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慢病毒介导沉默P75神经营养蛋白受体联合NGF过表达转染BMSCs复合脱钙骨基质异位成骨的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2020年第11期34卷 1438-1445页

作者：陈俊毅王宁张衡张贤平赵利民朱伦井黎智君贝朝涌桂林医学院附属医院四肢创伤骨科广西桂林541000

目的探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传... 详细信息

目的探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传代。取第3代BMSCs,分别用慢病毒介导沉默P75NTR基因(B组)、NGF过表达基因(C组)、沉默P75NTR和NGF过表达双基因(D组)转染,以未转染细胞作为对照(A组)。转染7 d后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达;细胞计数试剂盒8法检测转染后连续8 d细胞的活性;Western blot检测各组P75NTR和NGF蛋白表达。倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默P75NTR和NGF过表达双基因转染后BMSCs与DBM的黏附情况。将上述4组转染后BMSCs分别与DBM共培养制备组织工程骨后,埋植于8周龄SD大鼠背侧皮下构建皮下异位成骨模型(n=6),术后4、8周行HE染色,术后8周ALP染色观察钙结节形成,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达。结果转染7 d A组未见荧光表达,B组呈红色荧光表达,C组呈绿色荧光表达,D组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达70%左右。Western blot检测示,A、C组P75NTR蛋白相对表达量显著高于B、D组,C、D组NGF蛋白相对表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随时间推移,各组细胞增殖活性均上升,其中D组上升最明显,3~8 d细胞活性明显高于A组(P<0.05)。倒置相差显微镜和扫描电镜观察示,BMSCs能与DBM形成良好黏附。皮下异位成骨实验中,HE染色示术后4、8周,D组比其余3组有更多的骨组织形成。ALP染色示D组ALP活性最高,有更好的成骨表达。实时荧光定量PCR检测示,与A组比较,D组Runx2、ALP、OCN mRNA相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论沉默P75NTR联合NGF过表达双基因共转染BMSCs复合DBM构建组织工程骨具有良好的异位成骨能力,通过提高NGF的水平、关闭P75NTR凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好地促进骨组织再生。

关键词： P75神经营养蛋白受体 NGF BMSCs 细胞活性脱钙骨基质异位成骨大鼠

慢病毒介导沉默P75神经生长因子受体基因对大鼠BMSCs成骨分化的影响研究

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中国修复重建外科杂志 2020年第8期34卷 1052-1058页

作者：王宁陈俊毅陈西淼朱伦井段江涛王烨贝朝涌桂林医学院附属医院四肢创伤手外科广西桂林541000 桂林医学院广西桂林541000

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)慢病毒介导沉默P75神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)基因对大鼠BMSCs成骨分化的影响。方法首先设计3条慢病毒介导P75NTR基因的siRNA序列(P75NTR-siRNA-1、2、3)以及阴性对照(negative control,NC)-siRNA,分别转染第3代SD大鼠BMSCs;倒置显微镜下观察细胞形态变化,实时荧光定量PCR及Western blot检测细胞P75NTR基因及蛋白表达情况,并筛选沉默效果最佳的P75NTR-siRNA进行后续成骨分化实验。取第3代SD大鼠BMSCs,随机分为实验组、阴性对照组及空白对照组;其中,阴性对照组及实验组分别采用NC-siRNA及筛选的P75NTR-siRNA慢病毒载体转染BMSCs,空白对照组为正常BMSCs。采用MTT法检测转染后细胞增殖情况;各组细胞经成骨诱导分化培养后,Western blot检测成骨相关蛋白[骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)及Runx相关转录因子2(Runx related transcription factor 2,Runx2)]表达,免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原表达情况,ALP检测以及茜素红染色观察成骨情况。结果慢病毒介导P75NTR基因转染BMSCs后,其P75NTR mRNA及蛋白表达量均明显降低(P<0.05),其中P75NTR-siRNA-3沉默效果最佳。P75NTR基因沉默后,MTT检测示实验组细胞增殖较两对照组明显增快(P<0.05)。成骨诱导分化培养后,实验组OCN及Runx2蛋白相对表达量、Ⅰ型胶原蛋白表达、ALP活力均明显高于两对照组,差异有统计学意义(P<0.05);且随成骨诱导时间延长,矿化结节逐渐增多。结论siRNA慢病毒沉默P75NTR基因可以促进大鼠BMSCs成骨分化,为治疗骨缺损提供了新思路。

关键词： P75神经生长因子受体小干扰RNA 慢病毒基因沉默 BMSCs 成骨分化大鼠

失神经及制动后兔肱骨骨密度与生物力学性能的对比研究

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中国骨质疏松杂志 2019年第12期25卷 1680-1684,1720页

