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基于ORF3蛋白抗体的鹅圆环病毒间接ELISA检测方法的建立

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农业生物技术学报 2024年第3期32卷 730-738页

作者：付环茹赵敏江锦秀陈翠腾张靖鹏李兆龙万春和福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建农林大学生命科学学院福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽遗传育种重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

鹅圆环病毒(Goose circovirus, GoCV)是一种潜在的免疫抑制病原，主要感染宿主淋巴细胞，导致免疫功能下降，易造成其他病原继发感染，给养鹅(Anser cygnoides orientalis)业带来极大危害。为建立鹅圆环病毒血清学抗体的间接ELISA方法... 详细信息

鹅圆环病毒(Goose circovirus, GoCV)是一种潜在的免疫抑制病原，主要感染宿主淋巴细胞，导致免疫功能下降，易造成其他病原继发感染，给养鹅(Anser cygnoides orientalis)业带来极大危害。为建立鹅圆环病毒血清学抗体的间接ELISA方法，本研究将GoCV的ORF3基因插入到原核表达载体p ET-32a(+)，构建重组质粒pET-32a-ORF3，经表达条件优化，以Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析表明，获得的重组ORF3蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组ORF3蛋白作为包被抗原，通过优化各反应条件建立了GoCV间接ELISA抗体检测方法。优化后的间接ELISA检测条件为：重组ORF3蛋白的最佳包被浓度为2.00μg/mL、待检血清稀释度为1∶80、酶标二抗最佳稀释度分别为1∶4 000 (羊抗鸡HRP-IgG)和1∶8 000 (羊抗鸭HRP-IgG)。采用建立的间接ELISA方法对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)、鹅源禽坦布苏病毒(Avian tembusu virus, ATmV)、鹅源H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus, AIV)、鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus, GRV)、新型鹅星状病毒(Goose astrovirus, GoAstV)、GoCV等鹅源阳性血清进行检测，结果显示，仅GoCV阳性血清为阳性结果，其他病原阳性血清检测结果均为阴性，特异性较强；重复性较好，批内和批间变异系数均小于5%。流行病学调查结果显示，福建和广东地区鸭(Anatinae)群中均存在GoCV跨种感染。本研究建立的检测GoCV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性好，可用于GoCV感染的诊断及流行病学调查研究。

关键词：鹅圆环病毒(GoCV) ORF3蛋白原核表达间接ELISA 流行病调查

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鸭疫里默氏菌噬菌体宿主谱的拓宽

动物医学进展 2024年第5期45卷 34-38页

作者：程龙飞江南松刘荣昌傅秋玲梁齐章万春和黄瑜傅光华陈红梅福建省禽病防治重点实验室福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省畜禽疫病防控产业技术创新研究院福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合... 详细信息

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合液中单一噬菌体的噬菌谱。结果表明,30代噬菌体混合液可裂解79.2%(19/24)的鸭疫里默氏菌试验菌株;30代噬菌体混合液中分离出的单一噬菌体能裂解的试验菌株数量为2~9株;裂解数最多的5株单一噬菌体,以各自宿主菌传代10次,噬菌谱没有发生变化;将裂解谱互补的单一噬菌体混合,4株噬菌体即可裂解19株试验菌株,与30代噬菌体混合液相同。说明建立的方法可以拓宽噬菌体混合液、单一噬菌体的噬菌谱,为噬菌体鸡尾酒制剂的毒株选择奠定了基础。

关键词：鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱拓宽

山东某规模化鸡场鸡毒支原体的分离鉴定、基因分型、耐药性和致病性分析

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微生物学通报 2024年

作者：周峰王晨燕侯博郭锦玥福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心佛山科学技术学院生命科学与工程学院

【背景】鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum， MG)主要引起家禽慢性呼吸道疾病，不同地区MG菌株的耐药性和致病性差异大，给临床防控增加了难度。【目的】明确山东省烟台市某规模化鸡场MG分离株基因分型、耐药情况及致病力，为该地... 详细信息

