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表面肌电图在吞咽功能检查中的应用

表面肌电图在吞咽功能检查中的应用

作者：张杰南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景吞咽是食物经咀嚼而形成的食团由口腔经咽和食管入胃的整个过程,吞咽不是一个单纯的随意活动,是人类复杂而必需的行为之一。吞咽分为口腔期、咽期和食管期三个阶段,受大脑皮层、皮质延髓束、脑干神经核、吞咽中枢和第Ⅴ、Ⅶ、... 详细信息

研究背景吞咽是食物经咀嚼而形成的食团由口腔经咽和食管入胃的整个过程,吞咽不是一个单纯的随意活动,是人类复杂而必需的行为之一。吞咽分为口腔期、咽期和食管期三个阶段,受大脑皮层、皮质延髓束、脑干神经核、吞咽中枢和第Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ对脑神经控制,每个阶段细微的功能紊乱均可导致吞咽功能紊乱或障碍。随着我国步入老龄时代,生活方式的巨变导致脑卒中和颅颈部外伤明显增多。脑外伤、颅内和颅底手术的广泛开展、头颈肿瘤手术和放疗等因素,各种原因引起的吞咽障碍的发病率明显增高。吞咽障碍涉及多个学科,主要有耳鼻咽喉头颈外科、神经内科、神经外科、消化内科、放疗科、康复医学科等,但没有受到这些学科的重点关注。当前吞咽功能检查方法较多,各有优缺点,大体上包括临床评估与仪器检查。临床评估可分为：①主观评估：指医生根据患者的主诉,询问病史,从主观上发现患者是否存在吞咽障碍;②客观评估主要有反复唾液吞咽试验、洼田饮水试验和经口摄食功能量表。它们的优点是快速、简单、无创,而缺点是需要患者认真配合,依据患者的临床症状及主观感受来对吞咽功能进行评估,其敏感性和特异性各家报道差别较大。仪器检查中吞咽造影检查和内镜检查用的比较广泛。吞咽造影检查(Videofluoroscopic swallowing examination, VFSE),又称动态吞咽检查(Dynamic swallow study, DSS),即在X线透视下,针对口、咽、喉、食管的吞咽运动所进行的特殊造影,通过对录像的逐帧分析了解吞咽状况,临床上目前使用较广泛,缺点是有放射线;内镜吞咽检查法是用纤维喉镜等检查咽喉的解剖结构及唾液的潴留情况,其操作方法简便灵活,不同程度的患者都可接受此检查,能在床旁、甚至在ICU中进行,此检查还能发现喉部黏膜水肿情况、有无肉芽、溃疡和声带麻痹、喉气管狭窄等异常变化,但是其缺点是,着重于局部的观察,对吞咽的全过程、解剖结构与食团的关系以及环咽肌和食管的功能方面得到的信息不多。由于吞咽时内镜的视野消失,仅可在吞咽前后进行观测,不能观测食团在吞咽时的基本运动情况,同时对咽期的检测仍不够全面,不能评测口腔期和食管期的变化以及舌和喉之间的运动协调性。表面肌电图,也称动态肌电图,是一种安全、简单、无创有关肌肉功能状况的检查手段。近20年来,国外已有学者运用表面肌电图作为吞咽障碍的筛查诊断的首选方法,它可以对所查肌肉进行工作情况、工作效率的量化,指导患者进行神经、肌肉功能训练,但国内尚无此类研究的报道。目的 1.通过对正常成人做表面肌电图研究,建立吞咽过程中肌肉活动持续时间和振幅的正常数据库。 2.研究咽异感症患者吞咽表面肌电图变化,探讨咽异感症的病因。 3.研究吞咽表面肌电图用于评估扁桃体切除术后病人疼痛程度的可能性。方法 1.研究对象： 1.1第一章选取126例健康成人志愿者,所有受试者均通过社会招募,在签署知情同意书后在海军总医院耳鼻喉科肌电图室进行吞咽的表面肌电图检查,该研究经过海军总医院伦理委员会批准。志愿者招募时间为2012年5月至2012年12月,入选标准：①年龄≥18岁,≤65岁;②神志清楚;③无耳鼻喉科及胃肠病病史,无吞咽困难、吞咽痛病史;④愿意接受评定。最终招募了126位成年人,其中女性60例,男性66例;年龄范围18-65岁,并按年龄分成4组：医学疾病或药物可能影响吞咽的病史;②耳鼻咽喉科内镜检查和下咽食管造影均无异常器质性病变和误吸,所有的受试者都有正常的口腔解剖结构。凡有扁桃体病变,咽部角化症、下咽恶性肿瘤、会厌囊肿、茎突过长等都排除。最终34例咽异感症病人入组,年龄20—66岁,其中女性17人,男性17人。 1.3第三章选取2013年5月-2013年12月份在我院行扁桃体切除术的患者32名,男性15名,女性17名。年龄分布20-60岁。选取标准：①患者年龄>20岁,面肌电图的设备是丹麦Alpine Biomed公司的KEYPOINT全功能肌电诱发电位仪。采用的软件是Keypoint. Classic。记录每次吞咽时肌肉活动的持续时间以及振幅。 2.2表面电极放置的位置：与吞咽相关的肌群主要有以下4对：①口轮匝肌;②咬肌;③颏下肌群包括二腹肌前腹、下颌舌骨肌、颏舌肌;④舌骨下肌群。这些肌肉位置表

