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水稻MYB基因家族特征及其在RGSV和RRSV侵染后的响应

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植物病理学报 2023年第2期53卷 258-266页

作者：徐荣荣常青魏莹李霞吴建国赵珊珊福建农林大学虫媒介病毒研究中心福建省植物病毒学重点实验室闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室福州350002

MYB基因家族作为植物体内最大的转录因子家族之一,在调节植物生长发育以及抗逆境胁迫方面发挥着至关重要的作用。然而,OsMYBs在水稻抗病毒通路中的作用还尚不清楚。为了探究OsMYBs家族在水稻抗病毒通路中所扮演的角色,对其结构、特征,... 详细信息

MYB基因家族作为植物体内最大的转录因子家族之一,在调节植物生长发育以及抗逆境胁迫方面发挥着至关重要的作用。然而,OsMYBs在水稻抗病毒通路中的作用还尚不清楚。为了探究OsMYBs家族在水稻抗病毒通路中所扮演的角色,对其结构、特征,以及对已报道的单链RNA病毒水稻草状矮化病毒(rice grassy stunt virus,RGSV)和双链RNA病毒水稻锯齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)侵染后的表达谱进行分析,发现51个响应RGSV侵染,50个响应RRSV侵染。进一步分析发现,26个OsMYBs可同时响应两种不同类型病毒。从中筛选出10个表达量相对较高且差异倍数较大的基因进行实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)验证,结果表明,OsMYB30、LOC_Os02g42850、LOC_Os02g47744、LOC_Os05g37050、LOC_Os06g43090和LOC_Os08g33150在响应两种病毒侵染后表达量下调;而LOC_Os05g38460在响应两种病毒侵染后表达量上调。LOC_Os05g51160和LOC_Os09g26170在RGSV侵染后表达量上调,在RRSV侵染后表达量下调;而LOC_Os08g05520在RGSV侵染后表达量下调,在RRSV侵染后表达量上调。这10个基因中有7个在两种病毒侵染后表达量变化趋势相同,表明这些基因可能对病毒响应具有广谱性。这为深入解析OsMYBs在水稻与病毒互作中的功能提供了有用的信息。

关键词：水稻MYB基因水稻草状矮化病毒水稻锯齿叶矮缩病毒

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水稻草状矮化病毒侵染寄主水稻差异表达蛋白的鉴定和分析

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中国农业科学 2014年第9期47卷 1725-1734页

作者：丁新伦谢荔岩吴祖建福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒重点实验室

【目的】对水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)侵染寄主水稻后其叶片的差异表达蛋白进行筛选、鉴定和生物信息学分析,为进一步研究RGSV和寄主水稻互作的分子机制提供线索。【方法】采用双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimension... 详细信息

【目的】对水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)侵染寄主水稻后其叶片的差异表达蛋白进行筛选、鉴定和生物信息学分析,为进一步研究RGSV和寄主水稻互作的分子机制提供线索。【方法】采用双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE)和Image Master 2D platinum 7.0分析软件寻找差异表达蛋白,MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry)鉴定差异蛋白,利用BioTools软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质和功能查询。采用GOminer软件对差异蛋白进行GO(Gene ontology)聚类分析,KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库分析差异蛋白所参与的生物通路。【结果】建立了RGSV侵染与未侵染水稻的叶片双向荧光差异凝胶电泳图谱,RGSV病株与健株相比,差异倍数大于1.5的差异蛋白质点有173个,其中表达丰度升高的点有72个,表达丰度下降的点有101个,质谱鉴定了44个差异蛋白质点,25个获得成功鉴定,分属于24种蛋白质,包括RGSV的2种蛋白20.6K非结构蛋白和P5蛋白,水稻中的蛋白推定的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶前体、推定的酪氨酸磷酸酶、HAD超家族水解酶-亚族IA蛋白变体3蛋白、水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基结合2-羧基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸复合体、类似C1结构域蛋白以及其他一些功能未知蛋白和假定蛋白。对已鉴定蛋白的生物信息分析显示,差异蛋白涉及氮素固定、氮循环代谢过程、含氮化合物代谢过程、单一生物体代谢过程、代谢过程和生物过程等6个生物学过程,在生物功能上分属7类,包括分子功能、酸胺连接酶活性、酰胺连接酶活性、催化活性、谷氨酸氨连接酶、连接酶活性和形成C-N键的连接酶活性,在细胞组件上,差异蛋白分布于不同的细胞位置,涉及细胞组分、细胞器、细胞、膜结合细胞器、囊(泡)、细胞部分、膜结合囊(泡)、胞内、胞内部分、胞内细胞器、细胞质、胞内膜结合细胞器、细胞质部分、质体、细胞质囊(泡)和细胞质膜结合囊(泡)。KEGG通路分析显示,差异蛋白参与了代谢途径、光合生物固碳反应、碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸盐代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和氮代谢途径等10个KEGG代谢通路。【结论】RGSV侵染诱导了水稻差异蛋白质表达,获得了一些与RGSV侵染水稻相关的蛋白质分子,差异蛋白涉及到多个功能类别。其中与氮有关的生物学过程和光合作用过程变化较为明显。

