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融合大肠杆菌素DNA结合域的Taq DNA聚合酶的性质表征

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生物工程学报 2024年第3期40卷 812-820页

作者：王亚平平啸寅赵艺刘阳吴林马立新湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062

Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠... 详细信息

Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠杆菌素。Taq DNA聚合酶由5′→3′核酸外切酶结构域、3′→5′核酸外切酶结构域以及聚合酶结构域组成。缺失5′→3′核酸外切酶结构域的Taq DNA聚合酶(ΔTaq)具有更高的产量,但是其进行性很低,无法扩增长片段。为了提高ΔTaq的进行性,本研究融合dCE和ΔTaq,发现dCE-ΔTaq的进行性相比于Taq DNA聚合酶和dCE-Taq显著提升,并且其逆转录酶活性也比ΔTaq更高。dCE8-ΔTaq的提升最明显,不仅能够1 min内扩增8 kb的DNA片段,并且产量高于其他突变体。综上所述,本研究通过将ΔTaq DNA聚合酶和dCE进行融合,提升了Taq DNA聚合酶的PCR效率和逆转录活性,为改造Taq DNA聚合酶提供了新的方法,有望开发出性质更好的Taq DNA聚合酶。

关键词： Taq DNA聚合酶 CE PCR效率逆转录活性

水稻OsCNGC10基因抗倒伏性以及抗旱性功能研究

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作物学报 2024年第5期50卷 1351-1360页

作者：朱忠林文月周棋巫燕飞杜雪竹盛锋湖北大学生命科学学院/省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 湖北洪山实验室湖北武汉430062

环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道,存在于动物和植物体内,是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel,OsCNGC10)基因,构建了超表达载体pU1301-CNGC10-... 详细信息

环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道,存在于动物和植物体内,是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel,OsCNGC10)基因,构建了超表达载体pU1301-CNGC10-Flag和双靶点敲除载体pRGEB32-CRISPR/cas9-cngc10,通过农杆菌介导的遗传转化法获得敲除和过表达材料,并从T2代中分离到纯合植株oscngc10-2及OE-CNGC10-6。转基因植株茎秆特性以及抗倒伏性分析表明,突变体oscngc10-2茎秆强度和抗倒伏性增强;茎秆细胞壁组织切片以及组织成分分析则表明突变体oscngc10-2植株抗倒伏性增强是由于茎秆细胞壁茎壁厚度、薄壁组织细胞丰度以及木质素含量增加所致;过表达OsCNGC10降低了茎秆壁厚、茎秆木质素含量以及茎秆细胞壁细胞丰度,敲除OsCNGC10增加了茎秆木质素含量且增加了茎秆细胞壁薄壁细胞丰度,初步证明OsCNGC10与水稻茎秆细胞壁成分合成相关,负调控水稻抗倒伏性;T2代田间试验结果表明,与野生型相比,突变体oscngc10-2植株的株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状显著提升;苗期干旱胁迫实验结果表明,在干旱胁迫下,OsCNGC10基因缺陷型植株体内丙二醛(MDA)含量积累速度加快,且无法形成足够的游离脯氨酸,而过表达OsCNGC10植株在遭受干旱胁迫时,体内游离脯氨酸(Pro)含量大量升高,且MDA积累速度相对变慢,初步说明OsCNGC10正向调控水稻苗期抗旱性。本研究结果表明水稻OsCNGC10可能在水稻抗倒伏及抗旱方面有潜在功能,为培育抗倒伏且高产的水稻新品种提供了理论基础和新的种质资源。

关键词：水稻 OsCNGC10 抗倒伏抗旱细胞壁

烟草化感自毒物质降解复合菌剂的优化及应用效果评价

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微生物学报 2024年第4期64卷 1044-1063页

作者：杨文娟余君杨春雷李浩杨锦鹏杨小琼杨勇向海波湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 湖北省烟草科学研究院湖北武汉430030

烟草(Nicotiana tabacum)长期连作导致土壤中烟草自身分泌的化感自毒物质的积累,加剧了烟草青枯病(tobacco bacterial wilt,TBW)的发生,严重威胁烟草的生产并造成了巨大的经济损失。【目的】获得对长期连作烟田青枯病具有显著防治效果... 详细信息

