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原核Argonaute的应用研究进展

华中农业大学学报 2024年第4期43卷 82-93页

作者：王飞李文强刘洋王珑瑜陈晚苹崔佳凯马立新省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室/工业生物技术湖北省重点实验室/湖北大学生命科学学院武汉430062

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬... 详细信息

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。

关键词：可编程核酸酶原核Argonaute 基因编辑分子诊断 DNA组装

水稻OsCNGC10基因抗倒伏性以及抗旱性功能研究

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作物学报 2024年第5期50卷 1351-1360页

作者：朱忠林文月周棋巫燕飞杜雪竹盛锋湖北大学生命科学学院/省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 湖北洪山实验室湖北武汉430062

环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道,存在于动物和植物体内,是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel,OsCNGC10)基因,构建了超表达载体pU1301-CNGC10-... 详细信息

环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道,存在于动物和植物体内,是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel,OsCNGC10)基因,构建了超表达载体pU1301-CNGC10-Flag和双靶点敲除载体pRGEB32-CRISPR/cas9-cngc10,通过农杆菌介导的遗传转化法获得敲除和过表达材料,并从T2代中分离到纯合植株oscngc10-2及OE-CNGC10-6。转基因植株茎秆特性以及抗倒伏性分析表明,突变体oscngc10-2茎秆强度和抗倒伏性增强;茎秆细胞壁组织切片以及组织成分分析则表明突变体oscngc10-2植株抗倒伏性增强是由于茎秆细胞壁茎壁厚度、薄壁组织细胞丰度以及木质素含量增加所致;过表达OsCNGC10降低了茎秆壁厚、茎秆木质素含量以及茎秆细胞壁细胞丰度,敲除OsCNGC10增加了茎秆木质素含量且增加了茎秆细胞壁薄壁细胞丰度,初步证明OsCNGC10与水稻茎秆细胞壁成分合成相关,负调控水稻抗倒伏性;T2代田间试验结果表明,与野生型相比,突变体oscngc10-2植株的株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状显著提升;苗期干旱胁迫实验结果表明,在干旱胁迫下,OsCNGC10基因缺陷型植株体内丙二醛(MDA)含量积累速度加快,且无法形成足够的游离脯氨酸,而过表达OsCNGC10植株在遭受干旱胁迫时,体内游离脯氨酸(Pro)含量大量升高,且MDA积累速度相对变慢,初步说明OsCNGC10正向调控水稻苗期抗旱性。本研究结果表明水稻OsCNGC10可能在水稻抗倒伏及抗旱方面有潜在功能,为培育抗倒伏且高产的水稻新品种提供了理论基础和新的种质资源。

关键词：水稻 OsCNGC10 抗倒伏抗旱细胞壁

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微生物法合成γ-氨基丁酸的研究进展

华中农业大学学报 2024年第4期43卷 94-101页

作者：王世依赵毅雯贾田丽陈守文湖北大学生命科学学院/省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,在食品、农业、医药、化工等领域具有广阔的应用前景。微生物法生产GABA因其温和、可持续发展等优势越来越受到人们的关注。因此,为了得到环保、便捷且效率更高的GABA... 详细信息

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,在食品、农业、医药、化工等领域具有广阔的应用前景。微生物法生产GABA因其温和、可持续发展等优势越来越受到人们的关注。因此,为了得到环保、便捷且效率更高的GABA生产方式,以满足食品、制药和畜牧领域对添加剂的严格要求,本文系统介绍了GABA的生产方法、生物体中的合成途径及微生物法生产GABA的研究进展,总结了目前全细胞催化法和微生物从头合成GABA的生产水平。研究者们致力于筛选和优化具有高催化效率和稳定性的酶并通过对微生物的代谢途径进行精细调控,以提高GABA的合成效率,未来的研究需要进一步优化酶和菌株的性能,降低生产成本,并探索更大规模的工业化生产途径。

关键词： γ-氨基丁酸合成途径微生物法合成谷氨酸脱羧酶

烟草化感自毒物质降解复合菌剂的优化及应用效果评价

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微生物学报 2024年第4期64卷 1044-1063页

