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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 860-866页

作者：张靖鹏陈翠腾林琳付环茹李兆龙江斌黄瑜万春和福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 详细信息

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

关键词：信鸽鸽微RNA病毒 3 C基因序列分析实时荧光定量RT-PCR方法

福建省猪源葡萄球菌多重耐药基因的分子流行病学调查

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西北农林科技大学学报(自然科学版) 2024年 1-10页

作者：董紫凡吴仁杰王隆柏白丁平周伦江车勇良福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

【目的】明确多重耐药基因cfr、optr A和poxt A在福建省猪源葡萄球菌中的分子流行特征,为耐药葡萄球菌的控制提供科学依据。【方法】通过PCR扩增16S r RNA对2020-2022年分离自福建省福州市、厦门市、漳州市、三明市、龙岩市、南平市、... 详细信息

【目的】明确多重耐药基因cfr、optr A和poxt A在福建省猪源葡萄球菌中的分子流行特征,为耐药葡萄球菌的控制提供科学依据。【方法】通过PCR扩增16S r RNA对2020-2022年分离自福建省福州市、厦门市、漳州市、三明市、龙岩市、南平市、宁德市不同猪场的107株菌(样品为鼻拭子、唾液、粪便和肺脏)进行鉴定。对分离菌株进行cfr、optr A和poxt A多重耐药基因检测;采用MEGA软件对cfr和optr A阳性菌株进行系统发育分析;采用琼脂稀释法或微量肉汤稀释法对cfr和optr A基因阳性菌株进行3种抗菌药物(酰胺醇类抗菌药物氟苯尼考和氯霉素,恶唑烷酮类抗菌药物利奈唑胺)最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)测定。【结果】经鉴定107株菌均为葡萄球菌,分属18个种,其中以科氏葡萄球菌占比最高。流行病学调查结果显示,107株葡萄球菌主要来自猪鼻拭子样品(占67.3%),并且在福州市猪场的样品中分离率最高(36.4%)。PCR筛查结果显示,在107株葡萄球菌中未检出poxt A基因阳性菌株;检测出14株cfr阳性菌和6株optr A阳性菌,检出率分别为13.1%和5.6%,其中葡萄球菌FJNP2209-1和FJCT2212-1同时携带cfr及optr A基因。系统发育分析结果显示,14株cfr阳性葡萄球菌处于同一个分支内,其中菌株FJFQ2211与所研究的其他菌株亲缘关系稍远;6株optr A基因阳性葡萄球菌属于2个分支。药敏试验结果表明,携带多重耐药基因cfr或optr A的18株葡萄球菌对氯霉素和氟苯尼考100%耐药,对利奈唑胺的耐药率为83.33%。【结论】福建省不同猪场来源的葡萄球菌中多重耐药基因cfr和optr A阳性率较高,但poxt A基因未检出。福建省猪源葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素、利奈唑胺均表现出较高的耐药率,应加强抗菌药物在养猪场中的规范使用。

关键词：葡萄球菌猪病防制多重耐药基因福建省

山东某规模化鸡场鸡毒支原体的分离鉴定、基因分型、耐药性和致病性分析

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微生物学通报 2024年

作者：周峰王晨燕侯博郭锦玥福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心佛山科学技术学院生命科学与工程学院

【背景】鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum， MG)主要引起家禽慢性呼吸道疾病，不同地区MG菌株的耐药性和致病性差异大，给临床防控增加了难度。【目的】明确山东省烟台市某规模化鸡场MG分离株基因分型、耐药情况及致病力，为该地... 详细信息

