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沉默DNMT1减弱WIF-1基因启动子甲基化对慢性髓系白血病K562细胞生物学行为的影响

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中国实验血液学杂志 2021年第6期29卷 1768-1774页

作者：武坤晋臻李轶勋李昕程沈菊李艳红郭翀昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院云南省检验医学重点实验室云南昆明650032 昆明医科大学第一附属医院医学临床检验诊断省创新团队云南昆明650032

目的:探讨沉默DNA甲基转移酶(DNMT1)对人慢性髓系白血病细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子甲基化的影响。方法:构建DNMT1 siRNAi质粒,将DNMT1 siRNAi转染至慢性髓系白血病K562细胞中,采用RT-PCR和Western blot法检测DNMT1... 详细信息

目的:探讨沉默DNA甲基转移酶(DNMT1)对人慢性髓系白血病细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子甲基化的影响。方法:构建DNMT1 siRNAi质粒,将DNMT1 siRNAi转染至慢性髓系白血病K562细胞中,采用RT-PCR和Western blot法检测DNMT1基因和相关蛋白的表达,并利用甲基化PCR检测WIF-1基因启动子甲基化水平,台盼蓝拒染法和MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞的凋亡率,集落形成实验检测细胞的集落形成能力,Western blot法检测沉默DNMT1基因后Wnt/β-catenin及其下游信号通路蛋白的表达情况。结果:实验组DNMT1 mRNA和相关蛋白表达水平显著低于对照组和阴性对照组(P实验组WIF-1基因启动子区域甲基化水平显著降低。MSP检测结果显示,实验组未甲基化的WIF-1引物扩增出的PCR产物含量显著增加,而甲基化的WIF-1引物扩增出的PCR产物含量显著降低。转染成功48 h后,实验组的OD值、活细胞数及集落形成数均显著低于阴性对照组和对照组(P实验组的细胞凋亡率显著高于阴性对照组和对照组(P实验组K562细胞中β-actin、myc、cyclin D1和TCF-1蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和对照组(P<0.05)。结论:沉默DNMT1基因能够抑制K562细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关。

关键词： DNA甲基转移酶1 人慢性髓系白血病高甲基化 Wnt抑制因子-1

人类免疫缺陷病毒1型的广谱中和抗体的亲和力成熟与特征及其运用

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中华预防医学杂志 2022年第2期56卷 225-232页

作者：万鑫蕊孙明李娅昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室昆明医科大学第一附属医院临床检验诊断省创新团队昆明650032 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的长期不进展者(LTNP)体内分离到的广谱中和抗体(bNAbs),已被证明可以预防HIV-1感染并降低感染者体内的病毒载量,成为了指导HIV-1疫苗设计和被动免疫治疗的突破口。中和抗体的功能除了与靶向表位有关,其... 详细信息

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的长期不进展者(LTNP)体内分离到的广谱中和抗体(bNAbs),已被证明可以预防HIV-1感染并降低感染者体内的病毒载量,成为了指导HIV-1疫苗设计和被动免疫治疗的突破口。中和抗体的功能除了与靶向表位有关,其亲和力也极大的影响了抗体的活性。HIV-1 bNAbs通过体内的多轮亲和力成熟获得了较高亲和力,从而实现了广谱度和中和活性的增加。高亲和力HIV-1 bNAbs在治疗过程中能更好的协助机体免疫系统清除病原体,并且使用剂量更少,毒副作用也相对较低。在亲和力成熟的同时,HIV-1 bNAbs表现出了高水平的体细胞超突变(SHM)、插入缺失、较长的重链第三互补决定区等不寻常的特征。这些特征阻碍了通过有效疫苗诱导HIV-1 bNAbs在体内产生并发育成熟,因此了解抗体亲和力成熟过程中发生的突变及其要点,有助于理解中和抗体的活性与特征的关系,并为设计有效的HIV-1潜在免疫原提供参考。

关键词：人类免疫缺陷病毒广谱中和抗体抗体亲和力疫苗

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌脂多糖修饰相关的多黏菌素耐药机制研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第6期43卷 442-450页

作者：张鑫迪杜艳牛敏昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室云南省医学检验临床医学研究中心昆明650032