关键词：表面肌电图吞咽吞咽障碍咽异感症扁桃体切除术疼痛

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540例口腔癌及口咽癌的临床病例分析

540例口腔癌及口咽癌的临床病例分析

作者：李军福建医科大学

学位级别：硕士

口腔癌(oral cancer)是指发生于口腔及其邻近解剖结构的恶性肿瘤，在WHO最新版的国际疾病分类系统中，口腔癌与发生于咽部的癌症归为一类，称为口腔、咽癌或简称口腔癌，其发病部位包括唇、舌根、舌其他部位、牙龈、口底、腭、颌骨等口... 详细信息

口腔癌(oral cancer)是指发生于口腔及其邻近解剖结构的恶性肿瘤，在WHO最新版的国际疾病分类系统中，口腔癌与发生于咽部的癌症归为一类，称为口腔、咽癌或简称口腔癌，其发病部位包括唇、舌根、舌其他部位、牙龈、口底、腭、颌骨等口腔其他部位、腮腺、其他大唾液腺、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窦、下咽、口腔、咽其他部位。口腔颌面部恶性肿瘤的发病机理近年来被认为是一个多因素、多致病条件、多原性的。其致病因素目前被广泛报道、已被大众所接受的大致有：烟草、过多的酒精、放射线及口腔内粘膜长期存在的刺激，近年来关于其遗传方面及病毒学感染方面的研究越来越多，其患病年龄呈现出年轻化的趋势，并且其发病构成比情况在发生变化，女性患者逐渐增加。口腔颌面部恶性肿瘤特别是口腔癌及口咽癌，其容易伴发颈部淋巴结转移或全身其他器官的转移，目前关于口腔颌面头颈部二原发或多原发恶性肿瘤的研究逐渐增加，越来越多的临床医生注意到肿瘤二原发的情况的出现，二原发肿瘤的治疗目前存在一定的难度，为患者及临床医生所面临的一个难题。随着现代医学技术的发展进步，口腔颌面部恶性肿瘤的诊断准确率增加，其为治疗提供了良好的技术支持。目前关于口腔颌面部恶性肿瘤的治疗主要是以外科手术治疗为主，辅助以术后放射治疗及术前或术后的化学治疗。本文根据统计2009-2013年间于福建医科大学附属第一医院诊疗的口腔癌患患者，进行流行病学资料的统计分析，结果显示,于我科就诊的口腔癌患患者的流行病学情况大致同已报告文献资料相符，如，大多数口腔癌患术后病理结果显示为鳞状细胞癌（71.3%），年龄构成比中老年患者（年龄≥55,62.22%），性别构成比（男62.96%，女37.04%）等。结合这些临床资料数据，可以提示目前就诊我院的口腔癌患的一些构成比的变迁，目前新的诊治及治疗技术的改进等。

关键词：口腔癌构成比发病治疗

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北京同仁医院颅底疾病诊疗学习班第一轮通知

中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2014年第3期49卷 217-217页

由首都医科大学附属北京同仁医院神经外科、耳鼻咽喉头颈外科、颅面创伤中心联合主办的颅底疾病诊疗学习班将于2014年5月9—11日在北京举办。学习班由王琪、周兵、房居高、夏寅等国内知名耳鼻咽喉头颈外科专家，以及放射科专家和国内知... 详细信息