【背景】鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum， MG)主要引起家禽慢性呼吸道疾病，不同地区MG菌株的耐药性和致病性差异大，给临床防控增加了难度。【目的】明确山东省烟台市某规模化鸡场MG分离株基因分型、耐药情况及致病力，为该地区MG防控提供科学依据。【方法】本研究从MG阳性鸡群上腭裂拭子分离、纯化获得MG分离株，利用atpG、plsC、mraW、ugpA、DUF3196、lgT和dppC共7个管家基因进行多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，并构建系统发育树。测定分离株对金霉素、大观霉素、林可霉素、泰乐菌素、泰万菌素、泰妙菌素、沃尼妙林和多西环素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration， MIC)，并对相关耐药基因23S rRNA基因V结构域、L4及L22蛋白基因测序并分析。通过点眼攻毒和气管攻毒两种方式感染28日龄SPF鸡，评价感染10、20和30 d后气囊炎的发病率、气管组织MG载量和病理损伤。【结果】分离纯化9株MG，其中菌株YTX2、YTX5.6、YTX11、YTX12、YTX13、YTX14和YTX15的管家基因plsC和mraW首次发现新的等位基因，ID号分别为33和31，这7株MG分离株属于ST97型，而菌株YTX9和YTX10属于ST16型。所有MG分离株对沃尼妙林和泰妙菌素敏感(MIC≤0.25 μg/mL)，对泰万菌素和多西环素次之(MIC≤4 μg/mL)，对金霉素和林可霉素有一定程度耐药(MIC≥16 μg/mL)；属于ST97的7个MG分离株对泰乐菌素存在中等程度耐药(MIC：4-8 μg/mL)；选取菌株YTX5.6、YTX2和YTX10对耐药性相关的23S rRNA基因V结构域、L4和L22蛋白基因测序分析，菌株YTX5.6和YTX2在23S rRNA基因V结构域发生A2069G突变；菌株YTX5.6和YTX2的L4蛋白基因出现G568T突变，在L22蛋白基因上出现T102C、T129C、T252C、C336T和G404A突变；对泰万菌素、泰乐菌素、泰妙菌素、沃尼妙林和多西环素敏感的YTX10株与对照菌株MG Rlow株序列一致，未发生突变。在感染后10、20和30 d，菌株YTX5.6气管攻毒组气囊炎发病率分别为80%、60%和80%；菌株YTX10气管攻毒组仅在感染后20 d和30 d出现气囊炎，发病率分别为40%和20%，其余组在整个实验过程中均未发现明显气囊炎。气管攻毒组的鸡在整个感染过程中气管黏膜增厚情况均比点眼攻毒组严重(P研究从山东烟台某规模化鸡群共分离9株MG菌株，分别属于ST97和ST16基因型，分离株对目前常用抗生素存在不同程度的耐药性，动物感染试验表明不同基因型菌株存在不同致病力。

关键词：鸡毒支原体耐药性多位点序列分型 MIC测定致病性

滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究

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中国预防兽医学报 2024年第2期46卷 113-120页

作者：王晨燕邵国青侯博福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014

为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量... 详细信息

为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量按相应分组点眼感染MS (106CCU50)、IBV(105EID50),阴性对照组以50μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS (右眼)。感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定。此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分。结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状。剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%。感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d (5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d (5/6)。IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据。

关键词：滑液囊支原体鸡传染性支气管炎病毒共感染致病性

基于ORF3蛋白抗体的鹅圆环病毒间接ELISA检测方法的建立

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农业生物技术学报 2024年第3期32卷 730-738页

作者：付环茹赵敏江锦秀陈翠腾张靖鹏李兆龙万春和福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建农林大学生命科学学院福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽遗传育种重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

鹅圆环病毒(Goose circovirus, GoCV)是一种潜在的免疫抑制病原，主要感染宿主淋巴细胞，导致免疫功能下降，易造成其他病原继发感染，给养鹅(Anser cygnoides orientalis)业带来极大危害。为建立鹅圆环病毒血清学抗体的间接ELISA方法... 详细信息

鹅圆环病毒(Goose circovirus, GoCV)是一种潜在的免疫抑制病原，主要感染宿主淋巴细胞，导致免疫功能下降，易造成其他病原继发感染，给养鹅(Anser cygnoides orientalis)业带来极大危害。为建立鹅圆环病毒血清学抗体的间接ELISA方法，本研究将GoCV的ORF3基因插入到原核表达载体p ET-32a(+)，构建重组质粒pET-32a-ORF3，经表达条件优化，以Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析表明，获得的重组ORF3蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组ORF3蛋白作为包被抗原，通过优化各反应条件建立了GoCV间接ELISA抗体检测方法。优化后的间接ELISA检测条件为：重组ORF3蛋白的最佳包被浓度为2.00μg/mL、待检血清稀释度为1∶80、酶标二抗最佳稀释度分别为1∶4 000 (羊抗鸡HRP-IgG)和1∶8 000 (羊抗鸭HRP-IgG)。采用建立的间接ELISA方法对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)、鹅源禽坦布苏病毒(Avian tembusu virus, ATmV)、鹅源H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus, AIV)、鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus, GRV)、新型鹅星状病毒(Goose astrovirus, GoAstV)、GoCV等鹅源阳性血清进行检测，结果显示，仅GoCV阳性血清为阳性结果，其他病原阳性血清检测结果均为阴性，特异性较强；重复性较好，批内和批间变异系数均小于5%。流行病学调查结果显示，福建和广东地区鸭(Anatinae)群中均存在GoCV跨种感染。本研究建立的检测GoCV血清抗体的间接ELISA方法特异性强、重复性好，可用于GoCV感染的诊断及流行病学调查研究。