作者：何鹏陈玉高峰张衡张贤平戴厚杰王锐英桂林医学院附属医院四肢创伤科

目的对比分析失神经和制动后兔肱骨生物力学特性及骨密度的改变。方法将54只新西兰兔随机分成正常组、失神经组和制动组,每组设置4周、8周和12周三个取材时间点。每组18只兔子,每个时间点6只兔子。正常组不做任何处理,失神经组兔子完全... 详细信息

目的对比分析失神经和制动后兔肱骨生物力学特性及骨密度的改变。方法将54只新西兰兔随机分成正常组、失神经组和制动组,每组设置4周、8周和12周三个取材时间点。每组18只兔子,每个时间点6只兔子。正常组不做任何处理,失神经组兔子完全离断右侧上肢臂丛神经,制动组采用石膏与石膏托对右上肢进行牢靠的固定。主要检测指标:在造模后4周、8周和12周时取出兔右侧肱骨进行检测,称量肱骨的湿重,三点弯曲试验测定骨力学特性,双能X线骨密度仪检测骨密度,HE染色观察骨组织细微结构。结果失神经和制动组的骨密度在造模后均低于同时间的正常组(P0.05)。失神经组与制动组相比,失神经组的最大负荷、弯曲强度在造模后各个时间点都低于制动组,但只有到第12周时差异才具有显著性(P0.05)。与正常组骨组织形态学相比,失神经组和制动组均出现骨小梁变细,小梁之间出现明显断裂,出现大量空泡状结构。结论失神经和制动均可造成严重的骨质疏松。就两者造成的骨质疏松程度上来说,失神经对骨质力学性能的影响较制动更为严重。力学载荷的降低在导致骨质疏松的过程中起到了更为重要的作用。

关键词：失神经制动骨密度力学分析骨质疏松

P75神经营养因子受体研究进展及骨折不愈合治疗新思路

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中国修复重建外科杂志 2017年第1期31卷 105-109页

作者：李家勇王铭彭称飞贝朝涌桂林医学院附属医院四肢创伤骨科广西桂林541001

目的综述P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)研究进展,明确其作用机制,探讨其与骨折不愈合的关系,为骨折不愈合的治疗提供新思路。方法广泛查阅近年国内外与P75NTR相关的文献,分析总结其作用机制及骨折不愈合形成... 详细信息

目的综述P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)研究进展,明确其作用机制,探讨其与骨折不愈合的关系,为骨折不愈合的治疗提供新思路。方法广泛查阅近年国内外与P75NTR相关的文献,分析总结其作用机制及骨折不愈合形成的病理因素。结果 P75NTR在骨折不愈合组织中表达,且能导致纤维蛋白降解缺陷、抑制血管生成,而后两者在骨折不愈合的发病中起重要作用。结论在骨折不愈合的治疗中,是否可通过阻断P75NTR的上述作用达到治疗目的,尚有待进一步研究证实。

关键词： P75神经营养因子受体骨折不愈合血管生成

天麻素干预脊髓损伤模型兔运动功能及神经生长相关蛋白43的表达

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中国组织工程研究 2021年第29期25卷 4626-4631页

作者：张衡张贤平戴厚杰黄昌钊王锐英桂林医学院附属医院四肢创伤外科广西壮族自治区桂林市541001

背景:研究报道,天麻素在脊髓损伤中具有抗炎、抗氧化及神经保护作用。目的:研究天麻素对动物脊髓损伤中运动功能的恢复及神经生长相关蛋白43表达的影响。方法:将30只新西兰大白兔随机分为假手术组、对照组、实验组,每组10只。对照组、... 详细信息

背景:研究报道,天麻素在脊髓损伤中具有抗炎、抗氧化及神经保护作用。目的:研究天麻素对动物脊髓损伤中运动功能的恢复及神经生长相关蛋白43表达的影响。方法:将30只新西兰大白兔随机分为假手术组、对照组、实验组,每组10只。对照组、实验组应用改良Allen’s打击法建立脊髓损伤模型,实验组静脉注射天麻素100 mg/(kg•d),假手术组和对照组各静脉注射10 mL生理盐水,连续给药7 d。造模后1,3,5,7 d,对各组大鼠进行神经功能评分和神经电生理检测;造模7 d后取损伤部位脊髓组织,进行苏木精-伊红染色、尼氏染色、Western blot检测、免疫荧光观察。实验方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准(批准编号为GMC201805018)。结果与结论:①实验组造模后不同时间点的后肢神经功能评分明显高于对照组(P<0.05);②与假手术组比较,对照组造模后不同时间点的运动诱发电位发作潜伏期变长(P<0.05),峰间振幅降低(P<0.05);与对照组比较,实验组造模后3,5,7 d的运动诱发电位发作潜伏期缩短(P<0.05),峰间振幅升高(P<0.05);③苏木精-伊红染色显示,对照组可见脊髓空洞,结构不完整,灰质与白质界限不清,灰质中神经元坏死凋亡;实验组可见空洞坏死,脊髓组织结构完整性好,灰质结较为清晰;④尼氏染色显示,对照组无神经元,可见大量胶质细胞增生;实验组可见神经元存活,胶质细胞增生相对较少;⑤Western blot检测与免疫荧光观察显示,对照组与实验组的神经生长相关蛋白43表达高于假手术组,实验组明显高于对照组;⑥结果表明,天麻素能够促进脊髓损伤兔运动功能的恢复,并且可能通过增加神经生长相关蛋白43的表达来促进脊髓神经轴突的再生。