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)脂多糖修饰相关的多黏菌素耐药机制。方法通过接合转移和mcr基因的检测探究是否存在质粒介导的耐药基因;利用实时荧光定量PCR检测多黏菌素耐药相关基因的相对表达量,并进行全基因组测序分析;采用... 详细信息

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)脂多糖修饰相关的多黏菌素耐药机制。方法通过接合转移和mcr基因的检测探究是否存在质粒介导的耐药基因;利用实时荧光定量PCR检测多黏菌素耐药相关基因的相对表达量,并进行全基因组测序分析;采用SDS-PAGE银染试验和MALDI-TOF-MS质谱分析检测脂多糖的改变。结果未扩增出mcr-1~8基因且接合转移试验结果为阴性,未检测到与耐药性相关的可移动元件。7株多黏菌素耐药CRKP中pmrA、pmrB、pmrC基因的相对表达量均增高,其中6株phoP/phoQ基因的相对表达量增高;3株crrA/crrB基因的相对表达量降低;4株mgrB基因的相对表达量降低。耐药株发生的错义突变位点主要位于KPHS_09430、KPHS_35900、KPHS_39520、KPHS_52420等基因上,在CRKP-6菌株中检测到ISKpn14插入序列。MALDI-TOF-MS观察到耐药菌株脂多糖中天然脂质A有L-Ara4N修饰。结论染色体介导的双组分调节系统突变引起脂多糖修饰是本研究CRKP对多黏菌素耐药的主要机制,且双组分调节系统的突变对多黏菌素耐药性的影响在不同菌株背景下也存在差异。

关键词：耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制脂多糖双组分调节系统

具核梭杆菌通过NF-κB信号通路促进结直肠癌细胞HCT116中TNF-α诱导的炎症性改变

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第6期41卷 448-454页

作者：何秋月段勇牛敏毕建蝶杜娜杜艳昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室昆明医科大学第一附属医院临床检验诊断省创新团队650032 云南中医药大学第一附属医院检验科昆明650032

目的探讨具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)感染促进TNF-α诱导的结直肠癌细胞HCT116炎症改变的机制。方法建立Fn感染细胞及TNF-α炎症诱导模型并分为4组,即未感染对照组、Fn感染组、TNF-α诱导组、Fn+TNF-α组。首先用Fn感染正... 详细信息

目的探讨具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)感染促进TNF-α诱导的结直肠癌细胞HCT116炎症改变的机制。方法建立Fn感染细胞及TNF-α炎症诱导模型并分为4组,即未感染对照组、Fn感染组、TNF-α诱导组、Fn+TNF-α组。首先用Fn感染正常结肠上皮细胞hcoEPIC和结直肠癌细胞HCT116、LoVo,分别检测Fn对不同结肠细胞的黏附情况。TNF-α诱导HCT116细胞3 h后加入Fn感染,24 h后分别用CCK8试验和乳酸脱氢酶(LDH)活力测定法检测细胞存活率及细胞损伤情况。ELISA法检测细胞内和细胞培养上清中核转录因子(NF-κB)和细胞因子(IL-6、IL-8、IL-1β)的表达。结果Fn对结直肠癌细胞HCT116和LoVo的黏附性较强(P一步促进了细胞死亡和损伤(P0.05)。Fn+TNF-α组中IL-6、IL-8、IL-1β的表达均显著高于正常对照组和单独处理组(P<0.05)。结论Fn能够优先黏附于结直肠癌细胞HCT116上,进而促进TNF-α诱导的细胞损伤、死亡和NF-κB及其下游促炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β的表达和释放。

关键词：具核梭杆菌结直肠癌 NF-κB信号通路炎症反应

铁载体毒力基因entB对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌毒力的影响

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中华检验医学杂志 2022年第6期45卷 642-648页

作者：韩睿辉牛敏刘淑敏毕建蝶杜艳昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室云南省医学检验临床医学研究中心昆明650032

目的明确铁载体毒力基因entB对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)毒力的影响。方法从昆明医科大学第一附属医院收集到的30株CRKP菌株中筛选出CRKP-27作为实验菌株,规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas9基因敲除技术构建entB基因缺... 详细信息

