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肝细胞癌中差异表达N-连接糖蛋白的分析鉴定

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解剖学报 2014年第4期45卷 493-499页

作者：马瑾齐义军刘瑞敏王明张天朱晗马远方河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室河南开封475004

目的分析鉴定与肝细胞癌(HCC)发生发展相关的差异表达的N-连接糖蛋白。方法应用刀豆蛋白凝集素(ConA)、晶状体凝集素(LCH)和雪花凝集素(GNA)组成的亲合层析柱富集10对HCC和癌旁非癌组织中N-连接糖蛋白、二维电泳(2DE)比较分析差异表达... 详细信息

目的分析鉴定与肝细胞癌(HCC)发生发展相关的差异表达的N-连接糖蛋白。方法应用刀豆蛋白凝集素(ConA)、晶状体凝集素(LCH)和雪花凝集素(GNA)组成的亲合层析柱富集10对HCC和癌旁非癌组织中N-连接糖蛋白、二维电泳(2DE)比较分析差异表达的蛋白质点、串联质谱鉴定差异表达蛋白,Western blotting验证人羧酸酯酶1(hCE1)、触珠蛋白(HP)及组织蛋白酶D(CD)的差异表达;体外侵袭实验检测CD表达沉默后对HCC的侵袭力影响。结果质谱、生物信息学等技术鉴定了28个与HCC相关的差异表达蛋白(HCC中高表达和低表达的蛋白均为14个),Western blotting验证hCE1、HP在HCC中明显低表达,组织蛋白酶D前体(pCD)在HCC中高表达;而ConA亲和层析柱富集的ConA-CD在HCC中显著高表达。CD-siRNA介导的CD表达沉默能够显著降低肝癌细胞系SNU449、SNU473的体外侵袭能力。结论 HP、hCE1蛋白表达变化和CD N-糖链变异可能参与了HCC发生发展过程。

关键词：原发性肝癌糖蛋白组织蛋白酶D 触珠蛋白人羧酸酯酶1 二维电泳质谱人

TIPE2在类风湿关节炎发病中的表达及其意义

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中华微生物学和免疫学杂志 2013年第3期33卷 212-215页

作者：刘瑞敏孙颖川张爱红朱诗白白慧玲马远方河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室开封475004

目的探讨TIPE2（tumor necrosis factor—α induced protein 8 like 2）在牛Ⅱ型胶原诱导的CIA模型小鼠脾脏及类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的外周血淋巴细胞中的表达及其意义。方法使用牛Ⅱ型胶原免疫DBA-1／j小鼠，... 详细信息

目的探讨TIPE2（tumor necrosis factor—α induced protein 8 like 2）在牛Ⅱ型胶原诱导的CIA模型小鼠脾脏及类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的外周血淋巴细胞中的表达及其意义。方法使用牛Ⅱ型胶原免疫DBA-1／j小鼠，建立CIA小鼠模型；半定量RT-PCR法检测CIA小鼠脾脏中TIPE2基因的表达变化，荧光定量RT-PCR检测患者和健康对照者新鲜分离的淋巴细胞中TIPE2基因的表达差异；Westernblot检测CIA小鼠脾脏及患者淋巴细胞中TIPE2蛋白表达差异。并研究TIPE2与类风湿关节炎患者病情活动程度的关系。结果CIA小鼠的脾脏细胞中和患者外周血淋巴细胞中TIPE2在mRNA和蛋白水平表达增强，此外类风湿患者在活动期TIPE2表达更高，差异有统计学意义。类风湿关节炎患者的TIPE2表达水平和DAS28评分成明显正相关（P〈0．001）。结论TIPE2参与了类风湿关节炎的发病过程，TIPE2可能是评价类风湿关节炎患者病情严重程度的标志物。

关键词：类风湿关节炎 TIPE2 自身免疫性疾病 CIA小鼠模型

沉默TNFAIP8抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7的迁移功能

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中华微生物学和免疫学杂志 2016年第4期36卷 288-293页