【背景】鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum， MG)主要引起家禽慢性呼吸道疾病，不同地区MG菌株的耐药性和致病性差异大，给临床防控增加了难度。【目的】明确山东省烟台市某规模化鸡场MG分离株基因分型、耐药情况及致病力，为该地区MG防控提供科学依据。【方法】本研究从MG阳性鸡群上腭裂拭子分离、纯化获得MG分离株，利用atpG、plsC、mraW、ugpA、DUF3196、lgT和dppC共7个管家基因进行多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，并构建系统发育树。测定分离株对金霉素、大观霉素、林可霉素、泰乐菌素、泰万菌素、泰妙菌素、沃尼妙林和多西环素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration， MIC)，并对相关耐药基因23S rRNA基因V结构域、L4及L22蛋白基因测序并分析。通过点眼攻毒和气管攻毒两种方式感染28日龄SPF鸡，评价感染10、20和30 d后气囊炎的发病率、气管组织MG载量和病理损伤。【结果】分离纯化9株MG，其中菌株YTX2、YTX5.6、YTX11、YTX12、YTX13、YTX14和YTX15的管家基因plsC和mraW首次发现新的等位基因，ID号分别为33和31，这7株MG分离株属于ST97型，而菌株YTX9和YTX10属于ST16型。所有MG分离株对沃尼妙林和泰妙菌素敏感(MIC≤0.25 μg/mL)，对泰万菌素和多西环素次之(MIC≤4 μg/mL)，对金霉素和林可霉素有一定程度耐药(MIC≥16 μg/mL)；属于ST97的7个MG分离株对泰乐菌素存在中等程度耐药(MIC：4-8 μg/mL)；选取菌株YTX5.6、YTX2和YTX10对耐药性相关的23S rRNA基因V结构域、L4和L22蛋白基因测序分析，菌株YTX5.6和YTX2在23S rRNA基因V结构域发生A2069G突变；菌株YTX5.6和YTX2的L4蛋白基因出现G568T突变，在L22蛋白基因上出现T102C、T129C、T252C、C336T和G404A突变；对泰万菌素、泰乐菌素、泰妙菌素、沃尼妙林和多西环素敏感的YTX10株与对照菌株MG Rlow株序列一致，未发生突变。在感染后10、20和30 d，菌株YTX5.6气管攻毒组气囊炎发病率分别为80%、60%和80%；菌株YTX10气管攻毒组仅在感染后20 d和30 d出现气囊炎，发病率分别为40%和20%，其余组在整个实验过程中均未发现明显气囊炎。气管攻毒组的鸡在整个感染过程中气管黏膜增厚情况均比点眼攻毒组严重(P研究从山东烟台某规模化鸡群共分离9株MG菌株，分别属于ST97和ST16基因型，分离株对目前常用抗生素存在不同程度的耐药性，动物感染试验表明不同基因型菌株存在不同致病力。

关键词：鸡毒支原体耐药性多位点序列分型 MIC测定致病性

黑龙江省扶余市麦穗鱼舌状绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育分析

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中国兽医杂志 2024年第08期 74-80页

作者：陈秀琴邱阳元郑敏林甦江斌王劭黄梅清福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室

为鉴定从黑龙江省扶余市麦穗鱼腹腔内收集的绦虫裂头蚴的种类，本试验采用PCR方法分别对其核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行扩增和序列测定。运用DNASTAR软件的MegAlign程序分析核苷酸同源性，采用... 详细信息

为鉴定从黑龙江省扶余市麦穗鱼腹腔内收集的绦虫裂头蚴的种类，本试验采用PCR方法分别对其核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行扩增和序列测定。运用DNASTAR软件的MegAlign程序分析核苷酸同源性，采用邻接法构建基于ITS和COⅠ基因序列的系统进化树，以此分析分离虫株种内与种间的系统发育关系。结果显示，各分离虫株的ITS1和ITS2基因与舌状绦虫(AY121751)的核苷酸序列同源性最高，分别为98.8%～100%和99.6%～99.7%;各分离虫株的COⅠ基因与肠舌状绦虫(EU241273)的核苷酸序列同源性最高，为91.2%～94.7%。基于ITS序列构建的系统进化树显示，舌状绦虫和双线绦虫的ITS序列具有高度的保守性，ITS区域可能不适宜作为区分舌状绦虫属内部种类的可靠分子标记。基于COⅠ基因构建的系统进化树显示，分离虫株与土耳其、俄罗斯和欧洲的肠舌状绦虫分离株进化关系最近。根据序列同源性和COⅠ基因进化树结果，初步将本试验所分离虫株鉴定为肠舌状绦虫。结果表明，COⅠ基因更适合于舌状绦虫属种类的鉴别。本试验为舌状绦虫的分子流行病学调查提供了参考。

关键词：舌状绦虫分子鉴定系统发育分析核糖体内转录间隔区线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ

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猪源葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

动物医学进展 2024年第5期45卷 8-13页

作者：李燕玲陈渊泉谢明杰周伦江陈秋勇连春红李健王隆柏福建农林大学福建省兽医中药与动物保健重点实验室福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013 仙游县畜牧兽医局福建莆田351299