由首都医科大学附属北京同仁医院神经外科、耳鼻咽喉头颈外科、颅面创伤中心联合主办的颅底疾病诊疗学习班将于2014年5月9—11日在北京举办。学习班由王琪、周兵、房居高、夏寅等国内知名耳鼻咽喉头颈外科专家，以及放射科专家和国内知名杂志主编授课，内容包括对累及头颈部、鼻腔、口腔的颅底复杂肿瘤和外伤的治疗及经验认识，医学论文常见错误的修改，此外还有精彩的疑难病例讨论和手术录像解析。

关键词：首都医科大学附属北京同仁医院学习班颅底耳鼻咽喉头颈外科诊疗疾病疑难病例讨论放射科专家

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北京同仁医院颅底疾病诊疗学习班第一轮通知

中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2014年第4期49卷 282-282页

关键词：首都医科大学附属北京同仁医院学习班颅底耳鼻咽喉头颈外科诊疗疾病疑难病例讨论放射科专家

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北京同仁医院颅底疾病诊疗学习班第一轮通知

中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2014年第2期49卷 176-176页

关键词：首都医科大学附属北京同仁医院学习班颅底耳鼻咽喉头颈外科诊疗疾病外科专家放射科专家

神经生长因子及其受体在涎腺腺样囊性癌中的表达以及和神经周侵袭关系的探讨

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神经生长因子及其受体在涎腺腺样囊性癌中的表达以及和神经周侵袭...

作者：尚德浩中国医科大学

学位级别：硕士

前言涎腺腺样囊性癌是头颈部涎腺常见的恶性肿瘤，其发生率约占全部涎腺肿瘤的9.95％，涎腺恶性肿瘤的24％。因其特异性的出现沿神经和血管的侵袭而倍受关注，患者常出现局部的感觉异常、疼痛、麻木，甚至舌瘫、面瘫等。神经... 详细信息

