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猪δ冠状病毒感染猪树突状细胞及对免疫因子分泌能力的影响

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中国兽医学报 2024年第2期44卷 223-230页

作者：胡亚婷舒祥力赵福杰郝晨琳曾权郑兰兰胡慧张红垒河南农业大学动物医学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

以猪树突状细胞(porcine dendritic cells,pDCs)为模型,探究猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是否能够对pDCs进行有效感染及对抗病毒细胞因子分泌的影响。采集猪外周抗凝血,分离获得猪外周血单核细胞,经白细胞介素-4(inter... 详细信息

以猪树突状细胞(porcine dendritic cells,pDCs)为模型,探究猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是否能够对pDCs进行有效感染及对抗病毒细胞因子分泌的影响。采集猪外周抗凝血,分离获得猪外周血单核细胞,经白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)诱导培养获得未成熟树突状细胞,利用倒置显微镜和透射电镜观察其生物学形态,通过蛋白质免疫印迹和激光共聚焦试验检测病毒是否可以对pDCs进行感染,qRT-PCR检测抗病毒因子IFN-α和ISG56的表达。结果显示,成功分离培养得到具有典型树突状细胞形态的pDCs,将PDCoV接种至分离培养得到的pDCs中,PDCoV可以有效感染,可以在pDCs中进行复制并产生感染性的子代病毒颗粒,病毒滴度达到4.4 lgTCID50/0.1 mL。同时检测PDCoV感染pDCs时对抗病毒因子表达的影响,结果表明,在病毒感染pDCs后48 h产生了高水平的IFN-α和ISG56。本研究成功诱导培养得到pDCs,首次证实PDCoV可以在体外感染pDCs,并在细胞中进行有效地复制,pDCs在病毒感染后促进IFN-α、ISG56的分泌来发挥抗病毒免疫效应,为后续研究PDCoV的致病机制提供了新的思路。

关键词：猪δ冠状病毒猪树突状细胞病毒感染抗病毒因子

猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2023年第1期43卷 16-22页

作者：闫晓光袁晋胡文阳胡慧河南农业大学、动物医学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通... 详细信息

已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通用荧光定量PCR检测方法。依据NCBI公布的这6种猪冠状病毒序列,利用MEGA软件进行全基因序列比对,通过分析在ORF1b中找到1段长为196 bp的保守序列,设计兼并引物,建立了用于检测猪冠状病毒的通用荧光定量PCR检测方法;结果显示,该检测方法能扩增出6种猪冠状病毒,对PDCoV、PRCV、PHEV、SADS-CoV、TGEV的灵敏性均可达到101拷贝/μL,对PEDV的灵敏性可达到100拷贝/μL;与CSFV、PRRSV、PPV、PCV、PRV无交叉反应,特异性良好;组内和组间变异系数均小于2.2%,重复性良好。利用建立的检测方法对62份病料进行检测,检测出27份样品呈现猪冠状病毒阳性,而利用普通RT-PCR方法共检测出24份阳性样品。选择2份猪冠状病毒阳性样品进行克隆测序,在NCBI上进行比对,通过同源性分析,分别鉴定为PDCoV和PEDV感染。本试验建立的猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法特异性、重复性好,敏感性高,能用于对猪冠状病毒的检测和流行病学调查,同时还可监测猪新型冠状病毒的出现。

关键词：猪冠状病毒 ORF1b基因通用荧光定量PCR

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医学报 2023年第4期43卷 654-659,667页

作者：闫晓光丁庆文任豪杰张宇航李泽辉胡慧河南农业大学动物医学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因的序列,分别设计相应的引物,构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品,通过优化反应条件和反应程序,建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法具有较高的灵敏性,对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10^(2),1.44×10^(2),1.51×10^(2)和1.56×10^(2)拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪瘟病毒(swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus-2)PCV-2、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV),结果均呈阴性,具有良好的特异性。重复性试验结果显示,在同等条件下扩增4种病毒的阳性质粒,3次均出现同样的目的条带。应用建立的方法检测了采集的48份腹泻猪的小肠组织和粪便样品,结果检测出2份PSV、7份PDCoV和11份PEDV,与单重RT-PCR检测结果的总符合率为91.66%。同时发现2份PSV和PDCoV混合感染,3份PEDV和PDCoV混合感染,2种检测方法对混合感染检测结果相一致。对2份阳性样品的PCR产物进行测序,结果与检测结果相符合。本试验建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,为临床检测PSV、PDCoV、TGEV、PEDV和流行病学调查提供了便捷有效的方法。

