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胎儿骨髓基质细胞与细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的研究

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中国实验血液学杂志 2005年第3期13卷 422-428页

作者：毛平王彩霞林秀梅杜庆华广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科

为了探讨胎儿骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增作用的影响及比较扩增前后脐血(CB)CD34+细胞上细胞表面趋化因子受体CXCR4和黏附分子CD49d+(VLA4)的表达情况,将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立... 详细信息

为了探讨胎儿骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增作用的影响及比较扩增前后脐血(CB)CD34+细胞上细胞表面趋化因子受体CXCR4和黏附分子CD49d+(VLA4)的表达情况,将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系,该体系分4组:A组为培养过程中不加细胞因子和基质细胞;B组为单用胚胎骨髓基质细胞支持;C组为单用细胞因子支持;D组为细胞因子和胚胎骨髓基质细胞联合支持。在0、6、10及14天检测细胞总数、CD34+细胞数及集落形成单位(CFU)数,同时检测CD34+细胞上CD49d+及CXCR4的表达数。结果表明:在体外14天培养过程中,各时间点D组CD34+细胞、CFU数及CD34+CXCR4+细胞和CD34+CD49d+细胞扩增数均高于A、B、C组(P<0.05);B、C和D组在各时间点各测量指标与A组比较具显著性差异(P<0.05);6天后,B组各测量指标与C组比较具显著性差异(P<0.05)。结论:胚胎骨髓基质细胞联合外源性细胞因子不仅可以支持脐血MNC的有效扩增,而且扩增后与趋化作用和与粘附作用相关的造血细胞亦较扩增前明显增加。单用细胞因子扩增会造成造血细胞的耗竭,单用基质细胞支持可扩增或维持造血细胞的量,但难以实现造血细胞的大量扩增,FBMSC联合外源性细胞因子可能是扩增造血干祖细胞的较理想方案。

关键词：胎儿骨髓基质细胞细胞因子单个核细胞脐血

RNA干扰对活化的小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

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中华医学杂志 2007年第30期87卷 2140-2143页

作者：谭兵李瑜元聂玉强杜艳蕾广州医学院附属广州市第一人民医院消化内科 510180

目的观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰 RNA(siRNA)在体外对小鼠巨噬细胞系 RAW264.7表达TNF-α的抑制作用。方法采用化学法合成针对 TNF-α mRNA 不同位点设计的3条 siRNA 序列(siRNA1～3)和1条带有荧光标记的 BLOCK-IT^... 详细信息

目的观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰 RNA(siRNA)在体外对小鼠巨噬细胞系 RAW264.7表达TNF-α的抑制作用。方法采用化学法合成针对 TNF-α mRNA 不同位点设计的3条 siRNA 序列(siRNA1～3)和1条带有荧光标记的 BLOCK-IT^(TM)荧光 Oligo(修饰的荧光标记的 dsRNA,siRNA4)通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞系 RAW264.7,同时设立1个无任何靶基因的 siRNA 作为阴性对照(siRNA4)。荧光显微镜下观察 siRNA 的转染效率;用实时荧光定量 PCR 和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测 siRNA 对 TNF-α的 mRNA 和蛋白表达的抑制作用。结果内毒素刺激后6 h,巨噬细胞表达TNF-α mRNA 和合成分泌的 TNF-α量均增加,于9～12 h 达高峰。利用荧光标记的 Oligo 观察到 siRNA 转染效率达72%～80%。siRNA1～4转染巨噬细胞后,siRNA2、3可见内毒素刺激的 TNF-α mRNA(0.158±0.030、0.114±0.028)和 TNF-α蛋白表达[(1355±348)pg/ml、(817±138)pg/ml]均明显少于未转染组[TNF-α mRNA 0.294±0.147,蛋白(2104±32)pg/ml,均 P<0.05],其中 siRNA3的抑制率非常显著,达61.2%(P<0.01)。阴性对照siRNA4对细胞基因及蛋白表达无影响。结论内毒素可刺激小鼠巨噬细胞 TNF-α的合成。化学合成 siRNA 转染小鼠巨噬细胞能有效抑制 TNF-α mRNA 及蛋白的表达。