作者：杨菲吴素霞冯世明刘广超柴立辉河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室、抗体药物河南省工程实验室开封475004

目的：构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（tumor necrosis factor alpha-induced protein 8, TNFAIP8）shRNA慢病毒表达载体,通过沉默TNFAIP8基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达,探讨TNFAIP8基因沉默对巨噬细胞功能的影响。方法设计合成TNF... 详细信息

目的：构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（tumor necrosis factor alpha-induced protein 8, TNFAIP8）shRNA慢病毒表达载体,通过沉默TNFAIP8基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达,探讨TNFAIP8基因沉默对巨噬细胞功能的影响。方法设计合成TNFAIP8的特异性shRNA序列,退火后连入pLKO.1-TRC载体构建TNFAIP8 shRNA慢病毒表达载体,双酶切和基因测序鉴定构建载体序列的正确性；转染293T细胞制备慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞,沉默TNFAIP8基因在该细胞中表达,荧光定量RT-PCR和Western blot检测TNFAIP8的基因及蛋白表达水平验证基因沉默效果。培养基因沉默的RAW264.7细胞和对照组细胞,平皿黏附试验及划痕愈合试验观察TNFAIP8沉默对 RAW264.7细胞黏附及迁移能力的影响。结果双酶切电泳结果表明,构建的shRNA慢病毒载体酶切片段相对分子质量大小正确,基因测序结果也表明插入序列正确。荧光定量RT-PCR和Western blot结果表明,基因沉默组细胞中TNFAIP8的基因及蛋白表达水平较对照组细胞均显著降低（P〈0.05）。平皿黏附试验结果发现,在接种15 min、30 min和2 h后,沉默组细胞黏附到培养皿底面上的细胞数量显著少于对照组细胞（P〈0.05）。培养12 h后,和对照组细胞相比,沉默TNFAIP8的RAW264.7细胞伪足数量较少,且突起不明显。划痕愈合试验结果表明,划痕24 h后,对照组细胞划痕面积明显缩小,划痕愈合率达到50%左右,而沉默组细胞划痕愈合率只有25%左右,显著低于对照组细胞（P〈0.05）。结论成功构建了 TNFAIP8 shRNA 慢病毒表达载体,该载体对TNFAIP8基因的表达具有良好的沉默效果；沉默TNFAIP8在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达可以显著抑制巨噬细胞的黏附和迁移能力。

关键词： shRNA: TNFAIP8 巨噬细胞迁移

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卡介苗在关节炎模型小鼠诱导中的作用

中国免疫学杂志 2014年第10期30卷 1330-1333页

作者：刘瑞敏林波朱诗白白慧玲马远方河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室开封475004

目的:探讨在牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型(Collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的诱导过程中,弗氏完全佐剂(FCA)中的卡介苗(BCG)浓度和CIA小鼠关节炎严重程度的关系。方法:将牛Ⅱ型胶原蛋白溶液与含不同BCG的FCA等体积混合乳化,在小鼠... 详细信息

目的:探讨在牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型(Collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的诱导过程中,弗氏完全佐剂(FCA)中的卡介苗(BCG)浓度和CIA小鼠关节炎严重程度的关系。方法:将牛Ⅱ型胶原蛋白溶液与含不同BCG的FCA等体积混合乳化,在小鼠尾根部注射进行免疫。免疫后观察小鼠的相关指标包括体重、发病率、血清TNF-α、关节炎指数及小鼠关节和脾脏的病理变化。结果:与1 mg/ml卡介苗组相比,4 mg/ml卡介苗组诱导的CIA小鼠发病早,关节炎指数、关节和脾脏病理评分升高及小鼠体重下降更明显,血清TGF-α明显升高,差异有统计学意义。结论:在进行CIA小鼠诱导时,BCG浓度和CIA小鼠关节炎严重程度呈正相关,实验中可以根据对动物的要求,选择含不同BCG的佐剂来诱导CIA小鼠。