烟草(Nicotiana tabacum)长期连作导致土壤中烟草自身分泌的化感自毒物质的积累,加剧了烟草青枯病(tobacco bacterial wilt,TBW)的发生,严重威胁烟草的生产并造成了巨大的经济损失。【目的】获得对长期连作烟田青枯病具有显著防治效果的复合菌剂。【方法】利用筛选到的烟草化感自毒物质降解菌株构建复合菌剂,通过正交试验和单因素试验对菌种配比和助剂进行优化,对其在温室盆栽和连作烟田生产的应用效果进行评价。【结果】正交试验结果表明,复合菌剂中芽孢杆菌(Bacillus sp.)NO1、布鲁氏菌(Brucella sp.)NO8、芽孢杆菌(Bacillus sp.)NO9和NO10的最佳菌种配比为1:3:4:2;单因素试验结果表明最佳的载体为白炭黑;最佳润湿剂和分散剂分别为六偏磷酸钠和丁基萘磺酸钠,其最佳比例为1:1,最佳用量各为2%;稳定剂甘油的最佳浓度为1.0%。盆栽试验结果显示,复合菌剂对6种化感自毒物质的降解率和对青枯病的抑制率均达到78%以上。大田试验结果显示,100倍稀释的复合菌剂对连作15年烟田中的6种化感自毒物质具有显著的降解效果,并且能明显增加烟株的株高、茎围、腰叶长和腰叶宽,有效促进了烟草的生长发育;同时还调节了烟草根围微生物的丰度,显著抑制了狭义梭菌属1(Clostridium_sensu_stricto_1)、劳尔氏菌属(Ralstonia)和纤维单胞属(Cellulomonas)等的相对丰度,大幅提高了戴沃斯菌属(Devosia)、黄杆菌属(Flavobacterium)和鞘氨醇单胞属(Sphingomonas)等的相对丰度。青枯病的发病率和病情指数也从处理前的92.22%和48.19%分别降低到18.15%和9.52%,防效超过了80.00%。【结论】本研究优化的复合菌剂显著降低了长期连作烟田青枯病的病情指数,可为长期连作烟田青枯病的防控提供解决方案。

关键词：烟草青枯病化感自毒物质降解菌复合菌剂

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碳水化合物结合域对木聚糖酶酶学性质的影响

生物技术通报 2024年第5期40卷 269-279页

作者：蒋文萍冉秋萍刘家书张慧敏张迪江正兵李华南湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062 湖北大学生命科学学院武汉430062

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮... 详细信息

【目的】旨在探究不同来源碳水化合物结合域(CBM)对山毛榉木聚糖的结合能力,并将具有较高结合能力的外源CBM融合到链霉菌L10904木聚糖酶(XYN)的C端和N端,以探究外源CBM对木聚糖酶酶学性质的影响。【方法】通过底物吸附方法,利用考马斯亮蓝G250法检测溶液中CBM在吸附前后的浓度,计算CBM的底物结合率,筛选到了结合木聚糖能力较好的CBM1和CBM4。为了探究对底物结合能力高的CBM融合位置对木聚糖酶酶学性质的影响,将CBM1和CBM4通过柔性连接肽分别与XYN的C端和N端融合,并在大肠杆菌中表达获得4种重组酶,分别命名为CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4。【结果】CBM1和CBM4与木聚糖结合率分别为89%和95%。在60℃,pH 7.0反应条件下,XYN、CBM1-XYN、XYN-CBM1、CBM4-XYN和XYN-CBM4的比活力分别是32 274.81、49 342.21、602.48、230.42和2 362.24 U/mg,CBM1-XYN比活力较XYN比活力提高了1.5倍。酶学性质分析表明,CBM1使XYN温度稳定性和pH稳定性得到了提高,将XYN和CBM1-XYN分别在60℃孵育1 h,CBM1-XYN残余酶活力和XYN残余酶活力分别为81%和28%;在pH 3-11范围内,CBM1-XYN在4℃孵育12 h后能够保持90%以上的酶活力。【结论】在大肠杆菌中成功异源表达了链霉菌来源的木聚糖酶,筛选到了对底物结合率高的两种CBM1和CBM4,并通过蛋白质融合技术成功将CBM融合到XYN上,获得酶学性质得到改良的CBM1-XYN,能够提高木聚糖酶的温度稳定性、pH耐受性及比酶活。

关键词：碳水化合物结合域木聚糖酶融合蛋白可溶性表达比活力温度稳定性 pH稳定性

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原核Argonaute的应用研究进展

华中农业大学学报 2024年第4期43卷 82-93页

作者：王飞李文强刘洋王珑瑜陈晚苹崔佳凯马立新省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室/工业生物技术湖北省重点实验室/湖北大学生命科学学院武汉430062

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬... 详细信息

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。

关键词：可编程核酸酶原核Argonaute 基因编辑分子诊断 DNA组装

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微生物法合成γ-氨基丁酸的研究进展

华中农业大学学报 2024年第4期43卷 94-101页

作者：王世依赵毅雯贾田丽陈守文湖北大学生命科学学院/省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,在食品、农业、医药、化工等领域具有广阔的应用前景。微生物法生产GABA因其温和、可持续发展等优势越来越受到人们的关注。因此,为了得到环保、便捷且效率更高的GABA... 详细信息

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种四碳非蛋白质氨基酸,在食品、农业、医药、化工等领域具有广阔的应用前景。微生物法生产GABA因其温和、可持续发展等优势越来越受到人们的关注。因此,为了得到环保、便捷且效率更高的GABA生产方式,以满足食品、制药和畜牧领域对添加剂的严格要求,本文系统介绍了GABA的生产方法、生物体中的合成途径及微生物法生产GABA的研究进展,总结了目前全细胞催化法和微生物从头合成GABA的生产水平。研究者们致力于筛选和优化具有高催化效率和稳定性的酶并通过对微生物的代谢途径进行精细调控,以提高GABA的合成效率,未来的研究需要进一步优化酶和菌株的性能,降低生产成本,并探索更大规模的工业化生产途径。

