞呈单个分散状态，呈透亮，具有立体感的圆形细胞，台盼蓝排斥实验显示约80%细胞的胞浆及核均排斥染色:HZO:在较高浓度(80、160林mol.L一‘)下大鼠肝细胞高亲和力受体Bmaxl和Kdl明显升高，在4。林mol·L一，浓度下低亲和力受体KdZ降低;D一Glu在6.25和 ***.L一，终浓度下对大鼠肝细胞T-sOD活性和MDA含量影响不显著，但在25和50ol.L一’终浓度下T-soD活性明显降低，MDA含量显著升高;不同浓度AGES与肝细胞共育12h后，T-SOD与Mn一SOD活性均显著降低，MDA含量均显著升高;不同剂量STZ与大鼠肝细胞共育 4h后，T-SOD与Mn一SOD活性无显著变化，但在较高剂量(l .5与 ***一’)下MDA含量显著升高。动物实验结果表明:注射sTz后高剂量组动物出现多饮、多尿、多食、脱毛、体重下降，血糖呈三时相变化，而低剂量组这些变化不明显;在动物整体水平未发现Ins降糖后的模型动物MDA含量、SOD、GSH、GSSH与正常对照组具有明显差别。结论基于以上结果，初步得出以下结论:①ROS以及ROS激发体系能够促进体外蛋白质糖基化作用，具有显著的时间一效应关系和剂量一效应关系;②建立了蛋白糖基化研究的相关方法;体外制备AGEs是成功的;原位二步灌注法原代分离后的大鼠肝细胞符合本实验要求;STZ诱导的高血糖动物模型是成功的;③AGEs能促进微粒体系统及肝细胞氧化损伤，具有剂量依赖性;④GSH与LA等抗氧化剂对体外蛋白质糖基化均有显著的抑制作用，GSH强于LA的作用;⑤发现了Ins蛋白出现糖基化的体外证据:⑥初步证明了STz能引起微粒体和肝细胞广泛性氧化损伤。 ⑦体外实验初步提示血清可能存在D一Glu引发氧化损伤的重要机制;⑧ 初步证实ROS(HZOZ)对IR最大结合容量及解离常数均有显著影响，具有剂量一效应关系‘

关键词：自由基活性氧糖尿病糖基化微粒体脂质过氧化动物模型链脲佐菌素

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超声多普勒仪血流参数计量检测装置的研制

超声多普勒仪血流参数计量检测装置的研制

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作者：卫娜第四军医大学

学位级别：硕士

本课题是多普勒血流参数计量体系的一部分,旨在研制一种超声仪器实验台,为超声多普勒诊断仪的血流速度测量误差检测提供基本设施。多普勒血流参数计量体系将在以本装置为硬件基础的条件下,通过大量的测试,再依试验数据作统计分析,划取... 详细信息

本课题是多普勒血流参数计量体系的一部分,旨在研制一种超声仪器实验台,为超声多普勒诊断仪的血流速度测量误差检测提供基本设施。多普勒血流参数计量体系将在以本装置为硬件基础的条件下,通过大量的测试,再依试验数据作统计分析,划取误差限,形成标准,制定计量规程,填补计量领域的这一空白。在生物医学工程领域,医学超声多普勒技术发展迅速,取得了广泛的临床应用。但是目前的超声波仪器在测量人体血液流速时精确度较低、误差较大,可能影响临床诊断,导致误诊。通过对超声波仪器进行误差校正,可以很好的解决这一问题。目前国内这一方面的研究,尚处于起步阶段,相关的计量法规,更是一片空白。在此背景下,本课题设计了一种基于AT89C51单片机的血流类多普勒超声诊断仪的计量检测装置。课题试验台包含一个高精度计算机控制的模拟人体血液循环系统,用于对各种超声波仪器进行误差校正,以保证仪器技术参数的准确可靠安全,确保在临床上做出恰当的结论,保护忠者的生命安全和身体健康。本课题实现的计量检测装置由血液循环仿真系统、控制与测量系统、人机交互系统三大部分组成。血液循环仿真系统主要由DP构成,DP在质料的声学特性上模仿人体软组织和血液,在按已知角度埋置于TM内的管道中周流,与恒流泵和采样测量单元组合后,用非声学方法标定其流速并对超声多普勒仪测定的血流速度进行校准。它还能测量方向识别(辨别)能力、取样游标位

