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柯萨奇病毒A组6型对长爪沙鼠的感染性研究

中华实验和临床病毒学杂志 2019年第6期33卷 561-565页

作者：高孟高丽美吴洁李剑波周冬杨宏宏罗永能浙江省医学科学院病毒病研究所杭州310013

目的研究柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A group 6 type, CV-A6)对长爪沙鼠的感染性。方法选取5个不同日龄组的长爪沙鼠,腹腔接种1×105 TCID50/只CV-A6 XS45株进行攻毒试验,观察各组病态症状,确定长爪沙鼠合适的攻毒日龄;而后选... 详细信息

目的研究柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A group 6 type, CV-A6)对长爪沙鼠的感染性。方法选取5个不同日龄组的长爪沙鼠,腹腔接种1×105 TCID50/只CV-A6 XS45株进行攻毒试验,观察各组病态症状,确定长爪沙鼠合适的攻毒日龄;而后选取合适日龄长爪沙鼠用3个剂量进行攻毒,观察剂量效应关系;攻毒长爪沙鼠病理组织(脑、肌肉、肠道)的病毒载量情况用荧光定量RT-PCR进行检测,组织感染病变情况用免疫组化进行检测。结果 1×105 TCID50/只的攻毒量CV-A6可造成7~35日龄长爪沙鼠100%发病、死亡,攻毒长瓜沙鼠症状评分变化趋势与鼠龄呈正相关;1×103 TCID50/只、1×104 TCID50/只、1×105 TCID50/只剂量组攻毒均可引起28日龄长爪沙鼠100%发病、死亡,攻毒长爪沙鼠症状评分变化趋势与攻毒剂量呈负相关;攻毒长爪沙鼠脑、肌肉、肠道组织均有不同程度的病毒载量,其中肌肉中的病毒载量高于其他组织,且组织中均发现病毒感染后细胞病变区域。结论长爪沙鼠对CV-A6有很强的发病及死亡敏感性,可以作为理想的动物感染模型。

关键词：柯萨奇病毒A组6型长爪沙鼠感染模型

柯萨奇病毒A16型感染性模型的建立及其相关免疫学指标和应用的评价

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中国比较医学杂志 2017年第1期27卷 37-42页

作者：张锋高孟高丽美罗永能浙江省医学科学院病毒病研究所杭州310013

目的建立简便和可靠的对柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)敏感的小型啮齿类实验动物模型。方法选取不同日龄长爪沙鼠,腹腔接种CVA16后连续观察14 d,筛选出对病毒敏感的最适接种日龄段;然后比较接种剂量与效应关系,测定其50%... 详细信息

目的建立简便和可靠的对柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)敏感的小型啮齿类实验动物模型。方法选取不同日龄长爪沙鼠,腹腔接种CVA16后连续观察14 d,筛选出对病毒敏感的最适接种日龄段;然后比较接种剂量与效应关系,测定其50%致死剂量(LD50);并测定感染3 d后其血液和主要组织器官中CVA16病毒滴度;最后用CVA16灭活疫苗在1日龄和11日龄免疫2针沙鼠后,在14日龄时用LD50剂量病毒攻毒,观察并记录沙鼠体重、症状及死亡率,2周后眼球采血,应用微量中和试验和ELISA分别检测中和抗体效价和总抗体水平。结果长爪沙鼠感染CVA16后出现活动减少、后肢无力、麻痹瘫痪、死亡等临床症状,不同日龄沙鼠对CVA16感染的易感能力和感染后发病程度不同,7日龄和14日龄沙鼠易感,28日龄沙鼠不易感染,最敏感和最合适接种日龄为14日龄,其LD50为1×104.5 CCID50,感染3 d后其血液和主要组织器官中均可检测到高滴度的CVA16病毒,免疫两针灭活疫苗的14日龄沙鼠用LD50剂量攻毒,存活率87.5%,疫苗免疫诱导沙鼠产生的CVA16中和抗体几何平均值(GMT)为28.14,抗体阳性率为87.5%。结论长爪沙鼠对CVA16敏感并且病毒能在其体内进行有效的复制和繁殖,可作为CVA16致病机制研究、疫苗研发及药物评价的可靠小动物模型。