关键词：水稻草状矮化病毒差异表达蛋白 2D-DIGE MALDI-TOF-MS

干扰水稻矮缩病毒(RDV)非结构蛋白Pns11的表达可抑制病毒在介体黑尾叶蝉内的复制

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农业生物技术学报 2015年第11期23卷 1401-1409页

作者：陈倩张玲华黄海宁魏太云谢联辉福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)主要由介体昆虫黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖型方式传播。在RDV侵染介体黑尾叶蝉培养细胞时,病毒编码的非结构蛋白Pns11参与形成病毒原质,但Pns11的具体功能尚不知晓。本研究应用RNA... 详细信息

水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)主要由介体昆虫黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖型方式传播。在RDV侵染介体黑尾叶蝉培养细胞时,病毒编码的非结构蛋白Pns11参与形成病毒原质,但Pns11的具体功能尚不知晓。本研究应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,将体外合成靶向Pns11基因的ds RNA转染黑尾叶蝉培养细胞,可显著降低Pns11的表达,并抑制病毒的积累和侵染。用显微注射技术将体外合成靶向Pns11基因的ds RNA导入到黑尾叶蝉,可显著抑制病毒在昆虫体内的侵染和扩散,最终降低介体传毒效率。结果表明,RDV Pns11是病毒在介体昆虫体内侵染和复制所必需的,是病毒复制的关键因子,可作为阻断病毒在介体内的复制和传播提供有效靶点。

关键词：水稻矮缩病毒(RDV) 病毒原质 Pns11 复制 RNA干扰(RNAi) 黑尾叶蝉

利用RNAi技术研究水稻瘤矮病毒P8蛋白在病毒装配中的作用

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农业生物技术学报 2014年第11期22卷 1418-1423页

作者：刘华敏郑立敏贾东升李俊钦陈红燕魏太云福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的一个成员,由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)和黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖型方式传播。其基因组编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。已知结构蛋白P8是病毒外层衣壳的主要成分,但其在病毒侵染介体细胞过程中的功能尚未弄清。本研究利用体外合成的ds RNA诱导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,研究RGDV P8蛋白在病毒侵染电光叶蝉培养细胞中的功能。通过免疫荧光标记技术对ds P8处理后的电光叶蝉培养细胞进行RGDV侵染观察,发现ds P8处理不仅抑制了P8在细胞内的正常表达,同时也抑制了病毒在细胞内的积累。随后通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分别检测病毒的ds RNA基因组和病毒蛋白水平的变化,发现ds P8处理显著降低了病毒双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)基因组的合成水平和病毒P8蛋白的表达量。由此推测RGDV P8蛋白参与了病毒粒体的组装过程和病毒在介体昆虫细胞内的有效增殖和侵染过程。本研究结果为利用RNAi技术控制水稻瘤矮病的传播提供了重要的理论依据。

关键词：水稻瘤矮病毒 P8蛋白 RNA干扰电光叶蝉介体昆虫培养细胞

SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1抗体的制备及应用

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农业生物技术学报 2016年第8期24卷 1190-1198页

作者：吴锦鸿陈晓敏林文武宛柏杰吴祖建张洁福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

为丰富南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的预测预报体系,本研究利用Gateway原核表达系统,将SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1进行了大量表达,纯化的表达蛋白分别免疫新西兰大白兔(Oryctolagus ... 详细信息

为丰富南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的预测预报体系,本研究利用Gateway原核表达系统,将SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1进行了大量表达,纯化的表达蛋白分别免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)获得抗血清,抗血清的间接酶联免疫吸附分析(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,in-ELISA)效价分别为1∶6 400和1∶3 200,Western blot检测结果表明,制备的2种抗体均具特异性。利用免疫捕获RT-PCR(immunocapture RT-PCR,IC-RT-PCR)和斑点酶联免疫吸附分析(dot enzyme-linked immunosorbent assay,dot-ELISA)方法比较两种抗体检测水稻(Oryza sativa)和白背飞虱(Sogatella furcifera,WBPH)带毒率的应用效果,结果表现一致,说明SRBSDV结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1均可用于病毒的田间检测,为病害的预测预报奠定了基础。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) 抗体免疫捕获RT-PCR 斑点酶联免疫吸附分析(dot-ELISA)

干扰水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)非结构蛋白Pns6的表达阻碍病毒在褐飞虱体内的增殖

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农业生物技术学报 2015年第11期23卷 1486-1493页