关键词：血流速度多普勒单片机计量控制误差

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热疗对兔VX2肿瘤细胞转移的影响

热疗对兔VX2肿瘤细胞转移的影响

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作者：苏畅第四军医大学

学位级别：硕士

目的建立兔VX2细胞系，并研究热疗对兔VX2肿瘤的体外侵袭力的影响。方法采用组织块法和消化法结合对兔VX2肿瘤进行原代培养，体外传代观察，传代40次并对培养细胞进行形态学观察、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植。实验组... 详细信息

目的建立兔VX2细胞系，并研究热疗对兔VX2肿瘤的体外侵袭力的影响。方法采用组织块法和消化法结合对兔VX2肿瘤进行原代培养，体外传代观察，传代40次并对培养细胞进行形态学观察、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植。实验组将VX2肿瘤细胞43℃加热1小时，对照组于37℃下培养，48小时后用MTT检测细胞增殖率，进行体外侵袭实验测定其体外侵袭能力，用免疫组化SABC法观察加热对兔VX2肿瘤细胞MMP-2和VEGF表达的影响。结果纯化的兔VX2肿瘤细胞形态一致，呈圆形、多角形的上皮细胞，体积小，核浆比倒置，体外连续培养8个月，传代50次以上，细胞倍增时间为26.4h，细胞周期测定G1期为74.61％，G2期为7.78％，S期为17.6％。染色体为亚三倍体核型，众数为60条。高细胞浓度可保证同种移植成瘤率，裸鼠移植可成瘤，无支原体污染。MTT法增殖能力检测发现细胞受热后增殖能力明显下降(P＜0.01)。体外侵袭实验发现细胞受热后其外迁移能力明显下降(P＜0.01)。免疫组织化学染色发现，加热后细胞MMP-2和VEGF的表达减少。

关键词：透热疗法兔肿瘤细胞,培养的肿瘤转移基质金属蛋白酶血管内皮生长因子

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Cystatin C在高压氧预处理诱导大鼠脑缺血耐受中的作用机制研究

Cystatin C在高压氧预处理诱导大鼠脑缺血耐受中的作用机制研究

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作者：吴志新第四军医大学

学位级别：硕士

背景：目前脑血管疾病已成为成年人死亡致残的第二大原因，但其治疗方法还很有限且疗效不尽人意。我们前期实验已证实，高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）预处理可显著缩小实验动物缺血再灌注损伤后梗死容积，改善神经功能表现[1,2]。在... 详细信息