关键词：猪主要腹泻病毒多重RT-PCR 猪传染性胃肠炎病毒猪萨佩罗病毒猪与冠状病毒猪流行性腹泻病毒

金黄色葡萄球菌ST398-t571型在陕西生猪屠宰场的流行传播及其耐药性分析

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食品安全质量检测学报 2022年第9期13卷 3004-3010页

作者：郝勇航刘俊峰刘璐函王鑫盛吴秋玲贺恒旭黄轶浩时明真刘君君陈丽颖河南农业大学动物医学院郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室郑州450002

目的调查陕西省某生猪屠宰场ST398-t571型金黄色葡萄球菌的流行情况及耐药性。方法本研究对陕西省某生猪屠宰链及屠宰场内部环境共采集485份样品。使用常规检测方法和分子生物学技术对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,然后对分离株进行分... 详细信息

目的调查陕西省某生猪屠宰场ST398-t571型金黄色葡萄球菌的流行情况及耐药性。方法本研究对陕西省某生猪屠宰链及屠宰场内部环境共采集485份样品。使用常规检测方法和分子生物学技术对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,然后对分离株进行分子分型鉴定和对15种抗菌药物进行耐药性试验;并对其进行26种毒力基因和13种耐药基因的检测。结果样品中共分离出62株金黄色葡萄球菌,总分离率为12.8%;其中ST398-t571型分离株为优势克隆型,占90.3%(56/62)。耐药试验结果显示,所有受试菌株均对苯唑西林、阿米卡星、万古霉素和头孢噻肟敏感,对其余的抗菌药物表现出不同程度的耐药性。26种毒力基因中11种毒力基因(seb、seg、sei、sek、sen、seq、lukD、lukE、lukF-PV、lukS-PV、sasG)被检出。13种被检耐药基因除万古霉素耐药基因vanA基因外均有检出。结论屠宰场生猪屠宰链普遍存在以ST398-t571型为主的金黄色葡萄球菌污染,不同批次分离株基因携带情况存在一定差异且菌株存在较为严重的耐药性。

关键词：金黄色葡萄球菌屠宰链分子分型毒力基因耐药性

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第6期52卷 761-766页

作者：胡文阳李朝阳闫晓光刘林涛韩园园魏战勇朱河水河南农业大学动物医学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

为了实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速检测,本研究建立了检测ASFV K196R基因的q PCR方法。按照K196R基因保守序列,设计1对特异性引物,建立并优化qPCR反应体系和反应条件,构建标准曲线,测定该检测方法的特异性、... 详细信息

为了实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速检测,本研究建立了检测ASFV K196R基因的q PCR方法。按照K196R基因保守序列,设计1对特异性引物,建立并优化qPCR反应体系和反应条件,构建标准曲线,测定该检测方法的特异性、灵敏性和可重复性。结果显示,本研究建立的检测方法不与其他病毒的核酸样品产生交叉反应,检测灵敏度达10 copies/μL。变异系数小于2.5%,构建的标准曲线线性关系良好。上述结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够为ASF疫情防控提供技术支撑。

关键词：非洲猪瘟病毒 K196R基因实时荧光定量PCR

板芪发酵液对断奶羔羊肠道菌群及生长性能的影响

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西南农业学报 2022年第11期35卷 2673-2680页

作者：姚春晓樊俊洋李倩楠郝潇雅杨明凡常娟宁长申张红英河南农业大学动物医学院郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室郑州450002 河南省郑州市中兽药创制与评价重点实验室郑州450002

【目的】探究板芪(板蓝根、黄芪)发酵液对断奶羔羊肠道菌群及生长性能的影响。【方法】选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、DY芽孢杆菌、混合菌株[v(枯草芽孢杆菌)∶v(地衣芽孢杆菌)=1∶1]发酵板芪提取液饲喂羔羊,未发酵组... 详细信息

【目的】探究板芪(板蓝根、黄芪)发酵液对断奶羔羊肠道菌群及生长性能的影响。【方法】选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、DY芽孢杆菌、混合菌株[v(枯草芽孢杆菌)∶v(地衣芽孢杆菌)=1∶1]发酵板芪提取液饲喂羔羊,未发酵组饲喂板芪提取液,对照组饲喂基础日粮,试验期28 d,统计生长指标并制备肠道组织切片,对表现良好的处理组进行高通量测序分析发酵中药对肠道菌群的影响,初步探究发酵中药的作用机制。【结果】发酵Ⅰ组(枯草芽孢杆菌发酵板芪提取液)显著提高羔羊的平均日增重(P3)分析显示,发酵Ⅰ组显著提高放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌门(Tenericutes)、小杆菌属(Mogibacterium)、L7A-E11菌属的相对丰度(P<0.05);未发酵组显著提高迷踪菌门(Elusimicrobia)相对丰度(P<0.05);不动杆菌属(Acinetobacter)则在对照组中显著富集(P<0.05)。【结论】枯草芽孢杆菌发酵板芪提取液可以提高断奶羔羊小肠绒毛长度与菌群多样性进而提高羔羊的平均日增重,为发酵中药在断奶羔羊上的应用提供理论支持。