关键词：巨噬细胞肿瘤坏死因子小干扰RNA

人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD/SCID小鼠重建多系造血

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中华器官移植杂志 2006年第4期27卷 231-234页

作者：毛平彭盘俐许力广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科 510180

目的探讨人脐血单个核细胞（MNC）体外扩增后植入能力的改变，以及对NOD／SCID小鼠造血重建的影响。方法采用不同细胞因子组合对人脐血MNC进行短期无血清培养扩增，比较扩增后的效果及细胞凋亡的变化；将扩增6d后的人脐血MNC植入经半致... 详细信息

目的探讨人脐血单个核细胞（MNC）体外扩增后植入能力的改变，以及对NOD／SCID小鼠造血重建的影响。方法采用不同细胞因子组合对人脐血MNC进行短期无血清培养扩增，比较扩增后的效果及细胞凋亡的变化；将扩增6d后的人脐血MNC植入经半致死剂量照射的NOD／SCID小鼠体内，观察小鼠6周后的存活率和造血重建情况。结果人脐血MNC在干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶受体3配基（FL）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素3（IL-3）细胞因子共同作用下，培养6～11）d获得最佳扩增效果，同时细胞表面膜联蛋白V（Annxin V）的表达明显减少；移植6周后有55．6％的小鼠存活，存活小鼠的骨髓、脾和胸腺细胞中均能检测出人类CD45、CD34、CD33、CD3和CDl9抗原，外周血提取的DNA可检测出人特异的Cart—Ⅰ基因和Alu基因。结论SCF＋FL＋IL-6＋IL-3细胞因子协同作用能有效扩增人脐血MNC，MNC扩增6d后可成功植入N（）D／SCID小鼠体内，并帮助小鼠重建多系造血。

关键词：脐血干细胞移植人类小鼠

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人骨髓基质细胞支持脐血单个核细胞体外扩增

中华器官移植杂志 2005年第10期26卷 616-618页

作者：王彩霞毛平林秀梅杜庆华广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科 510180

目的探讨人骨髓基质细胞(HBMSC)对脐血(CB)单个核细胞(MNC)体外扩增的支持作用及寻找最佳的收获时机。方法将从CB标本中分离出的MNC接种于已建立的无血清培养体系(含或不含HBMSC及细胞因子支持),在0、6、10及14d检测MNC数、CD34+细胞数... 详细信息

目的探讨人骨髓基质细胞(HBMSC)对脐血(CB)单个核细胞(MNC)体外扩增的支持作用及寻找最佳的收获时机。方法将从CB标本中分离出的MNC接种于已建立的无血清培养体系(含或不含HBMSC及细胞因子支持),在0、6、10及14d检测MNC数、CD34+细胞数及集落形成单位(CFU)数。结果在体外培养过程中,各时间点相同条件下,有HBMSC层支持组的各项测量指标均较其他组高(P<0.05),其中HBMSC联合外源性细胞因子组扩增效果最佳。体外培养6～10d时,以上各项指标基本上达到最高值。结论HBMSC联合外源性细胞因子能实现CB在体外的有效扩增,此体系可能是扩增造血干、祖细胞的较理想方案。体外培养6～10d是收获的最佳时间。

关键词：骨基质干细胞因子胎血脐血单个核细胞体外扩增人骨髓基质细胞外源性细胞因子集落形成单位 CD34^+ 体外培养最佳时间

急性髓系白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖分析

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中国实验血液学杂志 2009年第2期17卷 431-436页

作者：毛平罗畅如张玉平王彩霞许艳丽应逸杜庆华谢健晋广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科广东广州510180

本研究探讨AML患者在初发、治疗缓解后、复发等不同疾病状态下外周血T细胞TCRVβ亚家族表达及T细胞克隆性增殖的情况,分析不同白血病细胞负荷对患者外周血T淋巴细胞数量及功能,尤其是对抗白血病功能的影响。应用RT-PCR扩增11例AML白血... 详细信息