为明确从福建某规模猪场分离到的病原菌及其生物学特性、致病性与耐药等特征,为疫病的防治提供参考依据。对分离菌进行纯化,采用革兰氏染色、PCR鉴定、药敏试验、消毒剂消杀试验、耐药基因检测及动物攻毒试验等,对分离菌进行生物学特性... 详细信息

为明确从福建某规模猪场分离到的病原菌及其生物学特性、致病性与耐药等特征,为疫病的防治提供参考依据。对分离菌进行纯化,采用革兰氏染色、PCR鉴定、药敏试验、消毒剂消杀试验、耐药基因检测及动物攻毒试验等,对分离菌进行生物学特性、耐药等相关检测。结果显示,分离菌为猪源葡萄球菌。该菌对30种常用抗菌药物中的苯唑西林、诺氟沙星、头孢类等14种药物高度敏感,对阿米卡星、庆大霉素、四环素、万古霉素、氟苯尼考5种药物中度敏感,对氨苄西林、哌拉西林、卡那霉素等11种药物不敏感,检测cfr、tetM、floR、mcr-1、bla NDM-1、optrA 6种耐药基因均为阴性;该菌对26种中药中的单宁酸高度敏感,对五味子、五信子多酚中度敏感,对叶下珠、厚朴、虎杖低度敏感,对半边莲、铁苋菜、艾叶、重楼等20种中药不敏感;在8种消毒剂中,84消毒液对该分离菌的消杀效果差,新洁尔灭、月苄三甲氯铵、复合酚3种消毒剂对该分离菌消杀效果好;动物攻毒试验表明,该菌对25日龄健康断奶仔猪具有强致病性,能导致猪出现典型的葡萄球菌病临床症状和病理特征,攻菌猪组织病理可见脾脏红髓淤血、肺泡腔内见红细胞渗出及少量粉染的渗出物。研究结果可为在养殖饲料端禁止添加抗生素的背景下,为猪葡萄球菌病的防治提供理论参考和技术支撑。

关键词：猪葡萄球菌分离鉴定致病性耐药性

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尾丝蛋白在噬菌体吸附鸭疫里默氏菌中的作用

福建农业学报 2024年第1期39卷 1-6页

作者：刘娜黄瑜陈红梅江南松刘荣昌傅光华傅秋玲梁齐章万春和李昂程龙飞福建农林大学动物科学学院福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防控产业技术创新研究院福建福州350013 福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

【目的】以鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)噬菌体CRP2为对象,研究尾丝蛋白(Tail fiber protein,TFP)对噬菌体吸附功能的影响。【方法】克隆ORF70假定的TFP基因,构建重组表达载体pET28a(+)-TFP,在大肠杆菌*** BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定重组蛋白与CRP2噬菌体的宿主菌外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)的结合作用。竞争吸附试验测定重组蛋白对CRP2噬菌体吸附率的影响。【结果】构建了pET28a(+)-TFP重组表达质粒,在大肠杆菌中得到了可溶性表达。纯化的重组蛋白可以与宿主菌的OMP结合,也可以抑制CRP2对其宿主菌的吸附。【结论】ORF70编码的TFP是噬菌体CRP2的一种受体结合蛋白,其对应的受体是宿主菌的OMP。

关键词：鸭疫里默氏菌噬菌体尾丝蛋白吸附

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抗生素在土壤颗粒态有机质纳米尺度上空间分布的检测方法研究

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山东农业科学 2024年第2期56卷 124-130页

作者：谢寅雨刘兴华山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室山东济南250100

抗生素等新型污染物的环境污染与风险问题日益引起关注,土壤有机质对抗生素有重要的富集作用,传统方法无法定量检测抗生素在土壤颗粒态有机质(particulate organic matter,POM)上的空间分布是由于难以区分有机质和抗生素中的碳分布。为... 详细信息

抗生素等新型污染物的环境污染与风险问题日益引起关注,土壤有机质对抗生素有重要的富集作用,传统方法无法定量检测抗生素在土壤颗粒态有机质(particulate organic matter,POM)上的空间分布是由于难以区分有机质和抗生素中的碳分布。为了解决这一难题,本试验采用纳米离子探针技术结合稳定性同位素技术建立了抗生素在POM纳米尺度上空间分布的检测方法。本方法用水做包埋剂制作POM超薄冷冻切片,用睫毛笔转移POM切片至亲水性硅片上,优化NanoSIMS测试条件,使用Image J和插件MIMI Image等进行图像数据处理。使用本方法对抗生素在黄河三角洲地区土壤POM中的空间分布进行了检测,得出在纳米尺度上分布在POM表面的抗生素占94%,内部扩散占6%。本试验建立的检测方法为探究土壤有机质中其他类型的有机污染物分布特征提供了方法学基础。

