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尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

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南方农业学报 2022年第12期53卷 3548-3557页

作者：翁婷婷夏立群黄瑜广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院/广东省水生动物健康评估工程技术研究中心广东深圳518120

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因(ifi44)在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因... 详细信息

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因(ifi44)在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框(ORF),通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后的时序表达情况。【结果】On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为52.7 kD,理论等电点(pI)为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域(1~157 aa)和1个GTP-bd结构域(197~322 aa),不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%;基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支,二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达,且主要在T细胞亚群表达;经无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后,On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化,且存在明显的时间依赖性。【结论】On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域,进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能;On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后呈时间依赖性上调表达,表明ifi44基因作为重要的调节因子,参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。

关键词：尼罗罗非鱼 ifi44基因组织表达特征免疫应答无乳链球菌聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]

马氏珠母贝Caspase-3基因克隆和组织表达分析

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基因组学与应用生物学 2021年第3期40卷 970-979页

作者：房晓宸卢金昭梁海鹰何军军申铖皓广东海洋大学深圳研究院深圳518108 广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水生动物健康评估工程技术研究中心深圳518108 广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心湛江524025

半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)作为细胞凋亡通路中重要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。为初步探究马氏珠母贝Caspase-3(PmCaspase-3)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmCaspase-3基因cDNA的全长... 详细信息

半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)作为细胞凋亡通路中重要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。为初步探究马氏珠母贝Caspase-3(PmCaspase-3)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmCaspase-3基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析了PmCaspase-3基因mRNA在马氏珠母贝不同组织和不同发育时期的表达差异。结果显示,PmCaspase-3基因cDNA全长为2233 bp,其中5'端非编码区长度为80 bp,3'端非编码长度为31 bp,开放阅读框长度为2088 bp,共编码695个氨基酸;生物信息学分析显示,PmCaspase-3含有Caspase家族特有的CASc结构域和半胱氨酸蛋白酶家族p20、p10活性位点以及多种磷酸化位点,经进化分析以及多序列比对可知与其他物种Caspase-3蛋白同源性较高。RT-qPCR结果表明,PmCaspase-3在肝胰腺中的表达量最高,在闭壳肌中的表达量最低;在发育过程中D型幼虫期和眼点期的表达量较高。

关键词：马氏珠母贝 Caspase-3 基因克隆实时荧光定量PCR

重组酶介导等温扩增技术检测鰤鱼诺卡氏菌方法的建立

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大连海洋大学学报 2023年第1期38卷 104-111页

作者：杨惠源陈国权温依铭夏洪丽夏立群广东海洋大学水产学院广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院广东省水生动物健康评估工程技术研究中心深圳海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台广东深圳518120

为建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)的快速检测鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的方法,针对鰤鱼诺卡氏菌的特异性基因组片段,设计重组酶介导扩增引物,通过检测7株鰤鱼诺卡氏菌近缘菌和9种水... 详细信息

为建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)的快速检测鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的方法,针对鰤鱼诺卡氏菌的特异性基因组片段,设计重组酶介导扩增引物,通过检测7株鰤鱼诺卡氏菌近缘菌和9种水产养殖过程中常见病原菌,筛选出特异性RAA检测引物,并通过将含有目的片段的重组质粒进行梯度稀释以分析该检测方法的灵敏度,最后采用RAA方法检测患病鱼、健康鱼及11种不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株,以评价该检测方法的应用性和覆盖度。结果表明:本研究中设计的引物仅针对鰤鱼诺卡氏菌可以扩增出目的条带,检测灵敏度为100 pg/μL,人工感染鰤鱼诺卡氏菌的杂交鳢(Channa maculate♀×C.argus♂)肝脏、体肾和脾脏等组织基因组DNA能够扩增出阳性条带,不同来源的鰤鱼诺卡氏菌菌株可以扩增出阳性条带。研究表明,本研究中所建立的鰤鱼诺卡氏菌重组酶介导等温检测方法具有准确、简便的特点,可对鰤鱼诺卡氏菌进行快速检测。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌重组酶介导等温扩增(RAA) 快速检测

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马氏珠母贝NatF基因克隆及其表达分析

南方农业学报 2021年第11期52卷 3085-3092页

作者：卢金昭房晓宸梁海鹰何军军申铖皓广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院广东深圳518108 广东省水生动物健康评估工程技术研究中心广东深圳518108

【目的】掌握马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Nα-乙酰转移酶60基因(PmNatF)在不同组织、不同发育时期及不同病原相关分子模式(PAMPs)刺激下的表达变化规律,为后续研究NatF基因功能及揭示其在刺激应答中的分子机制提供理论依据... 详细信息