前言涎腺腺样囊性癌是头颈部涎腺常见的恶性肿瘤，其发生率约占全部涎腺肿瘤的9.95％，涎腺恶性肿瘤的24％。因其特异性的出现沿神经和血管的侵袭而倍受关注，患者常出现局部的感觉异常、疼痛、麻木，甚至舌瘫、面瘫等。神经生长因子主要来源为唾液腺、前列腺、蛇毒腺、胎盘组织以及脑内胆碱能神经元支配区，以成年雄性小鼠颌下腺中含量最高，许多细胞(包括一些肿瘤细胞)在体外培养下能产生NGF。作为典型的神经营养因子，它具有广泛的生物学效应：能维持神经节细胞的存活;诱导外周神经节的轴突生长，使轴突向NGF的方向定向生长;能使感觉神经节及交感神经节数目增加，体积增大，神经纤维延长，在神经系统损伤后起修复、营养作用。NGF是通过与细胞表面的NGF受体(T(?)kA和p75)结合内化转运至核周体，进而与细胞核受体结合，引起细胞凋亡等一系列的生物效应。近来有实验表明神经营养因子及其受体可以通过促进肿瘤血管形成，增加肿瘤细胞分泌的肝素酶活性等方式促进肿瘤的侵袭和转移。但在涎腺腺样囊性癌侵袭和转移过程中是否有它们的参与，目前尚未见报道。本研究拟应用免疫组化技术验证NGF及其受体TrkA和p75在正常涎腺及涎腺腺样囊性癌中的表达情况，探讨其与腺样囊性癌浸润性生长和神经周侵袭之间的关系。材料和方法本研究收集1995年1月至2001年12月中国医科大学第一临床学院口腔颌面外科手术病理回报为腺样囊性癌的组织标本21例，所有标本切成5μm厚的切片，苏木素-伊红染色，经两位病理学教授根据WHO涎腺肿瘤组织学1991年分类标准确诊并分类。对照组取自腮腺区外伤以及舌下腺囊肿患者的正常涎腺组织8例。腺样囊性癌病例中男性9例，女性12例。年龄最大的72岁，最小的30岁，平均年龄52岁。其中来自腮腺6例，颌下领下腺5例，舌下腺3例，愕部5例，上领窦1例，舌根1例。应用免疫组织化学方法(sABc法)检测NGF及其受体肠kA和夕5“TR 在正常涎腺和涎腺腺样囊性癌中的表达，阴性对照省略第一抗体，用PBS 缓冲液代替，阳性对照应用大鼠脑组织切片。 NGF，p75NT“，予改A着色强度分级:其阳性表达为棕黄色颗粒状，定位于细胞质及细胞膜。根据切片中阳性细胞所占同类观察细胞总数的百分比和阳性细胞的着色强度两项指标，将观察材料分成4组，即:腺细胞，导管细胞以及肿瘤细胞无着色或个别细胞胞浆淡黄色着色，着色细胞数少于细胞总数的5%为(一);胞浆浅黄色，着色细胞数占细胞总数的5%一25%为 (+);胞浆棕黄色，着色细胞数占细胞总数的25一50%为(++);胞浆深棕色，着色细胞数占细胞总数的50%以上为(一)。实验结果利用sPsslO.O统计学软件对其进行校正的行x列表xZ检验，显著性差异闭值为P肿瘤细胞中出现胞浆NGF阳性染色，其中3例强阳性，8例中等强度阳性，6例弱阳性，4例阴性。同时在肿瘤细胞胞浆中可见价SNT“阳性染色，其中6例中阳性，10例弱阳性，5例阴性。其中NGF和夕5“TR都阳性的14例，单独NGF阳性3例，单独价SNT“阳性2例，NGF及夕5”TR均阴性2 例。SACC肿瘤细胞中未见升kA阳性染色。在部分标本的间质及神经纤维中发现NGF的表达。 NGF在腺样型，管状型及实质型SACC中的阳性率分别为78%，85% 和80%，三者之间无显著性差异。P75姗在腺样型，管状型及实质型sACC 中的阳性率分别为80%，83%和60%，三者之间无显著性差异。结论 1.在正常涎腺的导管细胞中有NGF的表达。 2.在头颈部原发的腺样囊性癌细胞中有NGF及其受体价SNT“的阳性表达。NGF和夕SNT“可能通过自分泌和/或旁分泌机制促进肿瘤的浸润性生长和远处转移。 3 .NGF及其受体价SNT“的表达与腺样囊性癌的分类无关。 4.在肿瘤周围的神经纤维中发现了NGF的表达，据此推测SACC肿瘤细胞与神经纤维存在相互作用，促进了神经周侵袭的发生。

