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后基因组时代的丝状真菌基因组学与代谢工程

遗传 2011年第10期33卷 1067-1078页

作者：陈献忠沈微樊游王正祥江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心无锡214122

丝状真菌不仅是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者,而且也是代谢工程育种中异源蛋白表达的重要细胞工厂。丝状真菌的遗传修饰和代谢工程研究是现代工业生物技术领域最具活力的研究方向之一。特别是与细菌和酵母相比,丝... 详细信息

丝状真菌不仅是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者,而且也是代谢工程育种中异源蛋白表达的重要细胞工厂。丝状真菌的遗传修饰和代谢工程研究是现代工业生物技术领域最具活力的研究方向之一。特别是与细菌和酵母相比,丝状真菌在细胞生长、营养需求、环境适应性、翻译后修饰、蛋白分泌能力和生物安全性等方面具有显著的优势。文章综述了丝状真菌作为异源蛋白表达系统在基因组学技术研究和代谢工程研究方面的最新进展。作者在分析丝状真菌基因组结构、特点的基础上,阐述了比较基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学等对丝状真菌的代谢途径重构、新型蛋白挖掘和代谢工程育种中的作用和意义。另一方面,作者分析了丝状真菌在表达外源蛋白时遇到的瓶颈问题,总结了丝状真菌代谢工程育种中的常用策略包括异源基因的融合表达、反义核酸技术、蛋白分泌途径改造、密码子优化和蛋白酶缺陷宿主的选育等技术和手段。最后,对该领域的发展趋势进行了展望。

关键词：丝状真菌基因组学代谢工程异源蛋白细胞工厂

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重组枯草芽胞杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱

生物工程学报 2011年第7期27卷 1082-1091页

作者：彭艳红张梁丁重阳王正祥石贵阳江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心无锡214122

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的表达并通过细胞内的葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生,以枯草芽胞杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连接至构建好的质粒(pHY300plk-Prp... 详细信息

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的表达并通过细胞内的葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生,以枯草芽胞杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连接至构建好的质粒(pHY300plk-PrpsD-TrpsD上,得到质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD;进一步将重组质粒转化入*** Wb600中获得重组菌*** Wb600(pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD);对此重组菌进行全细胞生物转化反应实验发现,在葡萄糖存在的情况下,其可转化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮(简称MAK)生成d-伪麻黄碱,产量最高达97.5 mg/L,底物摩尔转化率为24.1%。研究结果为利用重组***生物转化生产d-伪麻黄碱进行了有益探索。

关键词：枯草芽胞杆菌羰基还原酶全细胞生物转化 d-伪麻黄碱

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代谢工程改造野生耐酸酵母生产L-乳酸

生物工程学报 2011年第7期27卷 1024-1031页

作者：张勤张梁丁重阳王正祥石贵阳江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心无锡214122

以选育低pH条件下高产L-乳酸的酵母菌为目的,从自然样品中筛选分离得到一株能在pH 2.5(乳酸调节)的培养基中生长且不利用乳酸的酵母(初步鉴定为木兰假丝酵母Candida magnolia);进一步将来源于米根霉As3.819的乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)... 详细信息

以选育低pH条件下高产L-乳酸的酵母菌为目的,从自然样品中筛选分离得到一株能在pH 2.5(乳酸调节)的培养基中生长且不利用乳酸的酵母(初步鉴定为木兰假丝酵母Candida magnolia);进一步将来源于米根霉As3.819的乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体,构建了重组质粒pYX212-kanMX-ldhA,电转化入野生型***中,筛选获得了一株具有产L-乳酸能力的重组菌株***-2;通过发酵实验表明,该重组菌产L-乳酸的最适pH为3.5,并在pH 2.5时正常发酵产乳酸。本研究成果为首次从自然界筛选到一株耐高浓乳酸的耐酸酵母菌,并以此为宿主菌构建了具有生产L-乳酸能力的耐酸重组酵母,为以耐酸酵母菌高产L-乳酸进行了有益的探索。

关键词：耐酸酵母米根霉乳酸脱氢酶代谢工程 L-乳酸

表面展示表达植酸酶的重组酿酒酵母构建及酒精发酵

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生物工程学报 2015年第12期31卷 1700-1710页

作者：肖艳陈献忠沈微杨海泉樊游工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心江苏无锡214122

以淀粉为原料的同步糖化发酵是目前乙醇生产的主要途径之一。然而原料中含有的植酸不仅影响酒精发酵效率,而且也会导致环境中难以被植物吸收的磷含量的增加,加剧环境污染。将来源于大肠杆菌的植酸酶基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列... 详细信息

