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基于酵母双杂交技术对与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒σNS相互作用宿主蛋白的筛选

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1313-1321页

作者：孙绿茵马竹萍李润林李永刚陶晓莉锦州医科大学基础医学院病原生物学教研室辽宁锦州121000

目的:探讨小鼠成纤维L929细胞中与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒(NBV)σNS蛋白相互作用(互作)的宿主蛋白,阐明宿主蛋白对病毒复制的影响。方法:构建表达σNS蛋白的诱饵质粒pGBKT7-S3,采用测序技术验证诱饵质粒在Y2H酵母细胞中的准确表达。将pG... 详细信息

目的:探讨小鼠成纤维L929细胞中与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒(NBV)σNS蛋白相互作用(互作)的宿主蛋白,阐明宿主蛋白对病毒复制的影响。方法:构建表达σNS蛋白的诱饵质粒pGBKT7-S3,采用测序技术验证诱饵质粒在Y2H酵母细胞中的准确表达。将pGBKT7-S3和pGADT7质粒分别和共同转化至Y2HGold酵母细胞中,涂布于固体培养基进行培养,观察菌落生长情况,确认σNS蛋白对酵母细胞无毒性,不能自行激活报告基因。诱饵质粒pGBKT7-S3与小鼠成纤维L929细胞的cDNA文库进行杂交,对编码互作蛋白的阳性克隆进行质粒抽提,阳性测序结果通过Uniprot数据库检索筛选得到与NBVσNS互作的蛋白。对互作蛋白进行基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析和STRING生物信息学分析。结果:成功筛选出61个阳性克隆。DNA测序分析和BLAST比对分析去除23个未匹配到数据库和测序基本相同的阳性克隆。阳性测序结果通过Uniprot数据库检索筛选得到38个与NBVσNS互作的蛋白,31个蛋白参与细胞生物过程,36个蛋白是细胞解剖成分,31个蛋白具有结合功能,5个蛋白是线粒体呼吸链组成部分,7个蛋白是核糖体蛋白和核糖体大小亚基的组成部分,2个蛋白参与铁代谢稳态。GO功能富集分析,互作蛋白参与的生物过程(BP)富集在细胞过程、代谢过程、生物学调节、定位和对刺激的反应等;细胞组分主要是细胞解剖成分和含蛋白复合物;分子功能集中在结合、催化活性、结构分子活性和转运活性等方面。KEGG信号通路富集分析,蛋白在遗传信息处理途径的翻译、折叠、分类和降解信号通路中高度富集,在机体系统中主要与消化系统有关联;与多种病毒性传染病和癌症有关联。STRING分析,互作蛋白涉及核糖体蛋白类、蛋白修饰类、代谢类和免疫蛋白类等功能蛋白。结结论论:成功筛选出与NBVσNS蛋白互作的蛋白,宿主蛋白在病毒复制中具有重要作用。

关键词：纳尔逊海湾正呼肠孤病毒酵母双杂交实验 σNS蛋白蛋白互相作用生物信息学

琐琐葡萄多糖对Aβ_(1-42)诱导HT22细胞氧化损伤的改善作用

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海南医学院学报 2024年第17期30卷 1304-1312页

作者：马心念高培吴妍陈财井维鑫袁芳新疆医科大学基础医学院生物学教研室新疆乌鲁木齐830017 新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室新疆乌鲁木齐830017

目的:探讨脱蛋白后琐琐葡萄多糖(DVTP)对Aβ_(1-42)诱导的阿尔兹海默症细胞模型氧化损伤的影响。方法:将HT22细胞分为对照组,模型组(Aβ_(1-42))及Aβ_(1-42)+DVTP(20、40、80μg/mL)组,使用CCK8检测细胞存活率,在光镜、透射电镜下观察... 详细信息