关键词：癌,腺样囊性免疫组织化学神经生长因子 TrkA p75NTR

miR-21在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

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miR-21在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

作者：范孟钊河北医科大学

学位级别：硕士

目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)为口腔颌面部常见恶性肿瘤之一;OSCC常发生在400岁的成人,男性多于女性,好发部位以舌、牙龈、颊、腭为多见。OSCC发展迅速,早期可向区域淋巴结转移,晚期可发生远处转移,严重影... 详细信息

目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)为口腔颌面部常见恶性肿瘤之一;OSCC常发生在400岁的成人,男性多于女性,好发部位以舌、牙龈、颊、腭为多见。OSCC发展迅速,早期可向区域淋巴结转移,晚期可发生远处转移,严重影响患者的生活质量,甚至威胁生命。尽管OSCC在治疗方面已取得了很大的进展,但是死亡率仍然居高不下,因此如何实现早期预防、早期诊断及有效治疗,是现代医学界关注的问题之一。近年来的研究热点集中于口腔鳞状细胞癌中异常表达基因的筛选,以助于OSCC的早期发现和辅助治疗,提高临床治愈率及生存率。有研究发现miR21在头颈部肿瘤组织中表达明显增高,在舌鳞状细胞癌方面研究发现组织中miR-21异常表达更为显著。同时我们在前期的实验研究中发现在口腔鳞状细胞癌患者外周血清中存在异常表达的miRNA。那么miR-21在口腔鳞癌组织中的表达是否与肿瘤分化程度有关,目前仍不清楚,因此本研究拟通过比较口腔鳞癌组织和口腔正常黏膜组织中miR-21的表达情况并分析其与肿瘤分化程度的关系,探讨口腔鳞状细胞癌发病机制,并为口腔鳞状细胞癌的早期诊断、早期治疗提供实验依据和理论基础。方法:选取河北医科大学第四医院口腔颌面外科2016年9月至2017年9月初诊为口腔鳞状细胞癌26例,行手术切除并病理证实高分化者10例,中分化者7例,低分化者9例。切取口腔鳞状细胞癌患者组织和口腔正常黏膜组织(肿瘤边缘2.0cm以上)作为实验组和对照组。采用实时荧光定量PCR方法分别检测口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织标本及口腔正常黏膜组织标本中miR-21的表达水平。结果:1.口腔鳞状细胞癌组织及口腔正常黏膜组织ODA260/A280比值均在1.8-2.0之间,标本纯度符合要求。2.口腔鳞状细胞癌组织及口腔正常黏膜组织中miR-21的相对表达量分别为2.401±0.94、0.632±0.15,二者比较差异具有统计学意义(F=99.46,P口腔高、中、低分化鳞状细胞癌组织中相对表达量分别为2.063±0.81、2.034±0.85、2.739±0.97,低分化鳞状细胞癌组织中较中、高分化鳞状细胞癌组织中增高更为显著P=0.0242(P口腔鳞状细胞癌组织中表达上调,且其高表达与患者的肿瘤分化程度密切相关,提示miR-21可能在口腔鳞状细胞癌的发生、发展中发挥了重要作用。