关键词：关节炎模型小鼠卡介苗弗氏完全佐剂 CIA相关指标

Hsf1对人肝癌细胞株PLC/PRF5的生长调控作用

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中国免疫学杂志 2014年第12期30卷 1601-1605页

作者：蒋杞英张智王明丽马远方河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室开封475004

目的:探讨热休克转录因子1(Heat shock transcription factor 1,Hsf1)对人肝癌细胞株PLC/PRF5生长的调控作用。方法:通过shRNA基因沉默技术,构建Hsf1基因沉默的PLC/PRF5肝癌细胞株。采用Western blot检测PLC/PRF5肝癌细胞Hsf1、p53和Rb蛋白的表达。通过四甲基偶氮唑盐(Methylthiazolyl tetrazolium assay,MTT)法、平板克隆实验和细胞周期的检测,观察PLC/PRF5细胞株的增殖情况。结果:shRNA-Hsf1能有效地沉默Hsf1在PLC/PRF5细胞中的表达;shRNAHsf1能有效阻滞细胞周期于G1期,抑制PLC/PRF5细胞的生长速度和细胞克隆形成率;Hsf1基因沉默可上调PLC/PRF5细胞p53和Rb蛋白的表达。结论:Hsf1基因沉默可通过上调p53和Rb蛋白的表达抑制肝癌细胞株PLC/PRF5的增殖。

关键词：热休克转录因子1 肝癌细胞 p53 Rb

PCNP在类风湿关节炎发病中的表达及其意义

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中国免疫学杂志 2013年第5期29卷 499-502页

作者：刘瑞敏王明丽孙颖川张爱红朱诗白白慧玲马远方河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室开封475004

目的:探讨PCNP在牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性小鼠关节炎模型(CIA)脾脏及类风湿关节炎(RA)患者外周血淋巴细胞中的表达及其意义。方法:使用牛Ⅱ型胶原免疫DBA-1/j小鼠,建立CIA小鼠模型;将RA患者分为静止组和活动期组,取外周血提取淋巴细胞... 详细信息

目的:探讨PCNP在牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性小鼠关节炎模型(CIA)脾脏及类风湿关节炎(RA)患者外周血淋巴细胞中的表达及其意义。方法:使用牛Ⅱ型胶原免疫DBA-1/j小鼠,建立CIA小鼠模型;将RA患者分为静止组和活动期组,取外周血提取淋巴细胞。分别用半定量RT-PCR及荧光定量RT-PCR检测CIA小鼠脾脏和患者外周血淋巴细胞中PC-NP基因的表达差异;Western blot检测CIA小鼠脾脏及患者淋巴细胞中PCNP蛋白表达差异。结果:CIA小鼠的脾脏细胞中和患者外周血淋巴细胞中PCNP在基因和蛋白水平表达增强,RA患者在活动期PCNP表达更高,有统计学意义。结论:在基因和蛋白水平,PCNP在CIA小鼠脾脏和RA患者外周血淋巴细胞中的表达明显高于健康对照组,而且PCNP的表达水平和类风湿关节炎的严重程度密切相关。

关键词：类风湿关节炎 PCNP 表达差异

FILIP-1L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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中国免疫学杂志 2016年第6期32卷 832-837页

作者：都景芳顿国庆张舒曼褚留杰李淑莲胡延忠马远方抗体药物河南省工程实验室河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室开封475004