作者：陈红燕李俊钦刘宇艳郭年梅魏太云贾东升福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久增殖型方式传播。RRSV编码的非结构蛋白6(nonstructural protein 6,Pns6)是病毒原质的组分,但其在介体昆虫传毒中的功能未知。本研究利用ds RNA... 详细信息

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久增殖型方式传播。RRSV编码的非结构蛋白6(nonstructural protein 6,Pns6)是病毒原质的组分,但其在介体昆虫传毒中的功能未知。本研究利用ds RNA诱导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究Pns6蛋白在病毒侵染介体昆虫中的功能。通过膜饲喂法将源于Pns6基因的ds RNA(ds Pns6)以及源于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的ds RNA(ds GFP)分别导入2龄褐飞虱体内,并以饲喂10%蔗糖的处理为对照,之后于病株上获毒2 d。应用免疫荧光标记技术检测发现,昆虫获毒9 d后,ds GFP和10%蔗糖处理组褐飞虱的带毒率分别为27%和30%,而ds Pns 6处理组褐飞虱的带毒率仅为10%;同时q RT-PCR检测发现,Pns6蛋白的表达量受到抑制后,病毒编码的结构蛋白P8和P9的表达量也显著下降(P研究结果表明,Pns6是RRSV在褐飞虱体内增殖的重要蛋白,抑制Pns6的表达显著降低褐飞虱的带毒率并抑制病毒的增殖,同时削弱褐飞虱的传毒能力,明确了Pns6可作为理想的靶标用于阻断RRSV在褐飞虱体内的增殖。

关键词：水稻齿叶矮缩病毒(RRSV) RNA干扰(RNAi) 褐飞虱 Pns6蛋白增殖

水稻条纹病毒(RSV)外壳蛋白(CP)自身互作位点和亚细胞定位区域的鉴定

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农业生物技术学报 2015年第11期23卷 1421-1429页

作者：邓萍刘小娟杨靓吴祖建福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的外壳蛋白（coat protein,CP）参与病毒转录复制等多个过程,病毒蛋白之间的相互作用对病毒活性非常重要。本研究利用酵母双杂交技术（yeast two-hybrid,Y2H）和双分子荧光互补（bimolecular fluo... 详细信息

水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的外壳蛋白（coat protein,CP）参与病毒转录复制等多个过程,病毒蛋白之间的相互作用对病毒活性非常重要。本研究利用酵母双杂交技术（yeast two-hybrid,Y2H）和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）技术进一步研究了CP的自身互作位点及其在亚细胞定位中的影响。结果发现,CP的C端307;18位氨基酸区域对其自身互作是必需的,缺失或破坏该结构会导致CP无法实现自身互作,其中4个氨基酸（L308,V309,F312和F313）是互作的关键位点。CP定位于细胞膜和细胞质并且在细胞质中聚集成团,而CP点突变在植物叶片中定位被改变,主要定位于细胞膜,细胞质中没有聚集状颗粒物,说明CP的自身互作与其在植物中的定位是有相关性的两个过程。研究结果有助于揭示CP在RSV侵染过程中所起的重要作用。

关键词：水稻条纹病毒(RSV) 外壳蛋白(CP) 病毒蛋白自身互作亚细胞定位

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

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中国农业科学 2016年第20期49卷 3918-3926页

作者：沈林林邹文超高芳銮詹家绥福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及... 详细信息

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY已成为优势重组株系。

关键词：马铃薯Y病毒 ELISA 多基因联合序列系统发育重组株系

水稻DEAD-box RNA解旋酶OsRH37超表达和RNAi转基因水稻的获得及其亚细胞定位分析

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农业生物技术学报 2015年第11期23卷 1410-1420页

作者：张超高芳銮郑璐平丁作美杨振李阳吴建国吴祖建福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

DEAD-box RNA解旋酶(RNA helicase,RH)普遍存在于绝大多数的生物体中,参与到RNA新陈代谢的各个方面。本研究从日本晴水稻(Oryza sativa ***)叶片RNA中成功克隆DEAD-box RNA解旋酶基因Os RH37的CDS全长序列。序列比对发现,Os RH37的氨基... 详细信息

DEAD-box RNA解旋酶(RNA helicase,RH)普遍存在于绝大多数的生物体中,参与到RNA新陈代谢的各个方面。本研究从日本晴水稻(Oryza sativa ***)叶片RNA中成功克隆DEAD-box RNA解旋酶基因Os RH37的CDS全长序列。序列比对发现,Os RH37的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)DEAD-box RNA解旋酶17、37和52的氨基酸序列一致性>70%,与来自于不同动物体内DEAD-box RNA解旋酶的氨基酸序列一致性普遍生物信息学分析、超表达和RNAi转基因水稻的获得以及亚细胞定位分析将为研究其在水稻生长发育和胁迫反应中发挥的重要作用提供线索。

关键词： DEAD-box RNA解旋酶(RH) OsRH37 超表达 RNAi 亚细胞定位