目的明确铁载体毒力基因entB对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)毒力的影响。方法从昆明医科大学第一附属医院收集到的30株CRKP菌株中筛选出CRKP-27作为实验菌株,规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas9基因敲除技术构建entB基因缺失株ΔentB、回补株C-ΔentB,并通过PCR验证敲除及回补是否成功。观察CRKP-27、ΔentB、C-ΔentB菌株的菌落形态并进行拉丝试验,初步了解entB对CRKP菌落形态和毒力表型的影响。绘制菌株生长曲线,测定entB对CRKP菌株生长的影响。铬天青S(CAS)检测液对菌株产铁载体能力进行定量检测。建立小鼠腹腔感染模型,观察小鼠生存率直观了解entB基因对CRKP毒力的影响。计量资料均采用平均数±标准差表示,服从正态分布的数据采用方差分析进行组间比较,不服从正态分布的数据采用Kruskal-Wallis秩和检验。小鼠生存分析用Log-Rank检验进行比较。P实验中,与CRKP-27组(P=0.023)和C-ΔentB组(P=0.024)相比,ΔentB组小鼠生存率明显增高,说明entB基因增加了CRKP菌株的毒力。结论铁载体毒力基因entB明显减弱了菌株的生长能力,但使CRKP产铁载体能力、毒力明显增强。

关键词：克雷伯菌肺炎碳青霉烯类耐药铁载体毒力基因

产NDM-1阴沟肠杆菌的耐药性与毒力基因分布

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中国感染控制杂志 2021年第10期20卷 869-875页

作者：余艳牛敏杜艳任玉吉代鹏飞何秋月刘淑敏昆明医科大学第一附属医院检验科云南省检验医学重点实验室昆明医科大学第一附属医院临床检验诊断省创新团队云南昆明650032

目的了解产新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)阴沟肠杆菌(ECL)耐药性与毒力基因分布情况。方法收集2017年1月—2020年11月昆明医科大学第一附属医院分离的ECL,试验组为29株产NDM-1的耐碳青霉烯类ECL(CRECL),对照组为32株不产NDM-1的CRECL... 详细信息

目的了解产新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)阴沟肠杆菌(ECL)耐药性与毒力基因分布情况。方法收集2017年1月—2020年11月昆明医科大学第一附属医院分离的ECL,试验组为29株产NDM-1的耐碳青霉烯类ECL(CRECL),对照组为32株不产NDM-1的CRECL和35株碳青霉烯类敏感ECL(CSECL)。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)、全自动微生物分析系统进行菌株鉴定和药敏试验,PCR方法检测NDM-1耐药基因、24对毒力基因,采用χ^(2)检验比较毒力基因分布差异。结果该院分离的CRECL菌株NDM-1基因检出率为47.5%,产NDM-1的CRECL对常用抗菌药物表现为多重耐药。96株ECL菌株中,毒力基因acr A、tol C、wca A、wca M、wza的检出率较高,分别为80.2%、90.6%、87.5%、75.0%、92.7%,clp B、icmf、V as D/L ip基因的检出率也均在60%以上,未检出esc V、nle B、pet、hly A等毒力基因。产NDM-1的CRECL组clp B、icmf、V as D/L ip、acr A基因检出率高于不产NDM-1的CRECL,CRECL组clp B、icmf、V as D/L ip基因检出率高于CSECL组,差异具有统计学意义(P临床用药应兼顾细菌的耐药性和毒力基因分布情况。

关键词：阴沟肠杆菌 NDM-1 耐药毒力基因

肠道菌群在冠心病中的作用机制及生物标志物应用进展

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中华检验医学杂志 2023年第7期46卷 748-753页

作者：徐秋月段勇昆明医科大学第一附属医院医学检验科、云南省检验医学重点实验室、云南省医学检验临床研究中心昆明650032

冠心病已成为中国重大的公共卫生问题,通过分析肠道菌群及代谢产物实现冠心病的辅助诊断、治疗及预防靶点逐渐成为研究热点,多个研究表明肠道菌群紊乱可能通过直接作用或其代谢产物间接介导冠心病进程,而一些肠道益生菌则具有抑制动脉... 详细信息

冠心病已成为中国重大的公共卫生问题,通过分析肠道菌群及代谢产物实现冠心病的辅助诊断、治疗及预防靶点逐渐成为研究热点,多个研究表明肠道菌群紊乱可能通过直接作用或其代谢产物间接介导冠心病进程,而一些肠道益生菌则具有抑制动脉粥样硬化的作用。该文对肠道菌群及其代谢产物的变化在冠心病中的作用机制及其作为生物标志物的诊断效能研究现状进行了综述,以期为临床应用提供新思路。