关键词：鹅圆环病毒(GoCV) ORF3蛋白原核表达间接ELISA 流行病调查

一株樱桃谷鸭源鸭腺病毒B2毒株的分离与鉴定

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微生物学通报 2024年

作者：江丹丹郭博伦黄志坚程晓霞林昶游广炬肖世峰朱小丽王劭陈少莺陈仕龙福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 三明市绿色食品发展中心

【背景】2014年以来，鸭腺病毒B2（DAdV B2）感染引起的番鸭“白肝病”在我国番鸭群广泛流行，其他品种肉鸭未见发病，本研究发现两起樱桃谷鸭疑似“白肝病”的病例。【目的】鉴定樱桃谷鸭“白肝病”的病原。【方法】对送检鸭的肝脏等... 详细信息

【背景】2014年以来，鸭腺病毒B2（DAdV B2）感染引起的番鸭“白肝病”在我国番鸭群广泛流行，其他品种肉鸭未见发病，本研究发现两起樱桃谷鸭疑似“白肝病”的病例。【目的】鉴定樱桃谷鸭“白肝病”的病原。【方法】对送检鸭的肝脏等内脏样品进行PCR或RT-PCR检测、病原分离鉴定、序列测定及动物回归试验。【结果】内脏组织PCR检测DAdV B2阳性，并成功分离到一株DAdV B2毒株，命名为DAdV B2/BG19。该分离株BG19感染的鸡肝癌细胞（leghorn male hepatoma cell line，LMH）细胞变大变圆、最后崩解，形成特征性细胞病变。分离株BG19有两个fiber基因，主要功能基因如hexon、fiber 1、fiber 2及DNA polymerase与国内DAdV B2分离株核苷酸同源性均达98.26%以上，与DAdV B1代表株GR对应基因的核苷酸同源性分别为77.12%、30.8%、34%和99.78%；所有DAdV B1和DAdV B2分离株的DNA polymerase基因处于同一个进化分支；分离株BG19的ORF67基因从起始密码子往后的第133位碱基为T，造成提早产生终止密码子，导致ORF67基因编码蛋白比国内早前流行代表株CH-GD-12-2014少了14个氨基酸。分离株BG19人工感染2日龄樱桃谷鸭和番鸭的发病率分别为50%和87.5%，死亡率分别为12.5%和37.5%，病死鸭可见与自然感染病例相似的临床症状和病理变化。【结论】从樱桃谷鸭白肝病病例成功分离鉴定一株ORF67蛋白截短表达的DAdV B2强毒株，国内外首次发现DAdV B2能感染樱桃谷鸭。

关键词：樱桃谷鸭白肝病鸭腺病毒B2 分离鉴定

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鸭疫里默氏菌噬菌体宿主谱的拓宽

动物医学进展 2024年第5期45卷 34-38页

作者：程龙飞江南松刘荣昌傅秋玲梁齐章万春和黄瑜傅光华陈红梅福建省禽病防治重点实验室福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省畜禽疫病防控产业技术创新研究院福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合... 详细信息

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合液中单一噬菌体的噬菌谱。结果表明,30代噬菌体混合液可裂解79.2%(19/24)的鸭疫里默氏菌试验菌株;30代噬菌体混合液中分离出的单一噬菌体能裂解的试验菌株数量为2~9株;裂解数最多的5株单一噬菌体,以各自宿主菌传代10次,噬菌谱没有发生变化;将裂解谱互补的单一噬菌体混合,4株噬菌体即可裂解19株试验菌株,与30代噬菌体混合液相同。说明建立的方法可以拓宽噬菌体混合液、单一噬菌体的噬菌谱,为噬菌体鸡尾酒制剂的毒株选择奠定了基础。