作者：杨文娟余君杨春雷李浩杨锦鹏杨小琼杨勇向海波湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 湖北省烟草科学研究院湖北武汉430030

烟草(Nicotiana tabacum)长期连作导致土壤中烟草自身分泌的化感自毒物质的积累,加剧了烟草青枯病(tobacco bacterial wilt,TBW)的发生,严重威胁烟草的生产并造成了巨大的经济损失。【目的】获得对长期连作烟田青枯病具有显著防治效果... 详细信息

烟草(Nicotiana tabacum)长期连作导致土壤中烟草自身分泌的化感自毒物质的积累,加剧了烟草青枯病(tobacco bacterial wilt,TBW)的发生,严重威胁烟草的生产并造成了巨大的经济损失。【目的】获得对长期连作烟田青枯病具有显著防治效果的复合菌剂。【方法】利用筛选到的烟草化感自毒物质降解菌株构建复合菌剂,通过正交试验和单因素试验对菌种配比和助剂进行优化,对其在温室盆栽和连作烟田生产的应用效果进行评价。【结果】正交试验结果表明,复合菌剂中芽孢杆菌(Bacillus sp.)NO1、布鲁氏菌(Brucella sp.)NO8、芽孢杆菌(Bacillus sp.)NO9和NO10的最佳菌种配比为1:3:4:2;单因素试验结果表明最佳的载体为白炭黑;最佳润湿剂和分散剂分别为六偏磷酸钠和丁基萘磺酸钠,其最佳比例为1:1,最佳用量各为2%;稳定剂甘油的最佳浓度为1.0%。盆栽试验结果显示,复合菌剂对6种化感自毒物质的降解率和对青枯病的抑制率均达到78%以上。大田试验结果显示,100倍稀释的复合菌剂对连作15年烟田中的6种化感自毒物质具有显著的降解效果,并且能明显增加烟株的株高、茎围、腰叶长和腰叶宽,有效促进了烟草的生长发育;同时还调节了烟草根围微生物的丰度,显著抑制了狭义梭菌属1(Clostridium_sensu_stricto_1)、劳尔氏菌属(Ralstonia)和纤维单胞属(Cellulomonas)等的相对丰度,大幅提高了戴沃斯菌属(Devosia)、黄杆菌属(Flavobacterium)和鞘氨醇单胞属(Sphingomonas)等的相对丰度。青枯病的发病率和病情指数也从处理前的92.22%和48.19%分别降低到18.15%和9.52%,防效超过了80.00%。【结论】本研究优化的复合菌剂显著降低了长期连作烟田青枯病的病情指数,可为长期连作烟田青枯病的防控提供解决方案。

关键词：烟草青枯病化感自毒物质降解菌复合菌剂

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碳水化合物结合域对木聚糖酶酶学性质的影响

生物技术通报 2024年第5期40卷 269-279页

作者：蒋文萍冉秋萍刘家书张慧敏张迪江正兵李华南湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062 湖北大学生命科学学院武汉430062

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮... 详细信息

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1和CBM4。为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1和CBM4通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得4种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4。【结果】CBM1和CBM4与木聚糖结合率分别为89%和95%。在60℃,pH 7.0反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4的比活力分别是32 274.81、49 342.21、602.48、230.42和2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了1.5倍。酶学性质分析表明,CBM1使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在60℃孵育1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为81%和28%;在pH 3-11范围内,CBM1-XYN在4℃孵育12 h后能够保持90%以上的酶活力。【结论】在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活。

关键词：碳水化合物结合域木聚糖酶融合蛋白可溶性表达比活力温度稳定性 pH稳定性

多元介孔MOFs:通过调节表面亲水/疏水性实现酶固定化的多功能平台

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Chinese Journal of Catalysis 2024年第5期60卷 386-398页

作者：冯玉晓马庆庆王子辰张群力赵利雪崔建东杜英杰贾士儒天津科技大学生物工程学院食品营养与安全国家重点实验室工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 湖北大学生命科学学院生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 天津益倍生物科技集团有限公司天津300457 浙江大学生命科学学院生物质化工教育部重点实验室浙江杭州310050