关键词：柯萨奇病毒A16型长爪沙鼠动物模型

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白优势线性B细胞抗原决定簇的预测与确定

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病毒学报 2016年第5期32卷 597-602页

作者：陈军孙培蓓张锋顾春燕高孟倪红霞罗永能浙江省医学科学院病毒病研究所杭州310013 宁波市疾病预防控制中心病毒研究所宁波315010

为了确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核衣壳蛋白(N蛋白)的优势线性B细胞抗原决定簇位点,本文根据线性B细胞抗原表位拥有较强的抗原性、亲水性以及表面性等特点,运用生... 详细信息

为了确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核衣壳蛋白(N蛋白)的优势线性B细胞抗原决定簇位点,本文根据线性B细胞抗原表位拥有较强的抗原性、亲水性以及表面性等特点,运用生物信息学软件分析SFTSV N蛋白的氨基酸序列,预测潜在的线性B细胞抗原决定簇位点。根据已解析的SFTSV N蛋白晶体结构,使用PyMOL软件分析预测出的线性B细胞抗原决定簇位点的柔性及其在整个SFTSV N蛋白中的分布情况。人工合成相应多肽片段并以其为抗原,与SFTSV临床感染者的血清反应,采用多肽-酶联免疫吸附检测法检验多肽片段的免疫原性。结果共预测出六个可能的线性B细胞抗原决定簇位点,即A(40-KKLKETGGDDWVKDTK-55)、B(71-ASGKMSNSGSKRL-83)、C(94-ERAETRL-100)、D(135-LKVENYPP-142)、E(157-GVSEATT-163)和F(184-KMRGASKTEVYNSFRDP-200),均位于N蛋白表面且含有柔性较大的loop区。相应的六段人工合成多肽都与SFTSV临床病例血清呈阳性反应,确定它们均为优势线性B细胞抗原决定簇位点,其各自检测结果与商品化N蛋白抗体检测试剂盒相应检测结果进行线性回归分析表明呈正相关。综合运用上述多种方法,本研究成功地预测并确定了SFTSV N蛋白的线性B细胞抗原决定簇位点,为该病毒抗原特异性的分子基础研究以及相关疾病的诊断和治疗奠定了基础。

关键词：发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV) 核衣壳蛋白(N蛋白) 线性B细胞抗原决定簇多肽-酶联免疫吸附检测

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胎牛血清细菌内毒素检测方法创建

中国卫生检验杂志 2020年第9期30卷 1059-1062页

作者：朱莲陈军陈卓浙江省医学科学院病毒病研究所浙江杭州310051

目的建立胎牛血清中细菌内毒素鲎试剂检测方法。方法首先,对2个厂家的3批鲎试剂进行灵敏度复核;其次,对供试品进行干扰初筛试验,并采用鲎试剂凝胶法对2个厂家生产的鲎试剂与同一厂家生产的3个批号的胎牛血清分别进行正式干扰试验;最后,... 详细信息

目的建立胎牛血清中细菌内毒素鲎试剂检测方法。方法首先,对2个厂家的3批鲎试剂进行灵敏度复核;其次,对供试品进行干扰初筛试验,并采用鲎试剂凝胶法对2个厂家生产的鲎试剂与同一厂家生产的3个批号的胎牛血清分别进行正式干扰试验;最后,建立胎牛血清细菌内毒素分析方法。结果首先,2个厂家的3批鲎试剂灵敏度测定值均符合规定;其次,样品稀释至333倍时,可用作正式干扰试验,并且在胎牛血清最大有效稀释倍数为333倍时,对鲎试剂无干扰,正式干扰试验符合规定;最后,用2个厂家灵敏度为0. 03 EU/ml的鲎试剂对3批同一厂家生产的胎牛血清进行了细菌内毒素检测,限值均符合规定。结论用鲎试剂检查胎牛血清细菌内毒素方法可行。

关键词：胎牛血清细菌内毒素鲎试剂干扰试验

冻干甲型肝炎减毒活疫苗诱导的人体特异性免疫应答

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 180-182页

作者：忻亚娟庄昉成姜立民钱汶唐彩华陈悦青吴洁柴少爱浙江省医学科学院病毒病研究所杭州310013

目的观察人体接种冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)后产生的特异性免疫应答。方法选择16名血清甲型肝炎抗体阴性的健康志愿者,接种1针冻干甲型肝炎减毒活疫苗,接种前和接种后2、4、8、12、156周(3年)采血,采用ELISA检测血清抗HAVIgG抗体;... 详细信息

