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猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2024年

作者：王俊丽雷白时张武超赵款袁万哲农业农村部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站河北省兽医生物技术创新中心河北农业大学动物医学院

猪圆环病毒3型(PCV3)在全球范围内广泛存在，在临床上能引起猪皮炎和肾病综合征等症状，给养猪业带来巨大的经济损失。为掌握PCV3的流行情况，为PCV3防控提供理论依据，建立检测PCV3荧光定量PCR方法并开展河北地区分子流行病学调查。根... 详细信息

猪圆环病毒3型(PCV3)在全球范围内广泛存在，在临床上能引起猪皮炎和肾病综合征等症状，给养猪业带来巨大的经济损失。为掌握PCV3的流行情况，为PCV3防控提供理论依据，建立检测PCV3荧光定量PCR方法并开展河北地区分子流行病学调查。根据PCV3的开放阅读框2(ORF2)保守基因序列设计特异性引物，建立检测PCV3的SYBR Green Ⅰ 荧光定量PCR检测方法，对其特异性、敏感性和重复性进行评估，应用建立的方法对实验室保存的河北地区临床样品进行回顾性流行病学调查。结果显示，质粒标准品在5.96×108-5.96×102copies/μL浓度内线性关系良好，只能特异性检测PCV3病毒，最低检测限为5.96×101copies/μL；批内和批间变异系数分别小于1%和2%。检测2015-2020年河北省部分地区的临床样品，PCV3的总阳性率为81.22%，说明PCV3在河北地区感染很普遍。本研究建立了一种检测PCV3的SYBR Green Ⅰ 荧光定量PCR检测方法，应用建立的方法掌握了河北地区PCV3的流行情况，为后续对病毒的深入研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒3型荧光定量PCR 应用流行病学调查

旋毛虫新生幼虫细胞外囊泡的分离鉴定及组学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 225-233页

作者：刘毅蔡玉春陈家旭陈韶红俞英昉中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际研究中心上海200025 上海健康医学院医学技术学院上海201318

目的分离并鉴定旋毛虫新生幼虫分泌的细胞外囊泡(EV)主要成分,了解新生幼虫EV的功能。方法消化旋毛虫保种小鼠肌肉,手机旋毛虫肌幼虫,昆明小鼠灌胃感染肌幼虫(2000条/鼠)后5 d取小肠,网筛法收集旋毛虫成虫,成虫置于RPMI 1640培养液中培... 详细信息

目的分离并鉴定旋毛虫新生幼虫分泌的细胞外囊泡(EV)主要成分,了解新生幼虫EV的功能。方法消化旋毛虫保种小鼠肌肉,手机旋毛虫肌幼虫,昆明小鼠灌胃感染肌幼虫(2000条/鼠)后5 d取小肠,网筛法收集旋毛虫成虫,成虫置于RPMI 1640培养液中培养48 h后收集新生幼虫。采用差速超速离心法提取旋毛虫新生幼虫培养液中的EV,透射电子显微镜观察EV形态,使用纳米颗粒跟踪分析技术检测EV的粒径,蛋白质免疫印迹(Western blotting)验证EV蛋白。对新生幼虫及其EV进行蛋白组质谱分析和miRNA测序分析,采用t检验比较新生幼虫及其EV之间蛋白和miRNA的表达差异。差异表达蛋白和miRNA靶基因进行基因本体论(GO)功能条目富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用WoLFPSORT分析蛋白的亚细胞定位。结果透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析结果显示,旋毛虫新生幼虫分泌的EV为“杯盘”形膜性囊泡,平均粒径为(101.7±1.8)nm。Western blotting结果显示,新生幼虫EV能与旋毛虫感染小鼠血清产生特异性条带,相对分子质量约为65000。蛋白组质谱分析结果显示,新生幼虫及其EV样品中分别检测到1424和231种蛋白,有220种蛋白在两组样品中均有表达,其中116种表达有差异(在EV中31种表达上调、85种表达下调)。蛋白亚细胞定位分析结果显示,差异蛋白主要分布于细胞质(30.2%,35/116)、细胞核(19.0%,22/116)和细胞膜(17.2%,20/116)。miRNA测序结果显示,新生幼虫及其EV样品分别检测到183和117种miRNA,有46种miRNA在两组样品中均有表达,其中40种表达有差异(在EV中10种表达上调、30种表达下调)。在EV中表达上调的10种miRNA中,let-7-5p表达最高。GO功能条目富集分析结果显示,差异蛋白有57种属于细胞组成、73种具有分子功能、63种参与生物过程,差异miRNA的靶基因主要与自噬相关12基因转移酶活性、胞质泛素连接酶复合物、细胞对紫外线A的响应和钙离子稳态等条目有关。KEGG通路富集分析结果显示,差异蛋白主要富集在代谢途径、内质网中的蛋白质加工等相关通路,差异miRNA的靶基因仅涉及自噬-其他1条途径。结论本研究分离并鉴定了旋毛虫新生幼虫分泌的EV,检测到新生幼虫及其EV间差异表达的116种蛋白和40种miRNA,主要参与代谢、自噬等途径,推测新生幼虫EV可能在旋毛虫感染早期逃避宿主免疫防御的过程中发挥重要作用。