关键词：鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱拓宽

黑龙江省扶余市麦穗鱼舌状绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育分析

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中国兽医杂志 2024年第08期 74-80页

作者：陈秀琴邱阳元郑敏林甦江斌王劭黄梅清福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室

为鉴定从黑龙江省扶余市麦穗鱼腹腔内收集的绦虫裂头蚴的种类，本试验采用PCR方法分别对其核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行扩增和序列测定。运用DNASTAR软件的MegAlign程序分析核苷酸同源性，采用... 详细信息

为鉴定从黑龙江省扶余市麦穗鱼腹腔内收集的绦虫裂头蚴的种类，本试验采用PCR方法分别对其核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行扩增和序列测定。运用DNASTAR软件的MegAlign程序分析核苷酸同源性，采用邻接法构建基于ITS和COⅠ基因序列的系统进化树，以此分析分离虫株种内与种间的系统发育关系。结果显示，各分离虫株的ITS1和ITS2基因与舌状绦虫(AY121751)的核苷酸序列同源性最高，分别为98.8%～100%和99.6%～99.7%;各分离虫株的COⅠ基因与肠舌状绦虫(EU241273)的核苷酸序列同源性最高，为91.2%～94.7%。基于ITS序列构建的系统进化树显示，舌状绦虫和双线绦虫的ITS序列具有高度的保守性，ITS区域可能不适宜作为区分舌状绦虫属内部种类的可靠分子标记。基于COⅠ基因构建的系统进化树显示，分离虫株与土耳其、俄罗斯和欧洲的肠舌状绦虫分离株进化关系最近。根据序列同源性和COⅠ基因进化树结果，初步将本试验所分离虫株鉴定为肠舌状绦虫。结果表明，COⅠ基因更适合于舌状绦虫属种类的鉴别。本试验为舌状绦虫的分子流行病学调查提供了参考。

关键词：舌状绦虫分子鉴定系统发育分析核糖体内转录间隔区线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ

一株具有插入和缺失突变特征鸭腺病毒B2毒株的分离鉴定

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福建农业学报 2024年第2期39卷 125-130页

作者：郭博伦李雅汝郑欣江丹丹曾丽陈少莺马燕梅陈仕龙福建农林大学动物科学学院/福建省-尼泊尔畜禽重大疫病防控联合实验室福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

【目的】对一份疑似鸭腺病毒B2(Duck adenovirus B2,DAdV B2)感染的番鸭白肝病的病例进行确诊,并对分离株进行测序,为福建省DAdV B2流行病学研究提供参考。【方法】开展病料PCR检测,并进行病毒的分离鉴定、全基因二代测序,利用MegAlign... 详细信息

【目的】对一份疑似鸭腺病毒B2(Duck adenovirus B2,DAdV B2)感染的番鸭白肝病的病例进行确诊,并对分离株进行测序,为福建省DAdV B2流行病学研究提供参考。【方法】开展病料PCR检测,并进行病毒的分离鉴定、全基因二代测序,利用MegAlign和SnapGene软件对测序结果进行同源性及遗传进化分析,再进行动物回归试验,确定对雏番鸭的致病性。【结果】病料样本检测为DAdV B2阳性,并成功分离到一株DAdV B2毒株,命名为DAdV B2/BG48。该分离株感染鸡肝癌细胞(LMH)后细胞变大变圆、最后死亡崩解,形成特征性细胞病变;感染MDEF后细胞由长梭形变为圆形并聚集,细胞间出现空隙。测序结果表明,BG48基因组在pX基因区域中有3 bp的插入,在ORF19B基因区域有33 bp的插入,在ORF64和ORF67基因区域的交界处有42 bp的缺失,ORF67基因起始密码子往后第133位碱基为G,没有突变为终止密码子,其他编码基因与CH-GD-12-2014、实验室之前鉴定的BG27和BG18无特征性差异。动物回归试验显示,2日龄的番鸭对DAdV B2分离株BG48易感,致病率为50%,死亡率为0,发病鸭可见与自然感染病鸭相似的临床症状和病理变化。【结论】成功从番鸭白肝病病例中分离鉴定1株DAdV B2突变株BG48,BG48具有多位点插入和缺失特征,提示DAdV B2毒株容易突变,临床流行毒株复杂。本结果为DAdV B2的分子流行病学调查和遗传进化研究提供了参考。

关键词：番鸭白肝病鸭腺病毒B2 分离鉴定插入和缺失 ORF67