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基于明尼苏达沙门氏菌Re595脂多糖低毒改造的外膜囊泡佐剂活性研究

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微生物学报 2024年

作者：张嘉雯尹文竹王海燕张金秋邓碧华卢宇周明旭马芳兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心南京农业大学动物医学院江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地国家兽用生物制品工程技术研究中心

【目的】外膜囊泡(outer membrane vesicles， OMVs)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌生成和分泌的球形双层膜结构，含有丰富的细菌表面抗原，因此在疫苗相关领域具有重要的研究价值。脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)作为OMVs的主... 详细信息

【目的】外膜囊泡(outer membrane vesicles， OMVs)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌生成和分泌的球形双层膜结构，含有丰富的细菌表面抗原，因此在疫苗相关领域具有重要的研究价值。脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)作为OMVs的主要结构，在诱导免疫活性的同时，也成为影响OMVs安全性的主要因素。因此，通过基因工程改造细菌LPS以生产安全高效的OMVs，是促进其生产应用的有效途径之一。【方法】以O抗原和大部分核心抗原缺失的明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota) Re595为研究对象，通过缺失酰基链编码基因msbB和导入弗朗西斯菌磷酸酶基因lpxE，减少类脂A上的酰基链和磷酸基团，从而获得低毒LPS；提取亲本株与改造株LPS与OMVs，比较其刺激免疫细胞的炎性反应，以OMVs作为免疫增强剂制备口蹄疫灭活疫苗，评价免疫活性。【结果】Re595经LPS低毒改造成功降低该菌OMVs的内毒素活性和炎性反应，进一步评价亲本株Re595与低毒改造株的OMVs免疫活性发现，LPS低毒改造虽降低了OMVs的炎性反应但其免疫增强活性显著提高。【结论】本研究说明LPS低毒改造后可降低细菌OMVs毒性，并提高其免疫增强活性，该结果将为OMVs作为免疫佐剂的应用提供理论依据。

关键词：外膜囊泡免疫佐剂脂多糖内毒素活性基因编辑

新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 660-669页

作者：毕振威王文杰刘雅坤彭大新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室扬州225009 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及... 详细信息

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

关键词： A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32A(caANP32A) RNA聚合酶活性哺乳动物适应性

基于双特异纳米抗体FMDV血凝检测方法的建立

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江苏农业学报 2024年第3期40卷 514-521页

作者：杨利张浩明乔绪稳陈瑾郑其升程海卫江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMD... 详细信息

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原检测的血凝方法,该方法检测灵敏度为1μg/ml,与其他病毒无交叉反应,且批内和批间重复性好。分别采用血凝法和夹心ELISA方法对3批次FMDV抗原进行了检测,二者检测结果基本吻合。本研究建立了基于双特异纳米抗体Nb205-48的血凝检测方法,该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,且简便、快捷、成本低,其检测结果与传统的FMDV定量检测方法的检测结果相关性好,为检测口蹄疫疫苗生产过程中FMDV抗原的含量提供了新方法。

关键词：口蹄疫病毒双特异性纳米抗体血凝检测法

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包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的制备及佐剂活性

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江苏农业学报 2024年第1期40卷 141-148页

作者：秦竹陈瑾侯立婷乔绪稳李兰杨利杜露平于晓明张元鹏郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品国泰技术创新中心江苏泰州225300

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得... 详细信息

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得到稳定保护。包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的粒径为50~150 nm,Zeta电位约-50 mV,质量浓度1.0 mg/ml的CTA1-DD蛋白投入制备的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒载药率25.33%,包封率86.56%。体外模拟释放试验结果显示CTA1-DD蛋白可在7 d内缓慢释放。将CTA1-DD蛋白与PRV灭活抗原混合后,接种至小鼠鼻腔,结果表明,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒能够同时诱导更高的血清IgG抗体和黏膜IgA抗体表达,证明了其作为黏膜佐剂的高效性。

关键词： CTA1-DD蛋白 O-羧甲基壳聚糖硫酸葡聚糖纳米颗粒佐剂活性

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 300-310页

作者：白昀谢青云欧阳伟甘源袁厅赵东明步志高邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 详细信息

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体

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江苏农业学报 2024年第4期40卷 682-689页

作者：刘蓓蓓韦艳娜陈蓉谢星倪博郝飞张珍珍白昀袁厅冯志新江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规... 详细信息

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。

关键词：非洲猪瘟病毒 pA104蛋白单克隆抗体半固体培养法

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绵羊肺炎支原体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2024年

作者：王晓楠张纹纹陈思宇单依依陈益李文良程子龙杨蕾蕾王金泉刘茂军新疆农业大学动物医学学院江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心

为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)的抗原快速定量检测方法，本研究通过单抗筛选和条件优化，建立了一种检测MO抗原夹心ELISA检测方法，建立的ELISA方法的最优条件为：单抗1A11 浓度为105 μg/mL，37 ℃孵育1 h后4 ... 详细信息