关键词：天麻素脊髓损伤神经损伤与修复神经生长相关蛋白43 神经功能实验动物

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双基因转染BMSCs诱导成骨的研究进展

中国修复重建外科杂志 2014年第12期28卷 1540-1543页

作者：陈宁贝朝涌蒋林彬粟谋徐威桂林医学院附属医院四肢创伤骨科桂林医学院生物技术学院

目的对双基因转染BMSCs诱导成骨的研究现状及进展作一综述。方法广泛查阅近年有关双基因转染BMSCs诱导成骨的文献,并对BMSCs的特点、双基因转染BMSCs协同诱导成骨的效果及优势、双基因转染BMSCs的应用前景及问题进行归纳总结。结果双基... 详细信息

目的对双基因转染BMSCs诱导成骨的研究现状及进展作一综述。方法广泛查阅近年有关双基因转染BMSCs诱导成骨的文献,并对BMSCs的特点、双基因转染BMSCs协同诱导成骨的效果及优势、双基因转染BMSCs的应用前景及问题进行归纳总结。结果双基因转染BMSCs诱导成骨效果远优于单基因转染,且诱导分化的成骨细胞活性也显著增强,应用于骨组织工程实验也获得良好效果。结论双基因转染BMSCs诱导成骨可弥补单基因转染的不足,在骨科领域研究中具有较大发展前景。

关键词：双基因转染 BMSCs 诱导成骨

解剖完全再血管化全动脉冠状动脉旁路移植术与保留全部瓣下结构的二尖瓣置换术治疗冠心病伴中至重度或重度缺血性二尖瓣关闭不全的多中心应用

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中华外科杂志 2025年第1期63卷 58-67页

作者：国科陈绪军郑宝石施超黄克力曹勇廖成全陈景伟林宇柳成信曹劝省申林王振东遵义医科大学附属医院心脏大血管外科遵义华中科技大学同济医学院武汉市第一医院心外科武汉广西医科大学第一附属医院心脏外科南宁蚌埠医科大学第一附属医院心外科蚌埠四川省人民医院心外科成都高州市人民医院心外科高州粤北人民医院心外科韶关茂名市人民医院心外科茂名广东省中医院心外科广州柳州市人民医院心胸外科柳州河南科技大学附属第一医院心外科洛阳重庆医科大学附属第二医院心胸外科重庆临汾市人民医院心脏外科临汾

目的探讨同期解剖完全再血管化全动脉冠状动脉旁路移植术(TACR)与保留全部瓣下结构的二尖瓣置换术(C-MVR)治疗冠心病伴中至重度或重度缺血性二尖瓣关闭不全(IMR)的效果。方法本研究为回顾性多中心病例系列研究。回顾性收集2015年7月至2... 详细信息