目的观察人体接种冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)后产生的特异性免疫应答。方法选择16名血清甲型肝炎抗体阴性的健康志愿者,接种1针冻干甲型肝炎减毒活疫苗,接种前和接种后2、4、8、12、156周(3年)采血,采用ELISA检测血清抗HAVIgG抗体;采用流式细胞术检测全血各淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的百分率及表达细胞因子IFN-γ和IL-4的阳性细胞百分率;采用ELISPOT法检测外周血淋巴细胞分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)。结果接种疫苗后2周,表达IL-4的阳性细胞百分率与接种前相比显著升高;接种后4周,CD4+淋巴细胞亚群百分率与接种前相比显著升高;接种后8周,抗体100%阳转;接种后3年,抗体和分泌IFN-γ的SFC有一项以上阳性者占85.7%(12/14)。结论接种冻干甲型肝炎减毒活疫苗,能诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。

关键词：冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H2株) 体液免疫细胞免疫

重组4-1BB配体对治疗性重组人乳头瘤病毒16型蛋白疫苗的佐剂作用

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国际生物制品学杂志 2017年第2期40卷 68-74页

作者：高孟高丽美朱赟陈刚吴洁许玲敏罗永能庄昉成浙江省医学科学院病毒病研究所杭州311013

目的研究重组4-1BB配体（recombinant 4-1BB ligand，r4—1BBL）作为佐剂对治疗性重组人乳头瘤病毒16型（humanpapillomavirus16，HPVl6）蛋白疫苗（HPVl6蛋白疫苗）免疫效果的影响。方法对4-1BBL胞外功能区进行密码子优化，并通过NdeI... 详细信息

目的研究重组4-1BB配体（recombinant 4-1BB ligand，r4—1BBL）作为佐剂对治疗性重组人乳头瘤病毒16型（humanpapillomavirus16，HPVl6）蛋白疫苗（HPVl6蛋白疫苗）免疫效果的影响。方法对4-1BBL胞外功能区进行密码子优化，并通过NdeI和XhoI酶切位点定向插入pET28a表达载体。将获得的重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21（DE3），并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达。用蛋白质印迹法对重组蛋白进行鉴定，并用非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电子显微镜分析重组蛋白结构。用CCK-8试剂盒检测纯化r4-IBBL对小鼠T细胞体外增殖的影响。同时将r4-1BBL与HPV16蛋白疫苗联合免疫C57BL／6小鼠，用酶联免疫斑点试验检测小鼠的细胞免疫应答水平，观察r4-1BBL对HPV16蛋白疫苗抑制肿瘤生长的影响。结果密码子优化的4-1BBL胞外功能区能在重组表达载体中表达，且表达产物同时以包涵体和可溶性形式存在。可溶性产物的结构主要为二聚体，电子显微镜下可以观察到类似亚单位的结构。纯化r4-1BBL可促进小鼠脾淋巴细胞的体外增殖。与单纯HPV16蛋白疫苗相比，r4—1BBL联合HPV16蛋白疫苗能诱导更强的特异性细胞免疫应答（t=3．525，P=0．024）和产生更明显的肿瘤生长抑制作用（t=2．534，P=0．021）。结论r4-1BBLL在小鼠中提高HPV16蛋白疫苗的免疫效果，具有作为HPV16蛋白疫苗佐剂的潜力。

关键词：重组蛋白类佐剂免疫人乳头瘤病毒16 乳头状瘤病毒疫苗

针对肠道病毒71型的新型重组融合蛋白类病毒颗粒疫苗研制及其免疫效果评价

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中华临床感染病杂志 2017年第4期10卷 268-273页

作者：蔡静顾春燕张锋高孟高丽美罗永能浙江省医学科学院病毒病研究所杭州310013

目的研制针对肠道病毒71型（EV71）的新型重组类病毒颗粒疫苗,并评价其免疫效果.方法利用诺如病毒（NoV）衣壳蛋白（VP1）P区（NoVP）可呈现外源抗原并形成类病毒颗粒的特点,构建获得只包含NoVP或在其表面环位点串联插入EV71衣壳蛋白... 详细信息