背景：目前脑血管疾病已成为成年人死亡致残的第二大原因，但其治疗方法还很有限且疗效不尽人意。我们前期实验已证实，高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）预处理可显著缩小实验动物缺血再灌注损伤后梗死容积，改善神经功能表现[1,2]。在对HBO预处理的机制研究中我们证实，HBO预处理可通过上调脑缺血再灌注损伤后大鼠脑缺血半暗带组织内自噬水平，减少细胞凋亡坏死，发挥脑保护作用[3]。但HBO预处理是如何促进自噬的机制仍然不清楚，对HBO预处理脑保护机制的深入研究有助于探索新的临床干预靶点。胱抑素C（cystatin C）作为一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可作用于溶酶体系统，调节多种蛋白水解酶的活性。在氧化应激状态下，Cystatin C可显著地促进细胞存活：强烈抑制组织蛋白酶活性，保护细胞内膜结构的稳定性，并通过调节分子信号通路促进自噬，延长细胞寿命。有研究表明外源性补充Cystatin C可提高神经细胞对氧糖剥夺损伤的耐受性[4,85]。我科通过同位素标记相对与绝对定量（i-TRAQ）蛋白筛选技术发现HBO预处理后血清及脑组织中Cystatin C表达均明显提高。但Cystatin C的表达增加是否与HBO预处理脑保护作用有关，尚不清楚。基于上述研究我们推测，HBO预处理通过促进少量氧自由基产生，上调CystatinC的表达，作用于自噬关键调节蛋白mTOR，促进自噬信号通路，从而发挥脑保护效应。本实验运用SD大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）及原代神经元细胞氧糖剥夺（OGD）模型，利用siRNA干扰及外源性补充方法调节Cystatin C蛋白水平，对HBO预处理的脑保护机制进行了深入探索。实验一Cystatin C在HBO预处理诱导大鼠脑缺血耐受中的作用研究目的：探讨Cystatin C在HBO预处理脑保护中的作用及可能机制方法：1)观察HBO预处理后脑缺血半暗带区Cystatin C的表达。成年雄性SD大鼠，HBO预处理（2.5ATA，100%O2，1h/d×5d）后24h，行右侧大脑中动脉阻闭，缺血维持2h后给予再通。检测缺血前、再灌注后2、4、6、12、24h共6个时间点CystatinC蛋白表达。2) Cystatin C对HBO预处理脑保护作用的影响。应用侧脑室注射技术，通过补充外源性Cystatin C蛋白及siRNA干扰方法上调及下调Cystatin C，检测再灌注后24h后大鼠神经功能及脑梗死容积。3)观察HBO预处理后脑缺血半暗带区mTOR磷酸化及自噬水平。检测缺血前、再灌注后2、4、6、12、24h共6个时间点p-mTOR、mTOR及自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1蛋白表达。免疫荧光双标定位。结果：HBO预处理可有效减小大鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死容积，改善神经功能状况。再灌注后4h开始Cystatin C蛋白表达增加，至少可持续至24h;缺血再灌注损伤后mTOR磷酸化升高，HBO预处理可显著下调mTOR磷酸化，自再灌注后4h开始至少可持续至24h;再灌注后6h开始自噬相关蛋白LC3II及Beclin-1表达增加，至少可持续至24h，mTOR磷酸化改变主要体现在神经元细胞质中，Beclin-1主要在脑缺血半暗带区神经元核中表达。Cystatin C-siRNA抑制HBO预处理诱导的CystatinC的增加，减弱HBO预处理的脑保护作用。外源性补充Cystatin C可模拟HBO预处理发挥脑保护作用。结论：HBO预处理通过上调Cystatin C而诱导大鼠脑缺血耐受，且HBO预处理可抑制再灌注损伤后mTOR磷酸化，促进自噬。实验二Cystatin C在HBO预处理诱导原代神经元氧糖剥夺耐受中的作用及机制研究目的：观察Cystatin C是否参与HBO预处理对原代神经元的保护作用，并探讨HBO预处理是否是通过Cystatin C调节mTOR及自噬而发挥作用。方法：1) HBO预处理对原代神经元氧糖剥夺损伤后Cystatin C表达的影响。孕16-18周SD大鼠，取胚胎鼠脑皮层进行原代神经元培养。第6天行HBO预处理（3.5ATA，>90%O2，3h），24h后进行氧糖剥夺（OGD），维持2h后给予复氧复糖。复氧后24h行MTT（检测细胞存活率）、LDH漏出率（检测细胞存活状态）检测及Western Blot（检测Cystatin C蛋白的表达）。2) Cystatin C对HBO预处理脑保护作用的影响。向细胞培养液中外源性补充Cystatin C及siRNA干扰来上调及下调CystatinC，RT-PCR（检测Cystatin C-mRNA，分别于干扰后1、2、3d进行）及Western Blot(检测Cystatin C蛋白，干扰后24h进行)检测不同时间点干预措施效率，复氧24h