关键词： γ-氨基丁酸合成途径微生物法合成谷氨酸脱羧酶

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烟叶蛋白质降解菌的筛选及其作用效果研究

烟草科技 2024年

作者：周艳霞赵婉杨勇向海波孙敬国陈振国孙光伟湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北省烟草科学研究院

为了有效降解烟叶中的蛋白质，提高烟叶品质，从烟叶表面及内部、烟草根际土壤中分离筛选出可以降解烟叶蛋白质的菌株，在烘烤前将其喷施在烟叶表面，比较喷施前后的烟叶生理生化、外观质量与感官质量的变化，并采用扩增子测序技术和转... 详细信息

为了有效降解烟叶中的蛋白质，提高烟叶品质，从烟叶表面及内部、烟草根际土壤中分离筛选出可以降解烟叶蛋白质的菌株，在烘烤前将其喷施在烟叶表面，比较喷施前后的烟叶生理生化、外观质量与感官质量的变化，并采用扩增子测序技术和转录组学技术对喷施前后的烟叶微生物群落和烟叶基因表达的变化进行了分析。结果分离筛选得到1株特基拉芽孢杆菌YP5，初产蛋白酶活性为71.05 U/mL，经该菌处理后的烟叶烘烤后的蛋白质含量为2.87 mg/g，较对照组（4.55 mg/g）降低了36.92%，烘烤过程中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和淀粉酶的活性均上升，多酚氧化酶（PPO）和硝酸还原酶（NR）的活性均下降，烤后烟叶化学成分协调、外观质量好、中等烟比例提高，烟叶整体质量得到明显提升。与对照组相比，菌株YP5处理组的烟叶中细菌丰度明显提升而真菌丰度显著下降。转录组学分析发现，菌株YP5处理主要影响了烟叶的苯丙烷类生物合成、氧化磷酸化和光合作用等代谢通路。

关键词：烟叶微生物蛋白质降解菌氧化还原酶扩增子测序转录组学分析

基于定向进化提高漆酶的催化活性及其在造纸制浆中的应用

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生物工程学报 2024年

作者：倪红杨凡王磊李变霞李华南刘家书江正兵程万里湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北大学生命科学学院湖北工业大学材料与化学工程学院

在造纸工业中，漆酶作为一种生物催化剂，已经被广泛研究和应用。然而，天然漆酶在工业应用中存在着催化效率低、稳定性差等问题，限制了其在制浆工艺中的应用。为了进一步开发出酶活性高，耐受性强的漆酶，本文对短小芽孢杆菌属来源漆... 详细信息

在造纸工业中，漆酶作为一种生物催化剂，已经被广泛研究和应用。然而，天然漆酶在工业应用中存在着催化效率低、稳定性差等问题，限制了其在制浆工艺中的应用。为了进一步开发出酶活性高，耐受性强的漆酶，本文对短小芽孢杆菌属来源漆酶进行定向进化改造，利用高通量筛选方法从随机突变体文库中筛选得到突变体F282L/F306L、Q275P，其比酶活分别为280.8 U/mg、453.9 U/mg，是野生型漆酶的1.42倍、2.29倍；突变体Q275P的温度稳定性有明显提升，其在40 ℃、50 ℃、70 ℃孵育4 h后的剩余酶活与野生型漆酶相比均提高了20%以上；突变体F282L/F306L和Q275P相较野生型漆酶对多种金属离子和有机溶剂的耐受性增强。野生型漆酶的Km值为374.97 μmol/L，突变体F282L/F306L和Q275P的Km值分别减小至318.96 μmo/L和360.71 μmo/L，底物亲和性有所提高；F282L/F306L和Q275P对底物2，2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐(2，2′-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS)的Kcat值分别为574 s-1、898.03 s-1，分别是野生型漆酶的1.1倍和1.7倍，催化效率较高。在处理纸浆应用中，突变体Q275P处理纸浆效果最好，相比于野生型漆酶，卡伯值降低了0.82，白度提高了2% ISO，抗张指数和裂断长分别提高7.8%和7.2%。本研究工作为漆酶更好地适应造纸工业环境奠定了基础。

关键词：漆酶生物漂白定向进化酶学特性纸浆

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人博卡病毒1型感染性克隆的构建及鉴定

生物工程学报 2024年第2期40卷 485-495页

作者：杨暄苏丽芳王悦王媛董衍明湖北大学生命科学学院生物催化与酶工程省部共建国家重点实验室湖北武汉430062 湖北文理学院基础医学院湖北襄阳441053

人博卡病毒1(human bocaparvovirus 1,HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2-5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR)... 详细信息

人博卡病毒1(human bocaparvovirus 1,HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2-5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR),为病毒基因组复制所必需,但是难以进行PCR扩增合成。本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1的全长感染性克隆pSKHBoV1。经转染HEK293细胞后,分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面,证实构建的感染性克隆在转染HEK293细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力,这为后续研究HBoV1的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础。

关键词：人博卡病毒感染性克隆人工合成病毒复制