以淀粉为原料的同步糖化发酵是目前乙醇生产的主要途径之一。然而原料中含有的植酸不仅影响酒精发酵效率,而且也会导致环境中难以被植物吸收的磷含量的增加,加剧环境污染。将来源于大肠杆菌的植酸酶基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接并置于α-因子分泌信号肽下游,构建植酸酶表面展示表达重组载体pMGK-AG-phy并转化工业酿酒酵母,成功获得了在细胞表面锚定表达植酸酶的重组菌PHY。重组酵母的植酸酶表达水平达到6.4 U/g(菌体湿重),其最适温度为55℃,最适pH 4.0,在pH 3.5–4.5范围内具有较高的活性。以玉米粉为原料的同步糖化发酵实验表明,重组酵母PHY的生长速度高于出发菌株,同时酒精产量相较于出发菌株提高了3.7%。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91%。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量,提高了酒糟的利用价值,减少磷排放,对燃料酒精的环境友好生产具有重要的借鉴意义。

关键词：酿酒酵母表面展示植酸酶燃料酒精 α-凝集素

Rhizopus microsporus var. chinensis生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质

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应用与环境生物学报 2010年第5期16卷 714-718页

作者：李彧娜石贵阳王武王正祥江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心和工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

从Rhizopus microsporus *** CICIM F0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶,并研究其酶学性质.经硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M阴离子层析、Bio-Rad制备电泳等步骤后获得电泳均一的糖化酶,其相对分子质量约为52×... 详细信息

从Rhizopus microsporus *** CICIM F0088菌株中分离纯化一种新的具有生淀粉降解能力的糖化酶,并研究其酶学性质.经硫酸铵沉淀、双水相交换、DEAE-650M阴离子层析、Bio-Rad制备电泳等步骤后获得电泳均一的糖化酶,其相对分子质量约为52×103.该酶最适反应pH为4.5,在pH3.5～6.5范围内稳定;最适反应温度为75℃,具有较宽的pH耐受范围和较高的温度耐受性.经飞行质谱分析得到酶蛋白中3个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的糖化酶序列具有一定的同源性.

关键词：生淀粉糖化酶 Rhizopus microsporus var.chinensis 纯化酶学性质

根癌土壤杆菌产辅酶Q_(10)的补料分批发酵工艺

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过程工程学报 2011年第1期11卷 113-116页

作者：金赛徐俭张梁丁重阳石贵阳江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心江苏无锡214122

以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens Q14)为生产菌株,在15L发酵罐内对补料分批发酵生产辅酶Q10的工艺进行优化.通过逐步添加限制性营养物质,考察其对发酵的影响,获得了较优的补料分批发酵工艺,即流加葡萄糖和KH2PO4溶液,将葡萄... 详细信息

以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens Q14)为生产菌株,在15L发酵罐内对补料分批发酵生产辅酶Q10的工艺进行优化.通过逐步添加限制性营养物质,考察其对发酵的影响,获得了较优的补料分批发酵工艺,即流加葡萄糖和KH2PO4溶液,将葡萄糖和磷浓度分别控制在5～15g/L和50～120mmol/L,同时,在30和50h各加入5%()新鲜发酵培养基.在此工艺条件下,发酵周期为84h,菌体量达87.2g/L,辅酶Q10产量高达2166.2mg/L,生产强度为25.8mg/(Lh),比分批发酵提高了7.8倍.

关键词：根癌土壤杆菌辅酶Q10 补料分批发酵

大肠杆菌琥珀酸和乙酸合成途径的删除及其重组菌株的D-乳酸发酵

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生物工程学报 2011年第1期27卷 31-40页

作者：周丽田康明左志锐陈献忠石贵阳 Suren Singh 王正祥江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 Department of Biotechnology and Food Technology Durban University of Technology

菌株CICIM B0013-030(B0013,ack-pta,pps,pflB)可积累D-乳酸作为主要发酵产物,然而副产物琥珀酸和乙酸的含量分别高达乳酸的11.9%和7.1%。为构建副产物含量低的产D-乳酸重组大肠杆菌菌株,本研究删除了菌株B0013-030的琥珀酸(frdA)和乙酸... 详细信息