本研究探讨AML患者在初发、治疗缓解后、复发等不同疾病状态下外周血T细胞TCRVβ亚家族表达及T细胞克隆性增殖的情况,分析不同白血病细胞负荷对患者外周血T淋巴细胞数量及功能,尤其是对抗白血病功能的影响。应用RT-PCR扩增11例AML白血病患者不同疾病状态下及3名正常供者外周血的TCRBV24个家族的基因序列,通过基因扫描(genescan)的方法判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质,比较不同疾病状态下白血病患者外周血T细胞的Vβ亚家族的应用、克隆性增殖、T细胞的复杂性以及T细胞免疫表型的变化。结果表明:11例AML白血病患者初诊时外周血T细胞均表达部分TCRVβ亚家族,经体外诱导后TCRVβ亚家族表达增加;完全缓解期患者外周血T细胞TCRVβ亚家族数量明显增多,但未达到完全正常;4例患者在复发时TCRVβ亚家族表达数量明显下降;11例患者中有9例在初诊时外周血有1至2个TCRVβ亚家族T细胞克隆性增殖,缓解期克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞有增加趋势,在多数病例观察到部分Vβ亚家族T细胞在初发、缓解、体外诱导扩增以及复发时仍维持克隆性增殖状态;AML白血病患者初发及复发时T细胞CDR3复杂性明显降低,呈偏态分布,而疾病缓解时T细胞复杂性有所改善。结论:AML白血病患者外周血T细胞TCRVβ亚家族呈限制性表达;在大多数病例中无论是疾病初发抑或缓解及体外诱导、甚至在疾病复发时均可观察到克隆性T细胞的存在;在部分病例中某些Vβ亚家族在上述不同疾病状态下始终维持克隆性增殖状态,部分Vβ亚家族的克隆性增殖同白血病细胞的存在相关;在疾病状态下,AML白血病患者外周血T细胞的复杂性有所降低,而疾病缓解后可部分恢复。

关键词：急性髓系白血病 T淋巴细胞 Vβ亚家族克隆性增殖

小干扰RNA沉默巨噬细胞移动抑制因子基因对肝癌细胞p27表达的影响

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中华肝脏病杂志 2009年第2期17卷 102-106页

作者：夏金堂李雯伍兆锋赵杰王花李瑜元广州医学院附属广州市第一人民医院肝胆外科 510180 广州医学院附属广州市第一人民医院消化内科 510180 中山大学附属第一医院外科实验中心广州

目的观察巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和细胞周期调控因子p27在肝细胞癌中表达的相互关系，探讨小干扰RNA（siRNA）沉默MIF基因对肝癌细胞p27表达的影响。方法免疫组织化学法和荧光定量PCR法检测MIF、p27的蛋白和mRNA在肝癌及其癌旁组... 详细信息

目的观察巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和细胞周期调控因子p27在肝细胞癌中表达的相互关系，探讨小干扰RNA（siRNA）沉默MIF基因对肝癌细胞p27表达的影响。方法免疫组织化学法和荧光定量PCR法检测MIF、p27的蛋白和mRNA在肝癌及其癌旁组织中的表达情况。化学合成MIF siRNA和对照siRNA，脂质体法转染肝癌细胞PLC和Hep3B，荧光定量PCR法检测MIF和p27 mRNA在实验组及对照组中的表达情况。根据不同资料分别采用x。检验、Logistic回归分析或单因素方差分析。结果MIF蛋白及其mRNA在肝癌组织中过表达，在癌旁组织中低表达；p27蛋白及其mRNA在癌组织中低表达，在癌旁组织中高表达。Logistic回归分析提示MIF为肝癌发生的危险因素，p27为保护因素。MIF mRNA在肝癌细胞株中过表达（F=61．036，P〈0．01），p27 mRNA在正常肝细胞L02中高表达（F=529．853，P〈0．01）。经MIFsiRNA转染后，MIF mRNA在PLC及Hep3B中的表达水平降低，并且呈剂量依赖关系（F值分别为320．1和201．2，尸值均〈0．01）；p27 mRNA伴随MIFmRNA的降低而增加（F值分别为419．4和459．9，P值均〈0．01）。结论MIF在肝细胞癌中过表达，MIF siRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中的表达；MIF可能参与了p27基因表达的调控。