关键词：板芪芽孢杆菌生长性能肠道菌群

基于猪丁型冠状病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

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畜牧与兽医 2022年第1期54卷 84-88页

作者：张艺璇任豪杰闫瑞杰曾权李倩倩魏战勇河南农业大学动物医学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)是近年新发现的一种猪肠道病原体,主要感染仔猪并引起仔猪腹泻甚至死亡,针对该病建立快速、准确的血清学检测方法尤为重要。本研究以PDCoV HNZK-04毒株为模板扩增M基因并将其克隆至原... 详细信息

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)是近年新发现的一种猪肠道病原体,主要感染仔猪并引起仔猪腹泻甚至死亡,针对该病建立快速、准确的血清学检测方法尤为重要。本研究以PDCoV HNZK-04毒株为模板扩增M基因并将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-32a-PDCoV-M。将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,并用IPTG诱导M蛋白表达,SDS-PAGE显示目的蛋白的分子量约为41 kDa;Western blot结果显示该蛋白可以与PDCoV阳性血清特异性结合。以纯化后的M蛋白作为靶抗原,建立了一种间接ELISA检测方法。用该方法对其他猪常见病毒,包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的阳性血清进行检测,结果均为阴性;批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10%,表明建立的PDCoV间接ELISA检测方法具有良好的特异性和重复性,可以用于PDCoV感染的临床检测和诊断。

关键词：猪丁型冠状病毒 M蛋白间接ELISA

板蓝根多糖通过TLR4-NF-κB通路影响PRRSV感染后细胞因子的分泌

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中国兽医学报 2024年第2期44卷 327-334页

作者：李倩楠吴文义张云天杨明凡金钺张红英河南农业大学动物医学院河南郑州450046 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450046 郑州市中兽药研究与评价重点实验室河南郑州450046

为探究板蓝根多糖(Radix isatidis polysaccharide,IRPS)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染后细胞因子分泌的影响。本试验用永生化的猪肺泡巨噬细胞(3D4/21/CD163)作为靶细胞,分别采取ELISA和Western blot等试验方法对其炎性细胞因子以及诱导炎性细胞因子分泌的TLR4和NF-κB等蛋白表达水平进行测定,并通过TAK-242(TLR4特异性抑制剂)对TLR4通路进行抑制/封闭,ELISA检测TLR4-NF-κB信号通路被阻断后的IRPS对PRRSV感染3D4/21/CD163细胞分泌细胞因子的影响。结果显示IRPS能够降低PRRSV感染3D4/21/CD163细胞后IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性细胞因子的分泌,并且能够降低PRRSV感染3D4/21/CD163细胞后TLR4和NF-κB的蛋白表达水平;当TLR4-NF-κB信号通路被阻断时,炎性细胞因子的表达相对于单独的IRPS组有不同程度的升高。说明IRPS能够通过TLR4-NF-κB信号通路影响炎性细胞因子的分泌,减少炎性细胞因子对细胞的损伤。

关键词：板蓝根多糖 PRRSV 细胞因子 TLR4

现代化、规模化养殖场兽医体系建设的几点设想

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河南农业大学学报 2022年第5期56卷 886-890页

作者：魏战勇河南农业大学动物医学院河南郑州450046 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450046

中国养殖场规模化程度的不断提高和动物疾病的频发,对现代化、规模化养殖场管理水平及兽医服务和兽医管理体系建设提出更高的要求。本文对规模化养殖场兽医分工进行了较为明确的界定,将养殖场兽医分为理论兽医、实践兽医和生产兽医,并... 详细信息

中国养殖场规模化程度的不断提高和动物疾病的频发,对现代化、规模化养殖场管理水平及兽医服务和兽医管理体系建设提出更高的要求。本文对规模化养殖场兽医分工进行了较为明确的界定,将养殖场兽医分为理论兽医、实践兽医和生产兽医,并就现代化、规模化养殖场兽医体系建设的必要性、建设内容和建设要求与过程等提出若干建议,以期为养殖场兽医体系的建设提供参考依据。

关键词：兽医体系现代化养殖场规模化养殖场理论兽医实践兽医生产兽医