关键词：脑保护高压氧预处理胱抑素C 雷帕霉素目标蛋白自噬大鼠皮层原代神经元缺血/再灌注氧糖剥夺/复氧

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桑杏汤加味治疗小儿咳嗽的临床观察

桑杏汤加味治疗小儿咳嗽的临床观察

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作者：齐瑞第四军医大学

学位级别：硕士

咳嗽是儿科临床最常见的症状之一。小儿咳嗽因其病程长短不同可分为两类,咳嗽持续时间小于4周即急性咳嗽,4周及以上则归为慢性咳嗽。多种因素均可能引起小儿急性咳嗽,最多见的即由急性上呼吸道或下呼吸道感染所诱发。慢性咳嗽则是指一... 详细信息

咳嗽是儿科临床最常见的症状之一。小儿咳嗽因其病程长短不同可分为两类,咳嗽持续时间小于4周即急性咳嗽,4周及以上则归为慢性咳嗽。多种因素均可能引起小儿急性咳嗽,最多见的即由急性上呼吸道或下呼吸道感染所诱发。慢性咳嗽则是指一种非特异性的咳嗽,咳嗽为患儿主要的,甚至惟一临床症状。其位列前三位的病因是咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)、上气道咳嗽综合征(upper airway cough syndrome,UACS)和呼吸道感染后咳嗽(post infectious cough,PIC)。本研究仅关注小儿的急性咳嗽和慢性中的呼吸道感染后咳嗽。由于病原学诊断存在一定的困难,在治疗急性呼吸道感染诱发的咳嗽时,抗生素成为使用频率最高的药物。而针对感染后咳嗽,治疗中本不应该应用抗菌类药物,但是临床上也常经验性使用抗生素。因呼吸道感染后咳嗽难以与咳嗽变异性哮喘鉴别,常常需接受至少8周的吸入性糖皮质激素(inhaled corticosteroids,ICS)治疗。因此,抗生素和吸入性糖皮质激素的过度使用是儿童急性咳嗽和呼吸道感染后咳嗽中值得关注的重要问题。祖国医学在治疗儿童急慢性咳嗽方面早就已有深入的研究,也总结了相当全面的临证用药经验。本研究观察了在西药基础上加用桑杏汤加味(经验方)治疗小儿急性咳嗽和呼吸道感染后咳嗽的临床疗效,并与单纯西药组比较,目的是为小儿急性咳嗽及呼吸道感染后咳嗽提供更为合理的治疗方案,同时减少抗菌药物及激素类药物的过度使用。一、桑杏汤加味联合抗生素治疗小儿急性咳嗽的临床观察目的:观察桑杏汤加味联合抗生素治疗小儿急性咳嗽的临床疗效。方法:选取2015年3月016年6月就诊于西京医院儿科的288例急性咳嗽患儿,按家长意愿将患儿分为两组:联合用药组和单纯西药组。联合用药组共有病例数为158,包括急性上呼吸道感染患儿62人,急性气管支气管炎68人和急性肺炎28人;单纯西药组共有病例数为130,包括急性上呼吸道感染患儿50人,急性气管支气管炎58人和急性肺炎22人。联合用药组给予口服桑杏汤加味,联合抗生素治疗;单纯西药组的治疗仅给予抗菌药物。两组在上述治疗的基础上都给予对症西药治疗。比较两组患儿的平均疗程,抗生素使用时间、种类,静脉用抗生素时间,3个月内呼吸道感染复发的情况。结果:联合用药组平均疗程低于单纯西药组。抗生素使用时间,使用抗生素种类,静脉使用抗生素的时间方面均明显低于单纯西药组,差异有统计学意义(P0.05)。中药组与对照组组间比较显示,中药组患儿1疗程后咳嗽、咳痰积分明显下降,与对照组积分下降相比有统计学意义(P<0.01)。用药1疗程后,中药组总有效率高达92.2%,口服孟鲁斯特钠咀嚼片组为48.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。此外,治疗组中第1疗程的4例无效患儿修正诊断为咳嗽变异性哮喘。结论:桑杏汤加味治疗小儿呼吸道感染后咳嗽较孟鲁斯特钠咀嚼片疗效好,可缩短病程,未发现不良反应。并且有可能作为小儿慢性咳嗽的一种诊断性治疗方法,减少呼吸道感染后咳嗽患儿吸入性糖皮质激素的使用。