目的:表达、纯化GST-FILIP-1L融合蛋白,制备FILIP-1L多克隆抗体。方法:pGEX-4T3-FILIP-1L重组质粒转化E.coliBL21大肠杆菌,IPTG诱导GST-FILIP-1L融合蛋白表达,Glutathion Sepharse 4B纯化GST-FILIP-1L融合蛋白。将纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,用ELISA方法检测多克隆抗体效价,Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白、细胞转染FILIP-1L蛋白及细胞FILIP-1L蛋白的结合能力。结果:在大肠杆菌中诱导出高表达的FILIP-1L融合蛋白,经Glutathion Sepharse 4B纯化后免疫新西兰大耳白兔,获得了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,亲和层析获得纯度较高的多克隆抗体,WB检测显示多克隆抗体能够与FILIP-1L蛋白、293细胞转染FILIP-1L蛋白及肝癌细胞FILIP-1L蛋白结合。结论:成功表达、纯化了GST-FILIP-1L融合蛋白,制备了高效价的抗FILIP-1L多克隆抗体,为研究FILIP-1L蛋白生物学功能提供了有用的实验工具。

关键词： FILIP-1L 融合蛋白多克隆抗体

TIPE2-shRNA慢病毒载体的构建、病毒包装及功能检测

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中华微生物学和免疫学杂志 2013年第7期33卷 550-551页

作者：陈九格王耀辉张晶马远方河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室开封475004

TIPE2（TNFAIP8L-2，tumor necrosi sfactor-a induced protein-8-like2）2008年作为新型免疫调节因子被首次鉴定出来，它由184个氨基酸构成，具有与死亡受体结构域（DED）相似的结构域和6个保守的仅螺旋结构，隶属于TNFAIP8家族。TIPE... 详细信息

TIPE2（TNFAIP8L-2，tumor necrosi sfactor-a induced protein-8-like2）2008年作为新型免疫调节因子被首次鉴定出来，它由184个氨基酸构成，具有与死亡受体结构域（DED）相似的结构域和6个保守的仅螺旋结构，隶属于TNFAIP8家族。TIPE2是一种胞质蛋白，高表达于髓系和淋巴系的免疫细胞。

关键词：慢病毒载体功能检测病毒包装免疫调节因子螺旋结构死亡受体胞质蛋白免疫细胞

破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2对小鼠内毒素血症的保护作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第9期34卷 657-661页

作者：吴素霞柴立辉杨菲李伟华谷敬丽马远方抗体药物河南省工程实验室、河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室开封475004

目的：研究重组破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2胞外段蛋白（OCILRP2-Fc）阻断OCILRP2受体信号对LPS诱导的内毒素血症的影响，探讨OCILRP2受体在机体炎症反应中的作用。方法荧光定量RT-PCR检测LPS刺激前后OCILRP2在RAW264．7细胞的表达；... 详细信息

目的：研究重组破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2胞外段蛋白（OCILRP2-Fc）阻断OCILRP2受体信号对LPS诱导的内毒素血症的影响，探讨OCILRP2受体在机体炎症反应中的作用。方法荧光定量RT-PCR检测LPS刺激前后OCILRP2在RAW264．7细胞的表达；小鼠腹腔注射20mg/kg体重的LPS诱导内毒素血症的发生，分析OCILRP2-Fc对内毒素血症小鼠存活率的影响；称量小鼠脾脏重量分析脾脏充血肿大情况；HE染色观察肺脏、肝脏组织病理损伤情况；ELISA检测小鼠血清中炎症性细胞因子的水平；Westernblot检测LPS刺激前后巨噬细胞中NF-κB的活化。结果荧光定量RT-PCR结果表明LPS刺激显著提高了OCILRP2在小鼠巨噬细胞的表达（P＜0．05）；与对照组相比，OCILRP2-Fc可以显著提高内毒素血症小鼠的存活率；减轻小鼠脾脏肿大程度和内毒素血症对肺脏和肝脏组织造成的病理损伤；降低血清中细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ的浓度（P＜0．05）。Westernblot结果表明OCILRP2-Fc抑制LPS诱导的RAW264．7细胞内IκB的降解和NF-κBp65的磷酸化。结论采用OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号，减轻了小鼠内毒素血症对机体造成的炎症性损伤，提示OCILRP2在LPS诱导的炎症反应发生过程中具有促进作用。

关键词：脂多糖内毒素血症破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2 核因子-κB