关键词：旋毛虫新生幼虫细胞外囊泡蛋白组学 miRNA测序

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H3亚型禽流感流行的潜在危害和防控建议

科学通报 2024年第10期69卷 1315-1319页

作者：刘金华孙洪磊高福中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室北京100193 中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室北京100101 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中国国家流感中心北京102206

21世纪短短的20年间,人类已经历了两次大流行传染病,即2009年甲型H1N1大流行流感和2019年新型冠状病毒感染.另外发生了5次世界卫生组织宣布的“全球关注的公共卫生应急事件”,给全球经济发展、社会稳定和人类健康造成了严重危害(https:/... 详细信息

21世纪短短的20年间,人类已经历了两次大流行传染病,即2009年甲型H1N1大流行流感和2019年新型冠状病毒感染.另外发生了5次世界卫生组织宣布的“全球关注的公共卫生应急事件”,给全球经济发展、社会稳定和人类健康造成了严重危害(https://***/emergencies/situations).大流行传染病的频繁出现警示我们,人兽共患性病毒是引发大流行疫病的重要病原.动物源性流感病毒在历史上导致了至少5次流感大流行,尤其是最近几年,动物流感病毒频繁跨种感染人类的现象让人们担忧其可能催生下一次人类流感大流行[1].

关键词：冠状病毒感染流感病毒防控建议禽流感 H3亚型跨种感染动物源性流感大流行

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两种呼吸道感染途径建立豚鼠结核模型的比较

中国实验动物学报 2024年第6期32卷 733-742页

作者：李新雨李海凤王煜屈沛杰王俊飞占玲俊中国医学科学院医学实验动物研究所北京100021 北京协和医学院比较医学研究中心北京100021 国家动物模型技术创新中心北京100021

目的建立不同剂量的滴鼻和气管内定量气溶胶感染途径的豚鼠结核模型,并进行对比分析,为标准化豚鼠呼吸道感染结核模型建立提供基础。方法雌性哈氏豚鼠24只,随机分为6组,每组4只,气管内定量气溶胶和滴鼻途径感染豚鼠均用两个剂量,均分为... 详细信息

目的建立不同剂量的滴鼻和气管内定量气溶胶感染途径的豚鼠结核模型,并进行对比分析,为标准化豚鼠呼吸道感染结核模型建立提供基础。方法雌性哈氏豚鼠24只,随机分为6组,每组4只,气管内定量气溶胶和滴鼻途径感染豚鼠均用两个剂量,均分为3个组(A、B、C组,D、E、F组)。气溶胶感染途径分为3组:A组(气溶胶对照组,未感染对照)、B组(气溶胶低剂量感染组,5×10^(2)CFU)和C组(气溶胶高剂量感染组,5×10~3 CFU);滴鼻感染途径也分为3组:D组(滴鼻对照组,未感染对照)、E组(滴鼻低剂量感染组,1×10^(4)CFU)和F组(滴鼻高剂量感染组,5×10^(4)CFU)。结核菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染豚鼠后观察其一般表现,第14天解剖,取肺、脾、肝组织,记录大体病变,用苏木素-伊红(HE)染色分析组织中结核肉芽肿病变,采用抗酸染色分析原位菌的分布和数量,菌分离培养分析脏器荷菌量。结果4个感染组(B、C、E、F组)豚鼠的肺、脾、肝均有肉眼可见的结核病灶及HE染色后可见结核肉芽肿病变。抗酸染色和荷菌量提示,B、C组的菌主要分布在肺组织,少数分布在脾和肝,荷菌量为104~10^(5)CFU/mL;E、F组的菌在肺、脾、肝均有分布,荷菌量为104~10^(5)CFU/mL。B、C、E、F组的病变和荷菌量,组间均无显著性差异,但B、C、F组内病理学及病原学指标的标准差较小。结论两个剂量的气溶胶和滴鼻途径均能制备豚鼠急性结核模型,病理学检查和病原学分析表明,气溶胶5×10^(2)CFU Mtb即可成功制备该模型,且模型均一性较好;滴鼻途径5×10^(4)CFU Mtb也可制备更均一的豚鼠急性结核模型,然而气溶胶5×10^(2)CFU比滴鼻途径5×10^(4)CFU发展为更严重的急性结核模型。