关键词：癌,肝细胞 RNA干扰周期素依赖激酶抑制剂p27 巨噬细胞移动抑制因子

基于毛细管液滴技术的血液乙型肝炎病毒DNA提取

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分析化学 2011年第5期39卷 670-674页

作者：梁广铁王秋平王维刘大渔周小棉广州医学院附属广州市第一人民医院检验科临床化学技术研究室

基于毛细管液滴技术,建立了提取血液中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法。方法的基本原理是向聚四氟乙烯毛细管中连续引入油相和水相溶液时,由于表面张力作用,可以形成稳定的油包水型液滴。依次引入含有不同试样的液滴,在毛细管中完成进样、... 详细信息

基于毛细管液滴技术,建立了提取血液中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法。方法的基本原理是向聚四氟乙烯毛细管中连续引入油相和水相溶液时,由于表面张力作用,可以形成稳定的油包水型液滴。依次引入含有不同试样的液滴,在毛细管中完成进样、DNA结合、洗涤以及洗脱等过程。实验表明,采用蛋白酶K裂解和提高洗脱温度有利于提高DNA回收率。优化后的血清HBV DNA提取操作在25 min内完成,回收率大于60%。本方法的DNA提取量与常规方法相当,而相对标准偏差较大(23.3%vs 12.9%)。本方法具有简单、快速和低成本的优势,有望成为一种微全核酸分析系统样品前处理的有效解决方案。

关键词：微全核酸分析系统 DNA提取液滴毛细管乙型肝炎病毒

来源：博看期刊

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133^+细胞体外扩增作用的研究

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中国实验血液学杂志 2007年第2期15卷 319-323页

作者：毛平曾进龙王彩霞杜庆华广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科广州510180

为了探讨胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)中CD133+细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血(CB)中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组:C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质... 详细信息

为了探讨胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)中CD133+细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血(CB)中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组:C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133+细胞数及集落形成单位(CFU)数。结果表明:各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133+细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论:胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。

关键词：骨髓基质细胞造血干细胞细胞扩增 CD133^+细胞脐血细胞因子

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无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究

中国实验血液学杂志 2004年第2期12卷 133-137页

作者：莫文健毛平何秋山应逸朱志刚许艳丽杜庆华广州医学院附属广州市第一人民医院血液内科广州510180

脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是一大难题 ,目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关 ,而将部分脐血进行巨核系祖细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径 ,但适用于临床应用... 详细信息

脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是一大难题 ,目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关 ,而将部分脐血进行巨核系祖细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径 ,但适用于临床应用的扩增条件至今仍未确立。本课题采用人脐血单个核细胞 (MNC)在无血清培养体系中使用TPO ,IL 3,SCF ,IL 6等细胞因子进行不同的组合 ,在培养的 0 ,6 ,10 ,14天进行MNC、CD4 1+细胞及CFU MK数的检测 ,以寻找最佳的细胞因子组合及最佳的收获时机。结果表明 :无血清条件下TPO与IL 3,SCF ,IL 6等细胞因子联用可实现脐血巨核系祖细胞有效的体外扩增 ,各因子组中以TPO +IL 3+SCF +IL 6组扩增效果为最佳 ,其CFU MK数于第 10天最多 ,扩增达 6 .8倍 ,CD4 1+细胞扩增达 8.8倍。结论 :在人脐血MNC无血清培养条件下 ,TPO +IL 3+SCF +IL 6组为巨核系祖细胞体外扩增较佳的因子组合。由于TPO +IL 3+SCF +IL 6组的CFU MK数于第 10天最多 ,CD4 1+细胞数亦为同期最高 ,故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第

关键词：脐血巨核系祖细胞无血清培养血小板巨核细胞