关键词：口腔鳞状细胞癌组织 miRNA miR-21 肿瘤分化核苷酸

莱菔硫烷抑制人腺样囊性癌裸鼠移植瘤的体内实验研究

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莱菔硫烷抑制人腺样囊性癌裸鼠移植瘤的体内实验研究

作者：刘吉伦河北医科大学

学位级别：硕士

目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC），是一种口腔颌面外科最常见的恶性涎腺上皮来源性肿瘤。它有嗜神经血管性生长特点，有着较强的局部侵袭性，因而容易发生血行性远处转移等生物学特性;同时该病恶性程... 详细信息

目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC），是一种口腔颌面外科最常见的恶性涎腺上皮来源性肿瘤。它有嗜神经血管性生长特点，有着较强的局部侵袭性，因而容易发生血行性远处转移等生物学特性;同时该病恶性程度高，对于放射治疗的敏感性却较低。正因为如此，该肿瘤手术切除后具有较高的局部复发率和远处转移率，其远端转移率居口腔颌面部首位。然而，涎腺腺样囊性癌的发病及其转移机制目前仍不十分清楚。因而探索新的治疗方法，来提高对腺样囊性癌的治疗效果，减少局部复发和远处转移的几率，改善患者的生存质量就更显得尤为重要。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一种天然存在于十字花科蔬菜中属于异硫氰酸盐（isothiocyanates，ITCS)类的物质。该类物质具有强抗癌作用，近些年来相继有研究报道莱菔硫烷具有抗肿瘤作用，我们前期的体外实验表明，莱菔硫烷能够抑制腺样囊性癌细胞系ACC-M的增殖，触发由Caspase介导的凋亡，并且Bcl-2家族成员在凋亡中起重要作用。但是在体内环境中，莱菔硫烷能否抑制腺样囊性癌的生长，国内外未见报道。本次实验中，我们采用了人肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M进行裸鼠的皮下接种，建立了裸鼠移植瘤模型，通过口服给予适宜剂量的莱菔硫烷后，观察莱菔硫烷对人涎腺腺样囊性癌体内移植瘤模型是否具有抑制增殖和诱导其凋亡的作用，探讨其可能的分子作用机制，旨在为腺样囊性癌的多模式治疗中拓展新的植物化学药物治疗途径提供相关的实验资料。方法：1材料1.1人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M:由中国上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，该细胞系建立于1995年。1.2莱菔硫烷（SFN）：美国匹兹堡大学医学中心头颈外科提供，购自LKT实验室，纯度≥99%。1.3裸鼠：北京军事医学科学院动物实验中心提供，10只雄性裸鼠，4～6周龄，体重16～20克。1.4原位细胞凋亡检测试剂盒:购自美国ROCHE公司1.5DAB检测试剂盒：购于河北博海生物工程有限公司2实验方法2.1药液配制：莱菔硫烷用磷酸盐缓释液PBS稀释成100mmol/L浓度的储存液，冰冻于-20℃冰箱中。2.2细胞培养：将冻存的ACC-M细胞系予以复苏，培养液均采用RPMI1640加入10%的胎牛血清和青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）按比例配制，将复苏后的细胞置于37℃、5%CO2恒温恒湿箱内培养，隔天换液，约72～96h后可以传代。2.3细胞接种及动物模型的建立：细胞长至对数生长期，收集并调整细胞密度为2×107/ml的细胞悬液。将ACC-M细胞悬液接种于10只裸小鼠背部皮下,每只选择左前背部和右后背部2个注射点,每点注射0.2ml。2.4分组给药：荷瘤鼠随机分为A、B两组，每组5只。A组为实验组，应用SFN，B组为对照组，应用PBS。注射前常规以碘酊消毒注射区皮肤，两组均采用经口腔给药，肿瘤接种当天开始给药，3次/周（周一，周三，周五），连续三周。A组每次给予60mmol/L的SFN0.1ml，B组每次给予相同剂量的PBS。每次给药时观察裸鼠的精神状态、饮食、饮水及活动并测量裸鼠体重和肿瘤体积。2.5肿瘤体积的测量和肿瘤生长抑制率的计算：每次给药后用卡尺测量移植瘤长径（a）、短径（b）及高（c），同时计算肿瘤的体积，计算公式为：肿瘤体积V=π×a×b×c/6,绘制肿瘤生长曲线;计算肿瘤的生长抑制率，公式为：抑瘤率=对照组平均体积－用药组平均体积／对照组平均体积×100%。在结束给药后的第二天（即第23天），通过颈椎脱臼的方法处死裸鼠，并用碘伏消毒，眼科钳、手术刀快速剥离瘤体组织，除去瘤体表面的坏死组织等。测量各组移植瘤直径，电子天平称瘤重。2.6用TUNEL法检测裸鼠移植瘤细胞的凋亡：将人腺样囊性癌细胞裸鼠移植瘤的组织标本，用4%多聚甲醛液固定24个小时，然后用石蜡包埋瘤体组织作冠状面切片，每个组织标本切2张，标本组织切片经过二甲苯的脱蜡和梯度乙醇脱水后，依据TUNEL法，在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，将生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成3’-OH末端，并将过氧化物酶凭借亲和素和生物素的特异性结合，连接至DNA断点，最后加入底物，通过3,3-二胺基联苯胺（DAB）显色。2.7结果判定：光镜下可观察到细胞核棕黄色着色的凋亡细胞。MoticMed6.0图像分析系随机拍摄10个400倍（10个目镜×40物镜）视野，肿瘤细胞核呈蓝色，凋亡阳性细胞为棕黄色，对每张切片进行评价，阳性细胞计数进行免疫组织化学评分（IHS）。为了数据统计和分析的方便，把阴性与弱阳性均归为阴性组，中等阳性与强阳性均

关键词：莱菔硫烷腺样囊性癌涎腺裸鼠细胞凋亡增殖移植瘤 TUNEL染色

Bcl-2家族成员在莱菔硫烷诱导人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡中的作用

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Bcl-2家族成员在莱菔硫烷诱导人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡中...

作者：郭涛河北医科大学

学位级别：硕士

目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一。好发于腭部的小唾液腺及腮腺，其次为下颌下腺。该肿瘤具有转移性极强、易沿神经扩散和血行性转移率高等重要特征，其发病率在口腔颌... 详细信息