关键词：结核分枝杆菌豚鼠模型气溶胶滴鼻

槲皮素对铜绿假单胞菌LasB诱导THP-1巨噬细胞应激反应的保护作用

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中华预防医学杂志 2024年第3期58卷 337-346页

作者：任彦颖刘心伟朱芮有小娟李登州何志强王春霞杨曦明李永伟河南中医药大学第二临床医学院郑州450046 河南省中医院检验中心河南省防治耐药菌感染中医药重点实验室郑州市病原微生物与细菌耐药监测重点实验室郑州450002 北京中医药大学东直门医院检验中心北京100700

目的:探讨槲皮素对LasB诱导THP-1巨噬细胞凋亡、炎症反应和氧化应激的保护作用,旨在为槲皮素作为毒力抑制剂用于铜绿假单胞菌感染治疗提供借鉴和参考。方法:采用实验性研究。实验菌株为标准菌株,利用重组蛋白表达技术获得LasB蛋白,弹性... 详细信息

目的:探讨槲皮素对LasB诱导THP-1巨噬细胞凋亡、炎症反应和氧化应激的保护作用,旨在为槲皮素作为毒力抑制剂用于铜绿假单胞菌感染治疗提供借鉴和参考。方法:采用实验性研究。实验菌株为标准菌株,利用重组蛋白表达技术获得LasB蛋白,弹性蛋白刚果红法和荧光标记弹性蛋白法检测LasB酶活性。构建LasB诱导的THP-1巨噬细胞感染模型并使用槲皮素干预,CCK-8比色法检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态。TUNEL联合Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡。RT-qPCR和ELISA检测炎症细胞因子和环氧合酶水平。DCFH-DA荧光染色检测胞内ROS水平。采用单因素方差分析对实验数据进行统计学分析,多重比较采用Tukey检验。结果:成功获得相对分子质量33 000的纯度>90%的具有弹性蛋白水解活性的pLasB蛋白。pLasB(100 μg/ml)刺激下,THP-1巨噬细胞活力显著下降,细胞完整率明显降低,细胞凋亡率显著升高,炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α水平显著上调,细胞内ROS荧光强度和 COX-2 水平明显增加。而在2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L浓度槲皮素干预下,THP-1巨噬细胞活力明显改善,细胞凋亡率从18.32%±0.17%分别降低至13.17%±0.20%、11.43%±0.06%和7.74%±0.04%( F=1 679, P<0.05);促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α显著下调,抗炎细胞因子IL-10显著上调;细胞内ROS荧光强度( F=86.92, P<0.05)和 COX-2表达水平( F=24.62, P<0.05)均明显下降。结论:槲皮素能有效干预铜绿假单胞菌LasB诱导的THP-1巨噬细胞凋亡、炎症和氧化应激,可能作为铜绿假单胞菌的毒力抑制剂。

关键词：槲皮素巨噬细胞凋亡炎症氧化应激

五味子乙素预处理对过氧化氢诱导的H9c2细胞焦亡及TXNIP/NLRP3/Caspase-1通路的影响

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现代中西医结合杂志 2024年第13期33卷 1807-1812页

作者：王瑞婷赵松郝娜李立萍解丽君承德医学院中药研究所河北承德071000 河北医科大学基础医学院河北石家庄050017 河北省疾病预防控制中心药物研究所河北石家庄050021

目的基于硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)通路观察五味子乙素对过氧化氢(H 2O 2)诱导的大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤及焦亡的影响,探讨五味子乙素的心肌保护作用机制。... 详细信息

目的基于硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)通路观察五味子乙素对过氧化氢(H 2O 2)诱导的大鼠H9c2心肌细胞氧化损伤及焦亡的影响,探讨五味子乙素的心肌保护作用机制。方法体外培养H9c2心肌细胞,实验设4组:正常组细胞常规孵育,五味子乙素组细胞加入40μmol/L五味子乙素孵育24 h,H 2O 2组细胞加入1000μmol/L的H 2O 2孵育30 min,H 2O 2+五味子乙素组细胞加入40μmol/L五味子乙素孵育24 h后再加入H 2O 2孵育30 min。CCK-8法检测细胞活力,DCFH-DA探针检测细胞中活性氧(ROS)含量,试剂盒检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量和细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,Western blot法检测细胞中TXNIP、硫氧还蛋白(Trx)、NLRP3、裂解的半胱氨酸蛋白酶-1(Cleaved Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)-N蛋白表达情况,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量。结果与正常组比较,H 2O 2组细胞活力明显下降(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和TXNIP、NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白相对表达量及细胞培养上清中LDH、IL-1β、IL-18含量均明显升高(P均<0.05),细胞中SOD、GSH-Px含量和Trx蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05);与H 2O 2组比较,H 2O 2+五味子乙素组的细胞活力明显升高(P<0.05),细胞中ROS、MDA含量和TXNIP、NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白相对表达量及细胞培养上清中LDH、IL-1β、IL-18含量均明显降低(P均<0.05),细胞中SOD、GSH-Px含量和Trx蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。结论五味子乙素可能通过影响TXNIP/NLRP3/Caspase-1通路,从而减轻H 2O 2诱导的H9c2细胞氧化损伤,抑制心肌细胞焦亡。