关键词：急性咳嗽呼吸道感染后咳嗽中医药治疗桑杏汤加味抗生素

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基于3G网络的远程心电监护系统研制

基于3G网络的远程心电监护系统研制

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作者：张朋第四军医大学

学位级别：硕士

便携式远程心电监护系统是一种以无线移动通信网络为框架的新型监护系统，一般由若干便携式监护终端设备、无线移动通信网络、医院监护中心系统组成。经过多年的研发，便携式远程监护系统取得一定进展，但是传统的远程监护系统大多是以G... 详细信息

便携式远程心电监护系统是一种以无线移动通信网络为框架的新型监护系统，一般由若干便携式监护终端设备、无线移动通信网络、医院监护中心系统组成。经过多年的研发，便携式远程监护系统取得一定进展，但是传统的远程监护系统大多是以GPRS或者CMDA1x网络作为移动通信网络，普遍存在着传输速度低、信号稳定性差等问题。随着网络技术和软硬件技术的不断进步，远程心电监护系统也需要不断发展和改进。本文的研究工作主要是在总结国内外研究成果的基础上，以3G移动通信网络为技术框架，研制开发远程心电监护系统的便携式监护终端部分和医院监护中心系统。便携式监护终端使用发射功率低、传输稳定的SIM5216模块作为3G无线通信模块。配置必要的外围电路并且植入嵌入式操作系统，实现心电信号的采集、存储、发送、医嘱信息的接收以及人机交互等功能。医院监护中心系统采用网络技术、数据库技术实现信号的接收、存储、分析、回放以及医嘱信息发送等功能。本研究主要完成以下几个方面的工作： 1、完成便携式监护终端的硬件设计，采用性能先进的SIM5216模块作为3G无线网络通信模块，该模块以半串口方式连接到CPU，在命令和数据两种状态下和CPU通讯。监护终端包括心电信号预处理系统和嵌入式硬件系统，预处理系统采用放大、滤波等方法处理心电信号，将放大1000倍的心电信号送入采样电路。嵌入式的硬件系统以S3C2440为中央处理单元，配置了RAM、 ROM、液晶显示屏、触摸屏等外围设备。 2、完成便携式监护终端的软件设计，为实现监护终端的3G无线移动网络通信功能，配置内核支持PPP协议，在根文件系统中添加3G拨号程序和脚本文件，确保开机后自动拨号上网，在掉线后自动重拨，应用程序设计中采用TCP协议来实现数据交互。此外，监护终端还具备信号采集、医嘱管理等功能。 3、完成医院监护中心系统的软件设计，建立TCP服务器线程监听来自3G网络端口的连接请求，收到请求以后建立连接并接收数据。监护中心系统采用SqlServer数据库驱动，分别建立患者信息表、心电信息表、医嘱信息表、报警信息表，统一管理数据信息。医院监护中心系统具备一定的诊断功能，主要是通过分析RR间期来计算患者的心率，判断心动过速、早搏、停搏等病情。医生在做出诊断以后，通过数据通信方式将医嘱信息发送到便携式监护终端。本研究主要创新点在于： 1、将3G移动通信技术引入到移动监护系统，设计了一种适合3G移动通信网络的远程监护终端，提供一种实时无线的监测手段，保证系统能够在移动通信网络覆盖的范围内使用。 2、建立了与3G网络相适应的医院监护中心系统，监听来自便携式终端的连接请求，实现数据交互。探讨了中心监护系统心电数据的存储方法，以数据库和文件系统相结合的形式，实现心电信号的存储和读取功能。 3G移动网络通信技术可应用于多种心脏病如各种心律失常、心肌缺血、传导障碍的监护，各科病人的手术中监护和术后观察的各项监测。也可以用于危重患者在长短途转运过程中的监护，缓解ICU资源紧张的局面。3G技术的临床应用在改善医疗条件，为医疗安全提供新保障方面具有重要意义。