关键词：抗生素土壤颗粒态有机质空间分布纳米尺度纳米离子探针

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一株基因Ⅱ型鹅星状病毒的分离鉴定及培养特性

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福建农业学报 2024年第4期39卷 378-386页

作者：兰琴刘荣昌张佳雪陈炜焦文龙梁齐章江南松万春和程龙飞陈红梅傅秋玲傅光华黄瑜福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

【目的】明确鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)的致病性和体外培养特性。【方法】对广东某鹅场表现为内脏和关节痛风的发病鹅组织样品进行病原学检测、病毒分离鉴定、病毒基因序列测定与分析、病毒培养特性及致病性研究。【结果】从... 详细信息

【目的】明确鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)的致病性和体外培养特性。【方法】对广东某鹅场表现为内脏和关节痛风的发病鹅组织样品进行病原学检测、病毒分离鉴定、病毒基因序列测定与分析、病毒培养特性及致病性研究。【结果】从中分离到1株鹅星状病毒,命名为GD2208株;ORF2基因核苷酸序列比对分析显示,该毒株与基因Ⅱ型鹅星状病毒(GAstV-Ⅱ)参考株同源性最高,为97.4%~99.1%;进化树分析显示该毒株与GAstV-Ⅱ参考株处于同一进化分支。动物回归试验显示,以该毒株感染3日龄雏鹅后致死率为20%,感染鹅临床症状、剖检病变及病理组织学变化与自然发病鹅相似。禽胚及细胞适应性研究结果显示,该毒株能在鹅胚中稳定增殖,但盲传4代后仍无法适应SPF鸡胚和番鸭胚;病毒在GEK和LMH细胞中均能稳定增殖且可见明显细胞病变,在DF-1上可稳定繁殖,但盲传至8代后仍未见细胞病变。【结论】本研究自表现痛风症状雏鹅中分离到1株GAstV-Ⅱ毒株,该毒株感染3日龄雏鹅可发生典型痛风症状,对鹅胚、GEK、LMH和DF-1细胞均有一定适应性,以上结果为进一步开展GAstV的致病机制、疫苗和药物研发奠定了基础。

关键词：鹅星状病毒分离鉴定培养特性

基于基因组信息的大蒲莲猪遗传多样性和群体结构变化分析

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农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1093-1101页

作者：张鑫张婷王怀中杨晴高世超王彦平王继英济宁市畜牧兽医事业发展中心山东省农业科学院畜牧兽医研究所/畜禽疫病防治与繁育重点实验室农业农村部畜禽生物组学重点实验室

由于系谱错误、留种不均衡和杂种个体混入等原因，地方猪保种过程中可能会出现群体近交系数增速过快、个体间亲缘关系不明等问题。为分析大蒲莲猪(Sus scrofa)保种群的遗传多样性和群体结构，监测保种群2017～2022年期间基因组信息变化... 详细信息

由于系谱错误、留种不均衡和杂种个体混入等原因，地方猪保种过程中可能会出现群体近交系数增速过快、个体间亲缘关系不明等问题。为分析大蒲莲猪(Sus scrofa)保种群的遗传多样性和群体结构，监测保种群2017～2022年期间基因组信息变化情况，本研究利用高密度SNP芯片对110头大蒲莲猪全基因组SNP进行扫描，对比分析了2017年和2022年大蒲莲猪保种核心群样本的遗传多样性、近交系数、系统发生树以及与引进猪的关系。结果表明：1) 2022年大蒲莲猪样本的观察杂合度(observe heterozygosity, HO)(0.356 vs 0.292)、期望杂合度(expected heterozygosity, HE)(0.342 vs 0.285)和遗传距离(0.270 vs 0.233)均高于2017年样本，血缘同源(identity by descent, IBD)比例(0.108 vs 0.127)和基于纯合性片段(runs of homozygosity, ROH)计算的基因组近交系数FROH(0.108 vs. 0.163)低于2017年样本，系统发生树结构与2017年样本相似但家系间的均衡性增加，说明2022年核心群的遗传多样性比2017年有所提高，群体结构有所改善。2) 2022年样本的HO和HE比值(1.041 vs. 1.025)高于2017年样本，与引进品种的主成分分析(PCA)中，2022年样本比2017年样本更偏向于引进品种猪，说明大蒲莲猪中混有一定的其他群体血缘，且2022年大蒲莲猪群体中其他品种的血缘比2017年有所增加。本研究分析了大蒲莲猪群体变化趋势，为大蒲莲猪进一步的保种与科学利用提供参考依据。

关键词：大蒲莲猪高密度SNP芯片遗传多样性群体结构