作为高效的生物催化剂,酶在食品加工、医药制造、化学工业和能源开发等众多领域发挥着重要作用.然而,游离状态的酶由于存在稳定性差、易失活、难以回收利用及不适用于连续化生产等问题,限制了其广泛应用.为了解决上述难题,人们探索发展... 详细信息

作为高效的生物催化剂,酶在食品加工、医药制造、化学工业和能源开发等众多领域发挥着重要作用.然而,游离状态的酶由于存在稳定性差、易失活、难以回收利用及不适用于连续化生产等问题,限制了其广泛应用.为了解决上述难题,人们探索发展了固定化酶技术.固定化酶不仅保留了原有的催化活性,而且在稳定性方面有了显著提升,从而极大地提高了酶的利用效率.随着固定化酶材料和酶工程领域的不断发展,固定化酶技术为酶的应用开辟了更广阔的前景.沸石-咪唑骨架材料-8(ZIF-8)作为一种金属-有机骨架(MOFs)材料,因其独特的结构特性而被广泛用作酶固定化载体.然而,ZIF-8的微孔结构和固有的疏水性,以及前体物2-甲基咪唑(2-MeIm)的质子化现象,常常影响固定化酶的活性.为克服这些限制,本文采用多元配体竞争和孔隙工程相结合的策略,设计并制备了一种具有可调节亲水/疏水表面的新型多元介孔MOFs(mMOFs),并用作酶固定化载体.在mMOFs的制备过程中,采用亲水性和配位能力更强的3-甲基-1H-1,2,4-三唑(3-MTZ)和5-甲基四唑(5-MTA)配体,以部分替代传统的2-MeIm配体.随后,这些多元配体(包括2-MeIm,3-MTZ和5-MTA)与七水硫酸锌结合,在甲醇溶液中通过自凝聚作用形成透明的胶体溶液,进而完全溶解在水中.在此过程中,七水硫酸锌发挥了软模板的作用,引导介孔的形成,从而成功制备出新型多元介孔mMOFs.接着,利用这些mMOFs作为酶固定化的载体,固定了辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx),并详细研究了其催化性能.结果表明,与传统的ZIF-8载体相比,以mMOFs为载体的固定化酶展现出了更高的酶活性和稳定性.催化性能提升主要归因于mMOFs的亲水性和介孔结构改善了酶和底物间的传质,同时2-MeIm的质子化效应减弱也为酶提供了优良的微环境,稳定了酶的构象.综上,本文采用多元配体竞争与孔隙工程相结合的策略,成功构建了一种具有可调节亲水/疏水表面的新型多元介孔mMOFs,并用于酶固定化,所得固定化酶表现出较好的催化性能.通过深入的研究,揭示了该固定化酶表现出良好催化性能的作用机制,为可控设计制备性能优越的、以MOFs为载体的固定化酶提供了新思路,并为进一步拓宽MOFs材料的应用范围提供了参考.

关键词：介孔金属-有机骨架竞争性配体软模板固定化酶

基于定向进化提高漆酶的催化活性及其在造纸制浆中的应用

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生物工程学报 2024年

作者：倪红杨凡王磊李变霞李华南刘家书江正兵程万里湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北大学生命科学学院湖北工业大学材料与化学工程学院

在造纸工业中，漆酶作为一种生物催化剂，已经被广泛研究和应用。然而，天然漆酶在工业应用中存在着催化效率低、稳定性差等问题，限制了其在制浆工艺中的应用。为了进一步开发出酶活性高，耐受性强的漆酶，本文对短小芽孢杆菌属来源漆... 详细信息