关键词： 3G网络远程监护互联网嵌入式系统

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丹参调节AQPs表达诠释“活血利水”之亚法本质的研究

丹参调节AQPs表达诠释“活血利水”之亚法本质的研究

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作者：董晓静第四军医大学

学位级别：硕士

张仲景《金匮要略》记载，“血不利则为水，血水本同源”，提示“血与水”生理上相互化生且功用相近，病理上“瘀水关联”。《血证论》提出“凡调血，必先治水，治水即以治血，治血即以治水”的中医血证治疗思想，基于此创立“活血利水... 详细信息

张仲景《金匮要略》记载，“血不利则为水，血水本同源”，提示“血与水”生理上相互化生且功用相近，病理上“瘀水关联”。《血证论》提出“凡调血，必先治水，治水即以治血，治血即以治水”的中医血证治疗思想，基于此创立“活血利水”法。“活血利水”法是临床治疗瘀血及水肿病的理论依据。其本质主要体现“活血促进利水与利水益于活血”两个方面，即“活血消肿”与“活血利尿”两种亚法。因此，从临床实践与药理研究探索“活血利水”法本质，应以“消肿与利尿”为切入点。水通道蛋白（Aquaporin，AQPs）是一种细胞膜糖蛋白，与水通透性（吸收、分泌、转运）有关、维持细胞内外水平衡。AQPl广泛分布于与水分泌和吸收有关的上皮细胞和内皮细胞。AQP1是红细胞（Red Blood Cell，RBC）膜的主要水通道蛋白，调节血液与红细胞内水液转运。AQP1在肾脏主要集中于近曲小管（Proximal Tubule，PT）上皮细胞和髓袢的细段，参与水的重吸收和尿浓缩。RBC变形能力与“血瘀证”发生密切相关，而肾组织水肿与AQP1蛋白表达降低有关。可见AQP1的表达变化与组织血瘀、水肿关系紧密，与中医“消肿”作用相关。AQP2在肾脏主要表达于远端小管和集合管（collecting duct，CD）主细胞顶膜，参与尿浓缩和稀释。因此肾脏AQP1和AQP2功能与“利尿”作用相关。我们认为AQP1和AQP2是揭示“活血消肿”和“活血利尿”本质的关键分子。血管内皮细胞（Vascular endothelial cell，VEC）是衬覆于血管内壁的一层扁平细胞，不仅是构成血管通透性的主要屏障，并且可以合成及分泌多种物质，直接参与体内的病理生理过程。VEC损伤后既能导致血管扩张、血小板黏附和聚集降低，血液黏度下降;又能导致血管收缩、微循环血流减少，血液淤积;这两者均伴随水肿的形成。VEC和RBC与微循环障碍关系最为密切。RBC变形能力调节血液黏度和微循环有效灌注，与《素问调经论篇》所载“病在脉、调之血，病在血、调之络”的理论不谋而合。而且AQP1在VEC有表达，是调节水液转运的重要水通道蛋白，AQP1表达变化必然会导致组织间水液变化。因此VEC是揭示“活血利水”之亚法本质的重要效应位点。丹参（Salvia Miltiorrhiza Bunge，Salvia）又名赤参，是双子叶植物唇形科植物干燥根及根茎。具有“活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神”功效。丹参可以降低血液粘度、抑制血小板聚集、抗血栓形成、改善微循环又能减轻VEC损伤、降低血管通透性，减轻血管源性水肿[3]。同时丹参还可以调节AQPs表达。我们前期研究认为，“活血法”与AQP1及AQP2表达变化有关，而AQP1和AQP2是机体内部调节水液平衡的主要水通道蛋白，因此推测“活血利水”法可能与AQP1和AQP2的表达变化关系紧密。“活血利水”法分为“活血消肿”和“活血利尿”两个亚法，我们推测“活血消肿”作用可能与表达于VEC及近端小管上皮细胞的AQP1变化有关，“活血利尿”作用可能与表达于远端小管和集合管主细胞的AQP2有关。实验一：丹参调节损伤局部肌肉及肾组织AQP1表达变化目的探讨丹参对损伤局部、肾组织AQP1表达的变化，揭示“活血消肿”作用的内涵。方法SPF级雄性SD大鼠50只，随机分为正常组、模型组，分别为10只、40只。模型组再分为空白组、丹参组、干预组、抑制组，每组10只。采用“定量打击”法制备模型。运用血液流变学检测全血黏度及红细胞变形能力;应用HE染色观察大鼠损伤局部肌肉与肾组织病理变化;电镜观察局部肌肉与肾组织微观结构改变;观察大鼠局部肌肉与肾组织湿/干质量比值变化;运用免疫组织化学（ICC）检测方法和Western blot检测方法分析大鼠局部肌肉和与肾组织AQP1表达变化。揭示了血瘀证模型局部肌肉及肾组织的瘀血与水肿跟AQP1表达变化有关，通过丹参对AQP1表达的调节诠释“活血消肿”作用的内涵。结果1.与正常组比较，空白组大鼠精神萎靡不振，损伤后肢皮肤出现紫红肿胀，跛行。饮食量明显减少，饮水量增多，尿量增多。丹参组大鼠较空白组后肢肿胀程度明显减轻，抑制组无明显缓解。2.局部肌肉与肾组织湿/干质量比值示：与正常组比较，空白组湿/干质量比值明显升高（P病理结果：空白组大鼠损伤肌纤维索周围见大量增生毛细血管，大量淋巴细胞、浆细胞等单核细胞为主的炎症细胞。肾组织出现肾小球囊腔有不同程度的扩张，并有瘀血，上皮细胞增生。VEC管腔狭窄、RBC聚集。肾小管扩张，上皮细胞肿胀变性。丹参组肌肉皮下瘀血情况好转，损伤肌纤维索周围增生的毛细血管减少，炎症细胞消失，接近正常组肌纤维结构。肾组织示肾小管-间质病变有改善，少数间质毛细血管轻度充血