目的探讨同期解剖完全再血管化全动脉冠状动脉旁路移植术(TACR)与保留全部瓣下结构的二尖瓣置换术(C-MVR)治疗冠心病伴中至重度或重度缺血性二尖瓣关闭不全(IMR)的效果。方法本研究为回顾性多中心病例系列研究。回顾性收集2015年7月至2024年4月我国13家医院收治的127例同期接受TACR与C-MVR治疗的冠心病伴中至重度或重度IMR患者的资料。男性90例, 女性37例, 年龄(56.5±10.7)岁(范围:33～74岁)。收集患者的围手术期资料及随访期间左心室射血分数、左心室舒张末内径、动脉桥通畅率等参数。采用配对样本t检验或χ2检验对数据进行比较。结果 127例患者中, 67例同期行三尖瓣修复术。术中取带蒂左乳内动脉(LIMA)113支、左桡动脉127支、右桡动脉80支、右乳内动脉(RIMA)110支。远端吻合口数量为(4.2±0.4)个(范围:3～5个)。升主动脉阻断时间与体外循环时间分别为(97.5±23.4)min(范围:90～161 min)与(145.4±19.2)min(范围:101～210 min)。术中死亡1例。21例安装主动脉内球囊反搏以改善左心室射血功能。无患者发生胸骨缺血。除1例术中死亡患者外, 术后其余患者完成随访, 随访时间(64.3±7.5)个月(范围:4～110个月), 期间无重要心脑血管事件发生, 患者均存活。左心室射血分数较术前有改善(55.0%±5.3%比41.0%±15.3%, t=17.23, P<0.01), 心功能纽约心脏病协会分级≤2级者的比例较术前增加[23.6%(30/127)比87.3%(110/126), χ2=103.77, P<0.01], 心绞痛加拿大心血管学会分级≤3级者的比例较术前减少[4.8%(6/126)比78.7%(100/127), χ2=142.19, P<0.01], 左心室舒张末内径较术前减小[(5.70±4.50)cm比(6.10±0.23)cm, t=12.15, P<0.01]。术后(60.5±11.7)个月(范围:6～109个月)行冠状动脉多排CT血管成像检查, 结果显示, LIMA桥通畅率为96.4%(108/112)、左桡动脉桥通畅率为88.9%(112/126), 右桡动脉桥通畅率为93.7%(74/79), 游离RIMA桥通畅率为90.9%(100/110), 各动脉桥之间通畅率的差异无统计学意义(χ2=5.24, P=0.155)。结论 C-MVR与TACR治疗冠心病伴中至重度或重度IMR的中期结果较满意。

关键词：冠心病冠状动脉旁路移植术缺血性二尖瓣关闭不全全动脉冠状动脉旁路移植术解剖完全再血管化保留全部瓣下结构的二尖瓣置换术多中心研究

Ad-hBMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞体外骨生成的实验研究

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中国骨质疏松杂志 2015年第3期21卷 264-268页

作者：宁寅宽李强蔡伟良武成聪陈佳滨石正松桂林医学院附属医院四肢创伤手外科广西桂林541001

目的观察Ad-h BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外骨生成中钙化斑形成,并对钙化斑元素构成进行研究。方法用携带h BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞,通过RT-PCR检测转染后BMSCs h BMP-2基因的表达,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜... 详细信息

目的观察Ad-h BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外骨生成中钙化斑形成,并对钙化斑元素构成进行研究。方法用携带h BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞,通过RT-PCR检测转染后BMSCs h BMP-2基因的表达,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察转染后细胞形态改变和钙化斑的形成,结合扫描电镜和X线能谱分析(SEM/EDS)技术观测钙化斑表面微观形貌及其元素构成。结果 RT-PCR检测转染后BMSCs表达h BMP-2目的基因,细胞形态向成骨方向分化,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,电镜下见钙化灶点状散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。X射线能谱分析显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比(Ca/P)为1.53。结论 Ad-h BMP-2/GFP能成功转染兔BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨方向分化,并具备较好的骨生成能力。

关键词：重组腺病毒骨形态生发蛋白骨髓间充质干细胞扫描电镜能谱分析

绿色荧光蛋白标记兔BMSCs体外成骨的定量能谱分析

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安徽医科大学学报 2015年第4期50卷 415-418页

作者：宁寅宽李强蔡伟良武成聪陈佳滨石正松桂林医学院附属医院四肢创伤手外科桂林541001

目的观察绿色荧光蛋白(GFP)标记的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨诱导后形态学改变和体外骨生成中矿化钙结节的形成,并结合扫描电镜和X射线能谱分析技术(SEM/EDS)对矿化钙结节元素进行定量能谱分析。方法用携带GFP基因的腺病毒转染兔BM... 详细信息

目的观察绿色荧光蛋白(GFP)标记的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨诱导后形态学改变和体外骨生成中矿化钙结节的形成,并结合扫描电镜和X射线能谱分析技术(SEM/EDS)对矿化钙结节元素进行定量能谱分析。方法用携带GFP基因的腺病毒转染兔BMSCs进行示踪标记,并诱导细胞向成骨方向分化,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察成骨诱导后细胞形态改变和矿化钙结节的形成,结合SEM/EDS技术观测矿化钙结节的表面微观结构及其元素构成。结果腺病毒介导GFP基因(Ad-GFP)转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,经成骨诱导后细胞形态向成骨方向分化,并形成不透光的矿化钙结节,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,SEM下见矿化钙结节散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。EDS分析显示矿化钙结节主要组成元素与正常骨组织相同,其钙磷比(Ca/P)为1.55,接近正常骨组织钙磷比1.49。结论 AdGFP能成功转染并标记兔BMSCs,成骨诱导后BMSCs向成骨方向分化,具备较好的骨生成能力,BMSCs体外矿质化成骨过程与体内基本相同。

关键词：重组腺病毒绿色荧光蛋白骨髓间充质干细胞扫描电镜能谱分析