关键词：动脉粥样硬化心血管疾病肠道菌群代谢产物生物标志物

blaNDM-1基因敲除对阴沟肠杆菌毒力的影响

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吉林大学学报（医学版） 2022年第6期48卷 1389-1394页

作者：代鹏飞杨恺杜艳刘淑敏昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室云南省医学检验临床医学研究中心云南昆明650032

目的:比较bla NDM-1基因敲除前后阴沟肠杆菌毒力的变化,阐明bla NDM-1基因对其毒力的影响。方法:将携带bla NDM-1基因的阴沟肠杆菌分为携带耐药基因bla NDM-1的阴沟肠杆菌T2(T2组)、阴沟肠杆菌T2 bla NDM-1基因敲除株(ΔT2组)和阴沟肠杆... 详细信息

目的:比较bla NDM-1基因敲除前后阴沟肠杆菌毒力的变化,阐明bla NDM-1基因对其毒力的影响。方法:将携带bla NDM-1基因的阴沟肠杆菌分为携带耐药基因bla NDM-1的阴沟肠杆菌T2(T2组)、阴沟肠杆菌T2 bla NDM-1基因敲除株(ΔT2组)和阴沟肠杆菌ATCC13047 (ST组)。检测各组质粒稳定性、各组阴沟肠杆菌的菌落运动直径、生物膜吸光度(A)值、黏附细菌量、黏附率及侵袭黏附比。结果:传代200次后,T2组阴沟肠杆菌仍携带bla NDM-1基因,ΔT2和ATCC13047组阴沟肠杆菌不携带bla NDM-1基因;T2组阴沟肠杆菌仅携带碳青霉烯类耐药基因bla NDM-1,其他碳青霉烯类耐药基因bla KPC-2、bla IMP-4、bla VIM-1和bla OXA-48均为阴性;ΔT2和ST组所检测的5种碳青霉烯类耐药基因均为阴性,T2与ΔT2组阴沟肠杆菌携带相同的毒力基因clp B、icmf和acr A。T2组菌落运动直径小于ΔT2和ST组(P0.05)。与T2组比较,ΔT2组黏附细菌量降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。共培养24 h后,T2组和ΔT2组RAW264.7细胞的黏附率和侵袭黏附比低于ST组(P<0.05)。结论:bla NDM-1基因未明显增加阴沟肠杆菌的毒力。

关键词：阴沟肠杆菌 blaNDM-1 基因敲除毒力耐药

Notch1基因在T-ALL患者中的表达及其对NF-κB通路的影响

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中国免疫学杂志 2022年第8期38卷 982-986页

作者：武坤郭翀马晓波李云涛张学美李林燕罗珊史明霞(指导) 昆明医科大学第一附属医院医学检验科昆明650032 昆明医科大学第一附属医院血液科昆明650032 云南省血液病研究中心昆明650032 云南省检验医学重点实验室昆明650032 临床检验诊断省创新团队昆明650032

目的:探讨Notch1基因在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其对NF-κB通路的作用。方法:选取T-ALL患者67例作为试验组,以67例健康体检者作为对照。采用qRT-PCR分析PBMC中Notch1和NF-κB通路(IκBα、IKKβ... 详细信息

目的:探讨Notch1基因在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其对NF-κB通路的作用。方法:选取T-ALL患者67例作为试验组,以67例健康体检者作为对照。采用qRT-PCR分析PBMC中Notch1和NF-κB通路(IκBα、IKKβ)mRNA表达量,分析Notch1的表达水平与T-ALL患者临床指标和预后之间的关联,以及Notch1与NF-κB通路mRNA表达水平的关联。沉默Jurkat细胞中的Notch1基因,qRT-PCR分析Notch1、IκBα和IKKβ mRNA表达,Western blot分析Notch1、磷酸化IκBα(p-IκBα)和磷酸化IKKβ(p-IKKβ)蛋白表达。结果:T-ALL组PBMC中Notch1 mRNA表达水平高于健康组,差异有统计学意义(P临床指标和生存率相关,Notch1可能通过NF-κB通路发挥作用。

关键词：急性T淋巴细胞白血病 Notch1基因 NF-κB通路临床特征