目的:探讨脱蛋白后琐琐葡萄多糖(DVTP)对Aβ_(1-42)诱导的阿尔兹海默症细胞模型氧化损伤的影响。方法:将HT22细胞分为对照组,模型组(Aβ_(1-42))及Aβ_(1-42)+DVTP(20、40、80μg/mL)组,使用CCK8检测细胞存活率,在光镜、透射电镜下观察细胞形态和线粒体结构变化,DCFH-DA和JC-10荧光探针法测定细胞中活性氧(ROS)及线粒体膜电位水平,同时利用RT-qPCR和Western blot分析Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC的mRNA和蛋白表达水平。结果:与对照组相比,模型组细胞存活率下降,细胞形态及线粒体结构损伤程度较高;ROS水平升高,线粒体膜电位下降;Keap1 mRNA及蛋白表达水平升高,Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC表达水平降低。同模型组相比,DVTP预处理后细胞存活率显著提升,细胞形态及线粒体结构损伤程度较低;ROS水平降低,线粒体膜电位升高;Keapl mRNA及蛋白表达水平下降,Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC表达水平升高。结论:DVTP可通过调节抗氧化酶的表达水平改善Aβ_(1-42)诱导的氧化损伤,有望成为一种治疗AD的候选药物。

关键词：琐琐葡萄多糖阿尔兹海默症氧化应激

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弓形虫肌动蛋白抗原表位抗体的制备及应用

中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 73-78页

作者：庄宝灿朱进进余莉安徽医科大学病原生物学教研室、病原生物学安徽省重点实验室人畜共患病安徽高校省级重点实验室合肥230032

制备弓形虫肌动蛋白(TgActin)多肽表位抗体并探讨其应用价值。BepiPred 1.0 Server在线分析设计TgActin抗原表位,并与多种属Actin进行同源比对,选取并合成高特异性多肽片段序列免疫新西兰兔。末次免疫后收集兔血清并使用Protein G纯化抗... 详细信息

制备弓形虫肌动蛋白(TgActin)多肽表位抗体并探讨其应用价值。BepiPred 1.0 Server在线分析设计TgActin抗原表位,并与多种属Actin进行同源比对,选取并合成高特异性多肽片段序列免疫新西兰兔。末次免疫后收集兔血清并使用Protein G纯化抗体,SDS-PAGE检测抗体纯度,ELISA测定抗体效价,Western blot分析抗体的特异性及TgActin表位抗体作为内参抗体的可能性,免疫荧光观察胞内速殖子形态。结果显示,ELISA测定抗体效价为1∶128000,Western blot结果显示抗体特异性识别弓形虫Actin,免疫荧光染色显示TgActin表位抗体可以标记纳虫泡内速殖子。结果表明,成功制备了TgActin多肽表位抗体,可用做弓形虫蛋白检测的内参抗体及其在细胞内的免疫荧光检测,为后续弓形虫研究提供了便利条件。

关键词：弓形虫肌动蛋白表位抗体内参抗体免疫荧光

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白纹伊蚊细胞色素P450 CYP4H42v2蛋白生物信息学分析

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中国病原生物学杂志 2024年第5期19卷 544-549,554页

作者：黄琳梁秋果杨天皓杨绚汤红日龚英刘晖莫兴泽黔南民族医学高等专科学校贵州都匀558000 遵义医科大学病原生物学教研室

目的运用生物信息学方法预测分析白纹伊蚊细胞色素CYP4H42v2蛋白的结构与功能。方法基于白纹伊蚊基因组数据库筛选出CYP4H42v2基因并进行PCR验证;利用在线软件Expasy分析该基因编码的CYP4H42v2蛋白的理化性质和亲疏水性;利用HMMTOP vers... 详细信息