菌株CICIM B0013-030(B0013,ack-pta,pps,pflB)可积累D-乳酸作为主要发酵产物,然而副产物琥珀酸和乙酸的含量分别高达乳酸的11.9%和7.1%。为构建副产物含量低的产D-乳酸重组大肠杆菌菌株,本研究删除了菌株B0013-030的琥珀酸(frdA)和乙酸(tdcDE)合成途径,并考察了重组菌株在摇瓶和发酵罐中经两阶段发酵(好氧生长菌体和厌氧发酵产酸)利用葡萄糖发酵D-乳酸的性能。结果表明,分别构建含有frdA::difGm和tdcDE::difGm突变盒的重组质粒,并利用Red重组系统将突变盒整合于染色体上的目的基因,再利用Xer重组系统去除抗生素抗性基因,依次获得了重组菌株B0013-040B(B0013-030,frdA)和B0013-050B(B0013-040B,tdcDE)。摇瓶发酵结果表明,frdA基因的删除使得菌株B0013-040B副产物琥珀酸的含量降低了80.8%;在7 L发酵罐中进行乳酸发酵,菌株B0013-040B的D-乳酸产量达114.5 g/L,光学纯度大于99.9%,但仍积累1.0 g/L琥珀酸和5.4 g/L乙酸。进一步删除了tdcD和tdcE基因的菌株B0013-050B,在7 L发酵罐中生产111.9 g/L D-乳酸,乙酸和琥珀酸的合成量分别降低为0.4 g/L,其他副产物含量也维持较低水平,表明该菌株具有较优良的D-乳酸发酵性能。

关键词： D-乳酸大肠杆菌琥珀酸乙酸

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L-乳酸的发酵生产和聚L-乳酸的化学加工

中国生物工程杂志 2011年第2期31卷 102-115页

作者：田康明周丽陈献忠左志锐石贵阳王正祥江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心无锡214122

L-乳酸广泛应用于食品、医药、日化和工业等各个领域。近年来随着石化资源的不断紧缺,众多化学合成的高分子材料的生产受到了限制。以生物质资源为基础的L-乳酸因此被大量用于加工生产成聚L-乳酸等环境友好型生物可降解材料。正是由于L... 详细信息

L-乳酸广泛应用于食品、医药、日化和工业等各个领域。近年来随着石化资源的不断紧缺,众多化学合成的高分子材料的生产受到了限制。以生物质资源为基础的L-乳酸因此被大量用于加工生产成聚L-乳酸等环境友好型生物可降解材料。正是由于L-乳酸需求量的增大,如何高效低成本地生产L-乳酸显得尤为重要。系统综述了L-乳酸生产菌株的选育,用于L-乳酸发酵生产的廉价资源的开发利用,L-乳酸的发酵生产和L-乳酸的分离纯化等方面的研究进展。目前研究的热点和难点正是基于上述四个部分:菌种方面,以可以高效代谢利用廉价底物,且营养需求低的选育目标获得了多个优良的生产菌种,然而具备综合代谢优势的菌种还有待进一步选育;发酵底物方面,已开发利用多种廉价,来源丰富且易于菌种代谢并高效转化成乳酸的底物,但是对这些底物工业规模应用还有待进一步研究;发酵工艺方面,建立了环境友好型,劳动强度低的发酵工艺,然而实际应用中仍然存在成本高的问题;后提取方面,通过选育低营养需求的生产菌种和采用新型发酵工艺有效地简化了后提取过程,但是实际应用方面仍受发酵工艺成本高的制约。最后对聚L-乳酸的化学加工以及聚L-乳酸的生物降解进行了探讨并提出了一些建议。

关键词： L-乳酸发酵生产分离纯化聚L-乳酸化学加工

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酵母细胞甘油代谢与生理功能研究进展

中国生物工程杂志 2010年第5期30卷 140-148页

作者：陈献忠王正祥诸葛健江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心无锡214122

甘油是酵母细胞生长代谢过程中常见的多元醇物质。尽管甘油的结构简单,代谢途径并不复杂,但是其在细胞内的生理功能十分重要。甘油代谢过程主要参与细胞的高渗透压生理调节和厌氧条件下的胞内氧化还原平衡调节。近年来许多学者在酵母细... 详细信息

甘油是酵母细胞生长代谢过程中常见的多元醇物质。尽管甘油的结构简单,代谢途径并不复杂,但是其在细胞内的生理功能十分重要。甘油代谢过程主要参与细胞的高渗透压生理调节和厌氧条件下的胞内氧化还原平衡调节。近年来许多学者在酵母细胞的甘油代谢及生理功能方面开展了深入的研究。在扼要介绍甘油生理代谢的基础上,重点阐述甘油代谢参与细胞高渗压甘油应答信号途径和氧化还原平衡调节的生理机制,同时就酵母细胞甘油合成的代谢工程进行归纳和评述。

关键词：酵母细胞甘油代谢高渗压甘油途径氧化还原平衡