关键词：五味子乙素 H9c2 氧化应激焦亡硫氧还蛋白互作蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3

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多交叉置换扩增结合纳米生物传感器检测伊氏李斯特菌的方法建立

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中国人兽共患病学报 2024年第7期40卷 605-612页

作者：李慧王毅王艳叶长芸山西医科大学汾阳学院病原生物学与检验教研室汾阳032200 首都儿科研究所实验中心北京100020 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206

目的应用多交叉置换扩增技术结合纳米生物传感器(multiple cross displacement amplification coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor,MCDA-LFB)建立一种快速、特异和灵敏的伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,***)检测方法,并对该方法进行评价。方法以***种特异性基因smcl为靶标设计引物,对引物进行最佳反应温度、灵敏度和特异性测试,并用模拟样本和实际样本进行评估。结果***-MCDA-LFB的最佳反应温度为64℃。在***和***菌种鉴定中,该方法特异性为100%。此外,***-MCDA-LFB在纯培养物和模拟污染粪便样本的灵敏度分别为10 fg/反应和6.8×10^(2) CFU/g。在195份野鼠粪便样本增菌培养物检测中,***-MCDA-LFB检测结果和传统培养法(ISO 11290-1)结果相同,且只需二次增菌液水煮模板即可检出。结论***-MCDA-LFB方法作为一种快速、灵敏和特异的诊断方法可应用于食品、医疗和科研领域。

关键词：伊氏李斯特菌多交叉置换扩增纳米生物传感器 smcl基因最低检测限

2023年河南省内脏利什曼病媒介白蛉分布与季节消长调查

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中国血吸虫病防治杂志 2024年第4期 346-351+398页

作者：贺志权王丹寇元静杨成运孙毅莹纪鹏慧蒋甜甜鲁德领钱丹张红卫刘颖河南省疾病预防控制中心河南省寄生虫病原与媒介医学重点实验室河南省洛阳市疾病预防控制中心河南省洛阳市媒介传染病病原学重点实验室

目的了解2023年河南省内脏利什曼病媒介白蛉地理分布及季节消长情况，为内脏利什曼病媒介控制提供科学依据。方法 2023年5—9月，选取河南省18个地级市的23个县（市、区）为白蛉监测点，采用人工法和诱蛉灯法捕捉白蛉。经形态学鉴定后... 详细信息

目的了解2023年河南省内脏利什曼病媒介白蛉地理分布及季节消长情况，为内脏利什曼病媒介控制提供科学依据。方法 2023年5—9月，选取河南省18个地级市的23个县（市、区）为白蛉监测点，采用人工法和诱蛉灯法捕捉白蛉。经形态学鉴定后，计算白蛉密度并分析不同月份、不同生境白蛉密度变化。结果 2023年5—9月，河南省累计于白蛉监测点布设诱蛉灯406台，捕获雌蛉3 137只，平均密度为7.73只（/灯·夜）。累计捕获中华白蛉1 494只，其中雌蛉1 222只，平均密度为3.01只（/灯·夜）。巩义市中华白蛉密度最高，为17.00只（/灯·夜）。人工法累计捕获白蛉5 544只，其中中华白蛉230只。中华白蛉密度呈单峰曲线分布，7月上旬达到峰值，为5.81只（/灯·夜）。各类生境中，以猪圈中中华白蛉密度最高，为4.50只（/灯·夜）。结论 2023年河南省中华白蛉主要分布于北部和中西部丘陵地区，白蛉密度呈单峰曲线分布；应有针对性地加强白蛉监测工作。

关键词：中华白蛉内脏利什曼病地理分布季节消长监测河南省

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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

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畜牧兽医学报 2024年

作者：董开恒黄书伦李凤娟李坤刘果张强包慧芳李洪炫卢曾军张小丽甘肃农业大学动物医学院动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院国家口蹄疫参考实验室中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省病原生物学基础学科研究中心

Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）仍然在我国周边国家存在，对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体，以此为工具，鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原，... 详细信息

Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）仍然在我国周边国家存在，对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体，以此为工具，鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原，通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞，通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列，分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒，将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达；通过间接ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）、病毒中和试验（VNT）验证抗体反应性和中和活性，利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示：获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体，其中PD3和PD7为中和抗体，两株中和抗体识别相同表位，关键氨基酸为VP2蛋白72位残基（D）。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体，鉴定VP2 72D是中和表位的关键氨基酸，进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息，为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 Asia1型猪源单克隆抗体抗原表位