目的研制针对肠道病毒71型（EV71）的新型重组类病毒颗粒疫苗,并评价其免疫效果.方法利用诺如病毒（NoV）衣壳蛋白（VP1）P区（NoVP）可呈现外源抗原并形成类病毒颗粒的特点,构建获得只包含NoVP或在其表面环位点串联插入EV71衣壳蛋白的三个特异性抗原位点（VP1的SP55和SP70,VP2的VP2-28）基因片段,克隆至质粒pET-28a（＋）后分别转化大肠杆菌后诱导表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹和透射电镜鉴定和观察表达的重组融合蛋白（NoVP＋ EV71-SP55-SP70-VP2-28）和NoVP蛋白.同时,采用随机分组法将BALB/C小鼠分成A、B和C三组,每组10只,分别用重组融合蛋白（NoVP＋ EV71-SP55-SP70-VP2-28）、NoVP和透析液免疫获得抗血清,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中特异性抗体;将小鼠血清与EV71 H3-TY株混合,加入Vero细胞,通过微量中和实验检测特异性抗体效价.采用方差分析和Bonferroni检验对数据进行分析.结果重组表达产物在大肠杆菌中以包涵体形式存在,SDS-PAGE显示重组融合蛋白和NoVP相对分子质量约为43×10^3和36×10^3;免疫印迹显示重组融合蛋白在相对分子质量约为43×10^3处有特异性条带,透射电镜观察显示重组融合蛋白呈现类病毒颗粒.ELISA显示与SP70多肽反应的小鼠血清吸光度（A490）值A组明显大于B组和C组（F=13.860,P＜0.05）;微量中和实验显示A组小鼠血清针对EV71 H3-TY株的几何平均中和滴度为1∶38.结论本研究初步获得了针对EV71的一种新型重组融合蛋白类病毒颗粒疫苗,其具有良好的抗原性和特异性,能诱导小鼠产生较高中和滴度的特异性抗体.

关键词：肠道病毒属肠道病毒71型诺如病毒酶联免疫吸附测定类病毒颗粒疫苗微量中和实验 Enterovirus 71

人乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白的优化表达、制备及其对肿瘤生长的抑制作用

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生物工程学报 2015年第4期31卷 566-576页

作者：姜云水李剑波高孟任皎金素凤陈刚吴洁庄昉成田厚文浙江省医学科学院病毒病研究所浙江省医学生物工程疫苗研究开发重点实验室浙江杭州310052 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

为提高人乳头瘤病毒(HPV)16型治疗性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达量,根据大肠杆菌偏爱密码子,对HPV16 l2e7基因进行密码子优化,优化后的基因分别插入到p GEX-5X-1、p QE30和p ET41a表达载体中,转化JM109、JM109(DE3)和BL21... 详细信息

为提高人乳头瘤病毒(HPV)16型治疗性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达量,根据大肠杆菌偏爱密码子,对HPV16 l2e7基因进行密码子优化,优化后的基因分别插入到p GEX-5X-1、p QE30和p ET41a表达载体中,转化JM109、JM109(DE3)和BL21(DE3)表达菌,筛选出高表达菌株p ET41a-HPV16sl2e7/BL21(DE3),目的蛋白从占全菌蛋白的10%以下提高到约28%,优化接种量、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,获得最佳表达条件;通过15 L发酵罐发酵,SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg纯化及复性HPV16 L2E7融合蛋白,制备的融合蛋白纯度可达95%以上,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定证实,制备的HPV16 L2E7蛋白加Cp G佐剂对小鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用,有75%(6/8)的小鼠不成瘤,为后续的疫苗产业化奠定基础。

关键词：人乳头瘤病毒16型优化表达发酵纯化宫颈癌疫苗

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RNA病毒反向遗传技术及其应用

国际流行病学传染病学杂志 2018年第3期45卷 208-211页

作者：周冬高孟浙江省医学科学院病毒病研究所杭州325035

RNA病毒的反向遗传技术是RNA病毒在分子水平上的操作，用于研究病毒的遗传规律和生物学特性。它已广泛应用于生命科学研究的各个领域。文章从RNA病毒反向遗传技术的关键环节，即完整cDNA克隆技术，感染性转录体制备技术出发，进一步探... 详细信息

RNA病毒的反向遗传技术是RNA病毒在分子水平上的操作，用于研究病毒的遗传规律和生物学特性。它已广泛应用于生命科学研究的各个领域。文章从RNA病毒反向遗传技术的关键环节，即完整cDNA克隆技术，感染性转录体制备技术出发，进一步探究影响RNA病毒感染性的因素，在此基础上介绍反向遗传学技术在病毒研究各个领域的应用，最后对反向遗传技术的前景作出展望。

关键词： RNA病毒反向遗传学完整cDNA克隆技术