目的运用生物信息学方法预测分析白纹伊蚊细胞色素CYP4H42v2蛋白的结构与功能。方法基于白纹伊蚊基因组数据库筛选出CYP4H42v2基因并进行PCR验证;利用在线软件Expasy分析该基因编码的CYP4H42v2蛋白的理化性质和亲疏水性;利用HMMTOP version 2.0和SignalP 4.1 server分别预测CYP4H42v2蛋白的跨膜结构域以及信号肽;运用NetPhos、NCBI-Conserved domains、SOPMA、SWISS-MODEL、IEDB在线程序分别预测CYP4H42v2蛋白潜在的磷酸化位点、保守域结构、蛋白二级、三级结构及其抗原表位;对其编码的氨基酸序列进行同源比对,利用MEGA X软件构建系统进化树,通过STRING数据库对其蛋白互作网络进行预测。结果CYP4H42v2基因全长1664 bp,开放阅读框为1508 bp,编码502个氨基酸;无信号肽,存在跨膜结构域,为疏水性蛋白,有潜在的磷酸化位点和保守域结构;CYP4H42v2蛋白具有α螺旋、β折叠结构和互变异构酶活性;CYP4H42v2蛋白具有18个抗原表位,在STRING数据库共鉴定出11个相关基因以及43个互作关系。结论利用生物信息学方法预测分析白纹伊蚊CYP4H42v2基因,发现其编码蛋白存在潜在抗原表位,且具有多个磷酸化位点,为CYP4基因在白纹伊蚊抗药性机制的研究中发挥的作用提供理论基础。

关键词：白纹伊蚊 CYP4 序列分析功能蛋白

志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak的表达纯化与多克隆抗体的制备及应用

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中国人兽共患病学报 2024年第3期40卷 236-242页

作者：贾雪娇刘梦琦刘洋刘长城李小凤胡屹硕李香雨李润林李永刚赵微锦州医科大学基础医学院病原生物学实验室锦州121001

目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dn... 详细信息

目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak;pET24a(+)-Dnak原核表达质粒转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经镍柱纯化Dnak蛋白。以纯化后的重组蛋白为免疫原免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测效价,Western Blot法检测灵敏度和特异性。利用制备的多克隆抗体在GST Pull-down实验中检测Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2的相互作用。真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak转染至HEK293T细胞,以制备的DnaK多克隆抗体为一抗,Western blot法检测Dnak在细胞中的表达。利用MEGA11及Genedoc软件分析此志贺氏杆菌与志贺菌属其他细菌Dnak氨基酸序列同源性。结果重组质粒pET24a(+)-Dnak与PCDNA3.1-Dnak经测序比对包含与此志贺氏杆菌(Shigella:PRJNA804371)序列一致的基因,证明质粒构建成功。诱导表达的重组Dnak蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约为75 kDa,浓度可达0.62 mg/mL;Dnak鼠多克隆抗体可与重组Dnak蛋白发生特异性反应,效价为1∶32000,至少可以在1∶6000稀释度下检测到Dnak蛋白。GST Pull-down实验可以检测到Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2发生相互作用。转染PCDNA3.1-Dnak重组质粒的HEK293T细胞可以表达Dnak蛋白。经MEGA11和Genedoc软件比对PRJNA804371株与宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)Dnak氨基酸序列同源性较高。结论成功表达志贺氏杆菌Dnak蛋白,具有良好反应性与免疫原性;制备的鼠多克隆抗体效价及灵敏度较高可满足后续实验需要。

关键词：志贺氏杆菌 Dnak 蛋白表达与纯化多克隆抗体轮状病毒

ULK3基因在前列腺癌中的生物信息学分析及其在DU145中的表达

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基因组学与应用生物学 2024年

作者：邹雨轩张云博孙梦李梦佳韩洋洋新疆医科大学基础医学院生物学教研室新疆地方病分子生物学重点实验室

本研究旨在利用生物信息学方法分析ULK3在前列腺癌（prostate cancer，PCa）中的潜在作用，并通过构建稳定敲降ULK3的前列腺癌细胞株DU145，探究ULK3对前列腺癌细胞增殖的影响。通过在线数据库TCGA、UALCAN分析ULK3在PCa中的表达情况；... 详细信息