关键词： “活血利水”法活血消肿/活血利尿水通道蛋白-1/水通道蛋白-2 血瘀证/外伤血瘀证丹参血管内皮细胞近端小管上皮细胞集合管主细胞红细胞

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同种异体骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植治疗兔角膜碱烧伤的实验研究

同种异体骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植治疗兔角膜碱烧伤...

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作者：郭梁第四军医大学

学位级别：硕士

1骨髓间充质干细胞与角膜缘上皮细胞的体外培养与鉴定骨髓间充质干细胞在10%FBS的DMEM培养基中培养,角膜缘上皮细胞在EpiLife?培养基、含激素和5%FBS的D/F12培养基、低钙的KSFM培养基中分别培养。将培养的MSCs进行体外成脂和成骨诱导,... 详细信息

1骨髓间充质干细胞与角膜缘上皮细胞的体外培养与鉴定骨髓间充质干细胞在10%FBS的DMEM培养基中培养,角膜缘上皮细胞在EpiLife?培养基、含激素和5%FBS的D/F12培养基、低钙的KSFM培养基中分别培养。将培养的MSCs进行体外成脂和成骨诱导,以鉴定MSCs (这种经过诱导的MSCs不用于体内移植)。RT-PCR和免疫细胞化学染色检测LECs中角膜缘干细胞、角膜上皮瞬时扩增细胞、角膜上皮终末分化细胞的表达:ABCG2、PCNA、CX43、CK3、CK12。体外结果表明,MSCs与LECs原代培养24小时贴壁,7天铺满,MSCs为成纤维样生长,LECs呈上皮样生长。油红和茜素红染色阳性表示MSCs的成脂和成骨分化能力。RT-PCR检测培养的LECs中有角膜缘干细胞ABCG2、瞬时扩增细胞CX43、终末分化细胞CK3/12表达。免疫细胞化学染色同样证实了LECs中有角膜缘干细胞ABCG2表达,以及细胞增殖性标志物PCNA表达。体外培养了移植用的MSCs与LECs。MSCs经过诱导,向成脂和成骨分化。培养的LECs中有具有克隆扩增能力的角膜缘干细胞成分。 2脱细胞角膜材料的制备与生物学测量取新鲜角膜,制备DPC:-80oC冻30分钟,解冻后4oC蒸馏水溶胀12-18小时,切取前板层角膜片,室温下0.25%胰酶消化30分钟,1mol/L NaOH浸泡2小时,40U/ml DNA/RNA酶处理30分钟,振荡洗涤,37oC 10%海藻糖浸泡2小时,-80oC预冻1小时,冷冻干燥机冻干16小时,60Co照射消毒。将DPC、人羊膜(HAM)、兔角膜(RC)复水,测量3种材料的光学特性和机械强度。阿贝折射仪测量折射率,PE分光光度计测量透射率,小型英斯特朗仪测量抗拉强度和弹性模量。 DPC的折射率是1.3313,HAM是1.3322,RC是1.3340。DPC的透射率是50%, HAM是70%, RC是92%。