目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一。好发于腭部的小唾液腺及腮腺，其次为下颌下腺。该肿瘤具有转移性极强、易沿神经扩散和血行性转移率高等重要特征，其发病率在口腔颌面部恶性肿瘤中居第二位。目前对于涎腺腺样囊性癌的临床治疗手段以手术切除为主，但手术切除后也常会发生局部复发和远处转移，其远端转移率在口腔颌面部居首位。然而，涎腺腺样囊性癌的发病及转移机制目前仍不完全清楚。因此探索新的预防和治疗方法，提高对涎腺腺样囊性癌的疗效，改善患者的生存质量是很有必要的。流行病学调查研究发现增加十字花科蔬菜的摄入能够减少癌症的发生，其抗肿瘤作用的主要成分是一系列异硫氰酸酯，其中莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）因其抗肿瘤效果最佳而受到广泛关注。随着对莱菔硫烷抗肿瘤作用研究的不断进展，目前对其抗癌机制的研究已从细胞水平上升至分子水平。如在DU-145细胞（前列腺癌）中，SFN引起细胞凋亡伴有裂解的Caspase-3增加和Bcl-2表达的减少。在胰腺癌细胞中也可引起Caspase-3的裂解。SFN可通过激活多种分子机制，来诱导细胞的凋亡。我们前期的实验结果表明，SFN能够抑制腺样囊性癌细胞ACC-M的增殖，并诱导其凋亡。并且Caspase在SFN诱导涎腺腺样囊性癌ACC-M凋亡过程中起重要作用。但是在SFN诱导人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞凋亡的过程中，Bcl-2家族成员是否起重要作用，国内外未见报道。本研究拟对体外培养的人腺样囊性癌细胞系ACC-M经过SFN处理后，采用Western Blot方法，检测不同时间点抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl以及促凋亡蛋白Bax，Bak的含量，验证在SFN诱导ACC-M凋亡过程中Bcl-2家族成员的表达及意义，从而为在腺样囊性癌的多模式治疗中拓展新的植物化学药物提供实验依据。方法： 1材料 1.1ACC-M:由上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，细胞系建立于1995年;1.2莱菔硫烷（SFN）：由匹兹堡大学医学中心头颈外科提供，购自LKT实验室，纯度≥99%。 2方法 2.1药液配制：莱菔硫烷（SFN）用二甲基亚砜（DMSO)溶解配制成100mmol/L的储存液，存于-20℃冰箱中，使用前用RPMI1640培养液稀释。 2.2细胞培养：将冻存的细胞系予以复苏，培养液采用RPMI1640加入10%的胎牛血清和链霉素（100μg/mL）、青霉素（100U/mL），将复苏后的细胞置于37℃、5%CO2恒温恒湿箱培养，隔天换液，约72-96小时可以传代。 2.3细胞接种及药物处理：取对数生长期细胞经消化液（0.25%胰蛋白酶和0.04％EDTA（1:1）混合液）消化后制成4.0×106个/ml的细胞悬液，根据相应时间点分别接种于对照组、4小时组、8小时组、16小时组、24小时组五个培养瓶中，每个培养瓶接种2ml的细胞悬液，放入培养箱。待细胞贴壁（接种后24小时）后进行药物处理。将100mmol/L的莱菔硫烷（SFN）储存液稀释成浓度为40μmol/L的溶液，将贴壁后的细胞从培养箱取出，弃掉培养液，于4，8，16，24各组中分别加入浓度为40μmol/L的莱菔硫烷溶液3ml，于对照组加入含相同浓度二甲基亚砜的RPMI1640培养液3ml作为对照。待药物作用4、8、16、24小时后进行各组细胞组织蛋白的提取。 2.4细胞组织蛋白的提取：将对照组和经药物处理的细胞用PBS平衡盐溶液洗涤两遍，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，各自移入相应EP管中。4℃下，3000rmp，离心15min。吸走上清液，留沉淀，经再次PBS洗涤吹打后，800rmp，离心5min，弃上清。于对照组和实验组中各加入细胞裂解液400μl，放于冰上裂解20-30min（震荡均匀后裂解）。将裂解后的细胞于4℃下，13000rmp，离心15min，离心完毕取上清液即为所提取的细胞蛋白，将蛋白分装至相应EP管-80℃保存备用。 2.5蛋白的定量：利用分光光度仪法测定蛋白浓度。分光光度法是通过测定被测物质在一定波长范围内光的吸收度，从而对该物质进行定性和定量分析。本实验在波长为595nm下测定各样本吸光度值。根据公式：蛋白含量=测定蛋白吸光度值/标准蛋白吸光度值×标准蛋白浓度（0.563g/l)×10得出测定样品蛋白浓度。 2.6采用western blot免疫印迹技术检测促凋亡蛋白Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达：经SDS--PAGE(电泳);转膜;封闭;孵育一抗二抗;洗涤;暗室显影定影等过程获得蛋白条带胶片，之后利用电泳凝胶成像分析软件,对其结果进行量化分析,采用统计学软件包对结果进行方差分析。 3统计学分析上述实验均重复三遍，汇总所得的实验

关键词：莱菔硫烷腺样囊性癌涎腺细胞凋亡抗凋亡蛋白 Bcl-2 Bcl-xl 促凋亡蛋白 Bax Bak