本研究旨在利用生物信息学方法分析ULK3在前列腺癌（prostate cancer，PCa）中的潜在作用，并通过构建稳定敲降ULK3的前列腺癌细胞株DU145，探究ULK3对前列腺癌细胞增殖的影响。通过在线数据库TCGA、UALCAN分析ULK3在PCa中的表达情况；利用STRING数据库分析ULK3相关的互作蛋白，并对ULK3差异表达基因进行GSEA富集分析；通过GO、KEGG分析，探讨ULK3的潜在作用机制；通过miRNet平台预测了调控ULK3的微RNA（miRNA），并构建PCa中潜在的 ULK3-miRNA-mRNA调控网络；利用TIMER 2.0数据库分析了ULK3在PCa中与免疫浸润的关系。基于上述生物信息学分析，对PCa细胞DU145进行ULK3敲降处理，并通过实时定量PCR（(real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白印迹（Western blot）检测ULK3下调效率；通过划痕实验和MTT法检测ULK3稳定下调对前列腺癌细胞增殖的影响。结果显示，ULK3在PCa癌组织中较正常前列腺组织高表达；通过富集分析，发现ULK3的表达与多种生物学功能有关，其中主要作用的通路有范可尼贫血途径和Notch信号通路；通过免疫浸润分析，发现ULK3高表达时多种免疫细胞的浸润水平显著下降。此外，成功构建敲降ULK3的前列腺癌细胞系DU145，经过划痕实验和MTT法发现敲降ULK3后对DU145细胞的迁移和增殖起到抑制作用。以上结果表明ULK3在前列腺癌中发挥重要生物学作用，敲降其对PCa可能存在抑制作用，这为后续PCa的基础研究与临床治疗提供了新的思路。

关键词： ULK3 前列腺癌(PCa) 生物信息学慢病毒增殖

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拐枣提取物的活性成分及肠道菌群调节作用

中国测试 2024年

作者：蒙紫鑫陈峥宏吴道艳贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州省病原生物学特色重点实验室

拐枣富含多酚，本课题研究了拐枣甲醇提取物的活性成分和益生功能，为拐枣甲醇提取物的开发利用提供参考价值。利用气相色谱/质谱（GC/MS）和高效液相色谱（HPLC）技术结合体外发酵模型，对拐枣甲醇提取物的活性成分及肠道菌群调节作用... 详细信息

拐枣富含多酚，本课题研究了拐枣甲醇提取物的活性成分和益生功能，为拐枣甲醇提取物的开发利用提供参考价值。利用气相色谱/质谱（GC/MS）和高效液相色谱（HPLC）技术结合体外发酵模型，对拐枣甲醇提取物的活性成分及肠道菌群调节作用进行分析测试。结果表明，在拐枣甲醇提取物中检测到7-羟基-4-甲氧基甲基香豆素、(4-溴-2-氯苯氧基)乙酸、胸苷、西伯利亚远志糖A6等主要化学组分；定量检测到可增强拐枣甲醇提取物抗氧化能力的没食子酸、阿魏酸、香草酸、儿茶素等酚类物质。拐枣甲醇提取物可促进肠道益生菌的增殖，提高肠道菌群代谢物短链脂肪酸（SCFAs）的含量。综上，拐枣甲醇提取物具有多种活性成分，对肠道菌群有调节作用，研究结果有望挖掘其在肠道健康和产品开发领域的应用潜力。

关键词：拐枣活性成分多酚肠道菌群短链脂肪酸

基于网络药理学和动物体内试验验证云实感冒合剂对呼吸道合胞病毒作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第2期44卷 170-182页

作者：徐庆胜李玉迁蒋立娜魏洪迟茜文廖思睿陈维娇贵州医科大学基础医学院国家级实验教学中心微生物学教研室贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州省普通高校学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州医科大学基础医学院国家级实验教学中心贵阳550025