DPC的抗拉强度是2.4MPa,HAM是3.6MPa,RC是4.5MPa。DPC的弹性模量是3.8MPa,HAM是0.78MPa, RC是5.3MPa。结果表明,脱去了细胞成分的角膜材料有与羊膜相似的光学特性和机械强度。 3骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜材料移植治疗兔角膜碱烧伤 MSCs和LECs标记PKH26后接种于DPC材料表面,体外培养MSCs-DPC植片与LECs-DPC植片。麻醉兔,将浸泡过1mol/L NaOH的滤纸置于角膜表面,诱发新生血管后角膜随机分为4组:MSCs-DPC移植组,LECs-DPC移植组,DPC移植组,碱烧伤组(不做移植)。在碱烧伤角膜上制作板层植床,分别将MSCs-DPC、LECs-DPC、DPC植片缝合于受损植床,术后,细胞移植组的眼表覆盖软性接触镜,LECs移植组给与0.3%地塞米松、1%环孢霉素A滴眼液点眼。连续随访4个月,从角膜透明度、新生血管、存活率方面观察MSCs-DPC移植后碱烧伤角膜的愈合情况并评分。移植后4个月内,对移植组和碱烧伤组角膜进行取材、固定、包埋、切片。做HE染色、Masson三色染色、PKH26示踪检查,同时检测MSCs移植后是否转分化表达角膜上皮标志物。透射电镜超薄切片染色观察细胞连接。MSCs移植后5周内收集移植组和碱烧伤组的角膜,Real Time PCR测定MIP-2的表达。临床观察表明,在MSCs-DPC移植组和LECs-DPC移植组,角膜能较快恢复透明,而且新生血管较少。在第1个月,未接受移植的碱烧伤角膜呈现广泛的混浊水肿和新生血管;相比之下,MSCs-DPC和LECs-DPC移植后角膜的炎性混浊和新生血管化程度均明显减轻。在第4个月,MSCs移植组的角膜恢复了透明和无血管化;而碱烧伤组的角膜形成了瘢痕和血管翳;在DPC单独移植组,4个月后角膜中央区仍有白斑。统计学分析表明,MSCs移植组和给药的LECs移植组的角膜透明度和无血管化恢复较快,而且更长时间保持角膜透明。在第2个月,MSCs移植组和LECs移植组的角膜表面都检测到了PKH26表达。在MSCs组的PKH26阳性位点,没有检测到CK3/12表达。这表明MSCs移植后存活于角膜表面,但并没有转分化为上皮细胞。为了验证临床结果,我们观察了MSCs-DPC移植到碱烧伤角膜后角膜愈合的组织病理过程。在MSCs移植后第1个月,HE和Masson Trichrome染色能清楚地观察到前板层角膜中的DPC纤维和新生的胶原纤维,炎性细胞浸润和新生血管局限在板层植片周围,植片表面被覆3-4层细胞。同样在第1个月,碱烧伤组的角膜水肿变厚,炎性细胞浸润和新生血管广泛。在MSCs移植到碱烧伤角膜后第2-3个月,DPC大部分降解,有新生组织形成,而且,碱烧伤角膜的炎性细胞浸润和新生血管明显消退,这时仍

关键词：骨髓间充质干细胞脱细胞角膜材料移植角膜碱烧伤疗效

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