莱菔硫烷抑制人腺样囊性癌裸鼠移植瘤的体内实验研究

作     者：刘吉伦 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张英怀;贾志宇

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：莱菔硫烷 腺样囊性癌 涎腺 裸鼠 细胞凋亡 增殖 移植瘤 TUNEL染色 

摘      要：目的：涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC），是一种口腔颌面外科最常见的恶性涎腺上皮来源性肿瘤。它有嗜神经血管性生长特点，有着较强的局部侵袭性，因而容易发生血行性远处转移等生物学特性;同时该病恶性程度高，对于放射治疗的敏感性却较低。正因为如此，该肿瘤手术切除后具有较高的局部复发率和远处转移率，其远端转移率居口腔颌面部首位。然而，涎腺腺样囊性癌的发病及其转移机制目前仍不十分清楚。因而探索新的治疗方法，来提高对腺样囊性癌的治疗效果，减少局部复发和远处转移的几率，改善患者的生存质量就更显得尤为重要。莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一种天然存在于十字花科蔬菜中属于异硫氰酸盐（isothiocyanates，ITCS)类的物质。该类物质具有强抗癌作用，近些年来相继有研究报道莱菔硫烷具有抗肿瘤作用，我们前期的体外实验表明，莱菔硫烷能够抑制腺样囊性癌细胞系ACC-M的增殖，触发由Caspase介导的凋亡，并且Bcl-2家族成员在凋亡中起重要作用。但是在体内环境中，莱菔硫烷能否抑制腺样囊性癌的生长，国内外未见报道。本次实验中，我们采用了人肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M进行裸鼠的皮下接种，建立了裸鼠移植瘤模型，通过口服给予适宜剂量的莱菔硫烷后，观察莱菔硫烷对人涎腺腺样囊性癌体内移植瘤模型是否具有抑制增殖和诱导其凋亡的作用，探讨其可能的分子作用机制，旨在为腺样囊性癌的多模式治疗中拓展新的植物化学药物治疗途径提供相关的实验资料。 方法： 1材料 1.1人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M:由中国上海交通大学口腔颌面外科实验室提供，该细胞系建立于1995年。 1.2莱菔硫烷（SFN）：美国匹兹堡大学医学中心头颈外科提供，购自LKT实验室，纯度≥99%。 1.3裸鼠：北京军事医学科学院动物实验中心提供，10只雄性裸鼠，4～6周龄，体重16～20克。 1.4原位细胞凋亡检测试剂盒:购自美国ROCHE公司 1.5DAB检测试剂盒：购于河北博海生物工程有限公司 2实验方法 2.1药液配制：莱菔硫烷用磷酸盐缓释液PBS稀释成100mmol/L浓度的储存液，冰冻于-20℃冰箱中。 2.2细胞培养：将冻存的ACC-M细胞系予以复苏，培养液均采用RPMI1640加入10%的胎牛血清和青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）按比例配制，将复苏后的细胞置于37℃、5%CO2恒温恒湿箱内培养，隔天换液，约72～96h后可以传代。 2.3细胞接种及动物模型的建立：细胞长至对数生长期，收集并调整细胞密度为2×107/ml的细胞悬液。将ACC-M细胞悬液接种于10只裸小鼠背部皮下,每只选择左前背部和右后背部2个注射点,每点注射0.2ml。 2.4分组给药：荷瘤鼠随机分为A、B两组，每组5只。A组为实验组，应用SFN，B组为对照组，应用PBS。注射前常规以碘酊消毒注射区皮肤，两组均采用经口腔给药，肿瘤接种当天开始给药，3次/周（周一，周三，周五），连续三周。A组每次给予60mmol/L的SFN0.1ml，B组每次给予相同剂量的PBS。每次给药时观察裸鼠的精神状态、饮食、饮水及活动并测量裸鼠体重和肿瘤体积。 2.5肿瘤体积的测量和肿瘤生长抑制率的计算：每次给药后用卡尺测量移植瘤长径（a）、短径（b）及高（c），同时计算肿瘤的体积，计算公式为：肿瘤体积V=π×a×b×c/6,绘制肿瘤生长曲线;计算肿瘤的生长抑制率，公式为：抑瘤率=对照组平均体积－用药组平均体积／对照组平均体积×100%。在结束给药后的第二天（即第23天），通过颈椎脱臼的方法处死裸鼠，并用碘伏消毒，眼科钳、手术刀快速剥离瘤体组织，除去瘤体表面的坏死组织等。测量各组移植瘤直径，电子天平称瘤重。 2.6用TUNEL法检测裸鼠移植瘤细胞的凋亡：将人腺样囊性癌细胞裸鼠移植瘤的组织标本，用4%多聚甲醛液固定24个小时，然后用石蜡包埋瘤体组织作冠状面切片，每个组织标本切2张，标本组织切片经过二甲苯的脱蜡和梯度乙醇脱水后，依据TUNEL法，在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，将生物素化的dUTP标记至DNA断裂后形成3’-OH末端，并将过氧化物酶凭借亲和素和生物素的特异性结合，连接至DNA断点，最后加入底物，通过3,3-二胺基联苯胺（DAB）显色。 2.7结果判定：光镜下可观察到细胞核棕黄色着色的凋亡细胞。MoticMed6.0图像分析系随机拍摄10个400倍（10个目镜×40物镜）视野，肿瘤细胞核呈蓝色，凋亡阳性细胞为棕黄色，对每张切片进行评价，阳性细胞计数进行免疫组织化学评分（IHS）。为了数据统计和分析的方便，把阴性与弱阳性均归为阴性组，中等阳性与强阳性均归为阳性组。 2.8统计学分析:肿瘤体积和重量的数据用平均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计学软件进行t检验分析。TUNEL法的免疫组织化学评分按实验数据应用SPSS13.0统计学软件进行χ2检验及Fisher精确概率法分析组间差异，P0.05定为统计学差异有显著性。 结果： 结果显示：SFN处理移植瘤后，SFN对人腺样囊性癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用，两组瘤体大小，重量有明显差别。成瘤后，不同时间点实验组瘤块的平均体积显著小于对照组。实验组裸鼠体重与对照组相比无明显差异。TUNEL染色显示，实验组TUNEL阳性率明显高于对照组。 结论： 1莱菔硫烷可抑制腺样囊性癌ACC-M裸鼠体内移植瘤的增殖生长。 2莱菔硫烷可体内诱导腺样囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的凋亡。