在造纸工业中，漆酶作为一种生物催化剂，已经被广泛研究和应用。然而，天然漆酶在工业应用中存在着催化效率低、稳定性差等问题，限制了其在制浆工艺中的应用。为了进一步开发出酶活性高，耐受性强的漆酶，本文对短小芽孢杆菌属来源漆酶进行定向进化改造，利用高通量筛选方法从随机突变体文库中筛选得到突变体F282L/F306L、Q275P，其比酶活分别为280.8 U/mg、453.9 U/mg，是野生型漆酶的1.42倍、2.29倍；突变体Q275P的温度稳定性有明显提升，其在40 ℃、50 ℃、70 ℃孵育4 h后的剩余酶活与野生型漆酶相比均提高了20%以上；突变体F282L/F306L和Q275P相较野生型漆酶对多种金属离子和有机溶剂的耐受性增强。野生型漆酶的Km值为374.97 μmol/L，突变体F282L/F306L和Q275P的Km值分别减小至318.96 μmo/L和360.71 μmo/L，底物亲和性有所提高；F282L/F306L和Q275P对底物2，2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐(2，2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS)的Kcat值分别为574 s-1、898.03 s-1，分别是野生型漆酶的1.1倍和1.7倍，催化效率较高。在处理纸浆应用中，突变体Q275P处理纸浆效果最好，相比于野生型漆酶，卡伯值降低了0.82，白度提高了2% ISO，抗张指数和裂断长分别提高7.8%和7.2%。本研究工作为漆酶更好地适应造纸工业环境奠定了基础。

关键词：漆酶生物漂白定向进化酶学特性纸浆

可注射荧光硫化铋/金纳米簇水凝胶用于肿瘤术后光热治疗和促进伤口愈合性能分析

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分析化学 2024年第7期52卷 955-963页

作者：李卓杨绍贤刘蕊杨正林曹玉玉孙红梅湖北工业大学生命科学与健康工程学院发酵工程教育部重点实验室国家细胞调控与分子药物“111”引智基地工业微生物湖北省重点实验室湖北省工业发酵协同创新中心

以生物相容性良好的壳聚糖（CS）和硫化铋-金纳米簇纳米颗粒（Bi2S3-Au NCs NPs）为原料，制备了具有肿瘤术后残余组织光热治疗和促进术后伤口愈合功能的新型水凝胶敷料。通过在CS上接枝具有贻贝类活性的邻苯二酚基团，提高了水凝胶与... 详细信息

以生物相容性良好的壳聚糖（CS）和硫化铋-金纳米簇纳米颗粒（Bi2S3-Au NCs NPs）为原料，制备了具有肿瘤术后残余组织光热治疗和促进术后伤口愈合功能的新型水凝胶敷料。通过在CS上接枝具有贻贝类活性的邻苯二酚基团，提高了水凝胶与组织的黏附性。在室温（25℃）下，邻苯二酚改性壳聚糖（CHI-C）和Bi2S3-Au NCs NPs经过简单搅拌混匀后，即可形成交联网络。本研究制备的Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝胶可在1 min内在小鼠黑色素瘤术后伤口原位形成交联网络，并且在808 nm近红外光照射下，其温度可升至49.2℃，从而可有效杀死残余肿瘤细胞，防止术后伤口细菌感染。在365 nm紫外光照射下，此水凝胶发射强烈的红色荧光，可用于实时精准监测其伤口填充情况，有利于伤口特别是不规则伤口的愈合。本研究制备的智能水凝胶为防止和降低肿瘤术后复发和伤口感染提供了新思路。

关键词：多功能水凝胶硫化铋-金纳米簇光热治疗荧光术后伤口

来源：博看期刊

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人博卡病毒1型感染性克隆的构建及鉴定

生物工程学报 2024年第2期40卷 485-495页

作者：杨暄苏丽芳王悦王媛董衍明湖北大学生命科学学院生物催化与酶工程省部共建国家重点实验室湖北武汉430062 湖北文理学院基础医学院湖北襄阳441053

人博卡病毒1(human bocaparvovirus 1,HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2-5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR)... 详细信息

人博卡病毒1(human bocaparvovirus 1,HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2-5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR),为病毒基因组复制所必需,但是难以进行PCR扩增合成。本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1的全长感染性克隆pSKHBoV1。经转染HEK293细胞后,分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面,证实构建的感染性克隆在转染HEK293细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力,这为后续研究HBoV1的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础。

关键词：人博卡病毒感染性克隆人工合成病毒复制