为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)的抗原快速定量检测方法，本研究通过单抗筛选和条件优化，建立了一种检测MO抗原夹心ELISA检测方法，建立的ELISA方法的最优条件为：单抗1A11 浓度为105 μg/mL，37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜包被；用10 g/L BSA 37 ℃封闭1 h；与超声处理的样品作用1.5 h；检测抗体浓度为3.81 μg/mL，37 ℃作用2 h；酶标抗体1∶4 000稀释，37 ℃反应1.5 h；加入底物37 ℃避光反应10 min。建立的夹心ELISA方法批间和批内变异系数均低于10%，特异性、重复性、敏感性良好，本方法检测的抗原含量与MO的CCU呈正相关。本方法的建立为绵羊肺炎支原体的定量检测提供了新技术，可用于实验室MO培养物CCU含量的替代检测和MO疫苗生产过程中抗原的检测。

关键词：绵羊肺炎支原体夹心ELISA 建立

滑液支原体烯醇化酶在感染宿主中的反应原性和细胞黏附性

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 88-96页

作者：徐彬孙玉王树于岩飞王晓丽马孙婷孙华伟张敬峰刘传敏吕立新冯志新熊祺琰邵国青张小飞欧阳伟江苏省农业科学院兽医研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013 江苏大学医学院江苏镇江212013 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白... 详细信息

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白结合位点和B细胞表位。MS Eno在不同MS菌株间同源性较高,且有别于其他物种。B细胞表位广泛分布在Eno蛋白的各个部分,且大都与预测的蛋白结合位点有重合。进行Eno原核表达和纯化,制备兔抗Eno多克隆抗血清。利用Western blot分析Eno在MS感染鸡或灭活苗免疫鸡中的反应原性。结果显示,MS Eno与兔抗Eno多克隆抗血清、兔抗MS多克隆抗血清、灭活疫苗(HN01株或YBF-MS1株)高免鸡血清、HN01强毒攻毒后阳性鸡血清、3个不同地方来源的临床阳性鸡血清均能发生反应,说明其在疫苗免疫和病原感染鸡中均表现有反应原性。利用菌落印迹和双荧光检测分析并证实Eno为外膜蛋白。利用间接免疫荧光和ELISA板结合试验分析Eno对鸡滑膜鞘细胞(synovial sheath cells,SSCs)是否具有黏附素作用。试验证实Eno对SSCs具有黏附作用,且此黏附作用具有Eno浓度依赖性。以上证明MS Eno在病原感染和灭活苗免疫鸡中具有反应原性,并作为外膜锚定的细胞黏附素参与对关键宿主细胞SSCs的黏附,为后续深入研究Eno的致病和免疫相关功能提供了重要参考。

关键词：滑液支原体烯醇化酶反应原性细胞黏附

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江苏省羊肠道病毒感染的流行病学调查

中国兽医学报 2024年第6期 1140-1147页

作者：蔡旭航李文良李基棕李思远毛立许信刚李彬西北农林科技大学动物医学院江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室

羊肠道病毒(caprine enterovirus, CEV)是新发现的感染山羊的重要腹泻病病原之一。为了解CEV在江苏省部分地区羊群中的流行情况，从江苏省8县市采集了410份羊粪便样品，包括腹泻样品212份、非腹泻样品198份。通过RT-PCR方法检出CEV阳性... 详细信息

羊肠道病毒(caprine enterovirus, CEV)是新发现的感染山羊的重要腹泻病病原之一。为了解CEV在江苏省部分地区羊群中的流行情况，从江苏省8县市采集了410份羊粪便样品，包括腹泻样品212份、非腹泻样品198份。通过RT-PCR方法检出CEV阳性127份，各地阳性率差异较大，分布在12.50%～62.50%,总阳性率则高达30.98%,分析腹泻和非腹泻样品阳性率，发现CEV是导致山羊腹泻的重要病原之一。对获得的CEV毒株VP1序列同源性和遗传进化分析表明，江苏省流行的CEV亚型包括EV-G5、G7、G21、G22和G23,其中G21～G23均为新的亚型。同源性分析表明，检测毒株的5′-UTR、VP1和2AB序列与CEV-JL14等国内参考毒株的同源性分别为71.8%～95.8%、56.9%～95.0%和77.9%～98.4%,其中HaiMen-SJH株的5′-UTR和2AB序列与其他参考序列差异较大，在遗传进化关系中形成独立分支。根据流调结果，CEV感染在江苏省各地区广泛存在，是造成山羊腹泻的重要病因之一，不同地区流行毒株及流行情况均存在差异。本研究丰富了我国CEV的流行病学资料，为针对性地防控羊新发肠道病毒感染提供了理论依据。

关键词：羊肠道病毒腹泻流行病学调查进化分析