目的基于网络药理学和体内试验探讨云实感冒合剂抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的作用机制。方法网络药理学预测:运用TCMSP、GeneCards等数据库预测云实感冒合剂干预RSV的活性成分及作用靶点。利用Cytoscape 3.2.1... 详细信息

目的基于网络药理学和体内试验探讨云实感冒合剂抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的作用机制。方法网络药理学预测:运用TCMSP、GeneCards等数据库预测云实感冒合剂干预RSV的活性成分及作用靶点。利用Cytoscape 3.2.1软件构建中药成分-疾病靶点网络图。通过STRING数据库分析蛋白质相互作用关系。借助Metascape数据库进行富集分析。采用分子对接技术分析验证网络药理学结果。云实感冒合剂干预RSV感染验证试验:滴鼻法建立RSV小鼠模型,灌胃合剂后检测血常规、肺指数,观察肺组织病理变化,流式细胞术检测外周血T细胞亚群,ELISA检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量,RT-PCR检测肺组织中TLR4、NF-κB和RSV-N基因mRNA相对水平。结果分析获得云实感冒合剂有效活性成分41个,抗RSV靶点111个,富集得到167条信号通路,主要是PI3K/AKT、MAPK、Toll-like等信号通路。分子对接结果显示,云实感冒合剂活性成分木犀草素、山奈酚、槲皮素与RSV-G、RSV-F、PI3K、AKT1、Bcl-2结合能均小于0 kcal/mol。体内试验结果显示,与RSV组相比,云实感冒合剂高剂量组白细胞、淋巴细胞计数升高、肺指数降低,差异有统计学意义(P学意义(P<0.05)。结论云实感冒合剂通过多成分、多靶点、多通路发挥调控RSV感染,主要通过缓解肺组织病理损伤,减轻炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路激活有关。

关键词：云实感冒合剂网络药理学呼吸道合胞病毒体内试验分子对接

乳鼠志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体的制备与鉴定

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中国病原生物学杂志 2024年第2期19卷 137-143页

作者：刘梦琦贾雪娇刘洋刘长城李小凤胡屹硕赵微锦州医科大学基础医学院病原生物学实验室辽宁锦州121000

目的制备志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体,为探究乳鼠志贺杆菌上清蛋白GroEL在乳鼠肠道内的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术构建原核表达蛋白质粒Pet28a(+)-GroEL,转化Escherichia coil BL21(DE3)后采用不同浓度IPTG诱导表达,优化... 详细信息

目的制备志贺杆菌分泌蛋白GroEL多克隆抗体,为探究乳鼠志贺杆菌上清蛋白GroEL在乳鼠肠道内的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术构建原核表达蛋白质粒Pet28a(+)-GroEL,转化Escherichia coil BL21(DE3)后采用不同浓度IPTG诱导表达,优化诱导时间和温度,确定最佳蛋白表达条件;利用His标签亲和层析法纯化GroEL蛋白。将纯化蛋白与佐剂按照等比例充分混合后免疫C57BL/6小鼠,制备多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体的效价、灵敏度及特异性。构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GroEL并转染293T细胞,48 h后采用制备的GroEL多克隆抗体进行Western blot验证。结果Pet28a(+)-GroEL转化*** BL21(DE3)菌在28℃、0.4 mmol/L IPTG诱导12h获得最佳蛋白表达,表达的重组蛋白分子质量约为63 ku,纯化后的蛋白浓度为0.735 mg/mL。Western blot检测显示该蛋白能被抗His标签鼠单克隆抗体识别。ELISA检测显示制备的抗GroEL多克隆抗体血清效价为1∶128000;Western blot检测显示该抗体可识别GroEL蛋白。结论重组表达的GroEL蛋白具有抗原性,制备的鼠抗GroEL多克隆抗体血清具有特异性且效价高,为研究乳鼠志贺杆菌GroEL蛋白与肠道病毒之间的作用机制奠定了基础。

关键词：志贺菌 GroEL蛋白蛋白纯化多克隆抗体制备轮状病毒