【目的】掌握马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Nα-乙酰转移酶60基因(PmNatF)在不同组织、不同发育时期及不同病原相关分子模式(PAMPs)刺激下的表达变化规律,为后续研究NatF基因功能及揭示其在刺激应答中的分子机制提供理论依据。【方法】运用RACE克隆PmNatF基因cDNA序列,通过ProtScale、ProtParam、PSITE-Search、SignalP 4.1、SMART及Cell-PLoc 2.0 Package等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测PmNatF基因组织表达分布特征及其在不同发育时期和PAMPs刺激后的表达情况。【结果】PmNatF基因cDNA序列全长1142 bp,其开放阅读框(ORF)为693 bp,5'端非编码区(5'-UTR)为181 bp,3'端非编码区(3'-UTR)为268 bp,共编码230个氨基酸残基。PmNatF蛋白分子量约26.64 kD,理论等电点(pI)为8.54,总平均亲水性系数为-0.068,为不稳定的亲水蛋白;PmNatF蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,包含有N-乙酰转移酶结构域(Acetyltransf_1 domain),其亚细胞定位于细胞质。PmNatF蛋白二级结构中,α-螺旋占36.52%,β-转角占6.96%,延伸链占22.91%,无规则卷曲占33.91%;其三维结构与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的NatF蛋白结构相似。PmNatF氨基酸序列与其他物种的NatF氨基酸序列高度同源,其中与美洲牡蛎(C.virginica)和欧洲大扇贝(Pecten maximus)的NatF氨基酸序列相似性较高,分别为76.52%和75.22%。PmNatF基因在马氏珠母贝各组织中均有表达,以在性腺中的相对表达量最高;在不同发育时期也均有PmNatF基因表达,其相对表达量以卵的最高,担轮幼虫的最低。在脂多糖(LPS)刺激下,马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达呈上调趋势,于刺激24 h时达最高值;在肽聚糖(PGN)刺激下,至刺激6 h时出现明显的峰值;在聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激下,则在刺激72 h时出现峰值。【结论】PmNatF基因具有较高的保守性,在马氏珠母贝各组织及不同发育时期均有表达,尤其以性腺和卵的相对表达量最高,且经PAMPs刺激后在马氏珠母贝鳃组织中呈明显的差异表达,表明PmNatF基因可能参与马氏珠母贝生殖细胞的分裂和成熟及其免疫应答过程。

关键词：马氏珠母贝 NatF基因性腺卵 PAMPs刺激表达特征

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大口黑鲈肠道益生菌的分离与鉴定

广东海洋大学学报 2023年第4期43卷 62-68页

作者：赵浩航康旭黄子威温依铭汪志文喻大鹏甘桢夏洪丽夏立群鲁义善广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院/广东省水生动物健康评估工程技术研究中心/深圳市海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台广东深圳518120

【目的】分离鉴定大口黑鲈(Micropterus salmoides)肠道益生菌,评估分离菌用作饲料添加剂的益生潜力。【方法】采集大口黑鲈肠道样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA序列比对和生化试验鉴定种属,并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活... 详细信息

【目的】分离鉴定大口黑鲈(Micropterus salmoides)肠道益生菌,评估分离菌用作饲料添加剂的益生潜力。【方法】采集大口黑鲈肠道样本,采用稀释涂布法分离细菌,经16S rRNA序列比对和生化试验鉴定种属,并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活性和药敏特性等鉴定。【结果】从大口黑鲈肠道分离菌株84株,经测序、blast比对,筛选出3株同源性最高的菌株MS-1、MS-2、MS-3,分别鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。3株分离菌均为γ-溶血,不具有生物膜,疏水性50%~93.3%,自凝集性43.6%~69.2%;可在pH 2.0~12.0环境和5.0 g/L胆盐中存活;经高温处理后仍可生长;3株菌对大多数抗生素敏感。【结论】芽孢杆菌MS-1、MS-2和MS-3抗逆性高,黏附性能及饲料学安全性高,可作为大口黑鲈养殖中潜在益生菌。

关键词：大口黑鲈肠道微生物益生菌分离与鉴定芽孢杆菌

克氏原螯虾一种新型甲壳素基因的鉴定和抑菌功能研究

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水生生物学报 2022年第2期46卷 248-256页

作者：焦厚琪霍诗天闫黎明李艳和刘学芹华中农业大学水产学院武汉430070 湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心武汉430070

抗菌肽是无脊椎动物非特异性免疫系统中重要的免疫因子,抗菌肽具有良好且广谱的抗菌活性,并且不易产生耐药性,有望替代传统抗生素药物发挥功能。甲壳素(Crustin)是目前甲壳类动物中研究比较广泛的一类抗菌肽家族。研究鉴定了来自克氏原... 详细信息

抗菌肽是无脊椎动物非特异性免疫系统中重要的免疫因子,抗菌肽具有良好且广谱的抗菌活性,并且不易产生耐药性,有望替代传统抗生素药物发挥功能。甲壳素(Crustin)是目前甲壳类动物中研究比较广泛的一类抗菌肽家族。研究鉴定了来自克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的一种新型Crustin基因,命名为Pc-CruL。通过Pc-CruL抵抗病原性细菌的免疫防御反应的初步探究,发现Pc-CruL对克氏原螯虾的天然免疫系统至关重要,为深入研究克氏原螯虾奠定了一定的基础,在克氏原螯虾的人工养殖过程中的疾病的预防和治疗中具有一定的指导意义且提供了一定的理论基础。Pc-CruL包含330 bp,编码109个氨基酸,与已知的克氏原螯虾甲壳素同源性较低,为Ⅰ型甲壳素蛋白家族新成员。Pc-CruL在健康的克氏原螯虾的血淋巴、鳃、肠道、胃、心和肝胰腺中均存在,在血淋巴中的含量最高,而在肝胰腺中含量最低。同时进行了体外抑菌实验,结果表明Pc-CruL重组蛋白显著地抑制了几种常见的病原性细菌的生长,具有良好的广谱抑菌活性。体内实验表明,对健康的克氏原螯虾注射Pc-CruL重组蛋白可以保护克氏原螯虾,在副溶血弧菌感染后,提高存活率。Pc-CruL是克氏原螯虾中关键的免疫因子,在克氏原螯虾抵抗外界病原菌入侵和感染过程中起着重要的作用。

关键词：克氏原螯虾抗菌肽先天免疫甲壳素副溶血弧菌

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罗非鱼TRAF3基因的表达及功能研究

水生生物学报 2023年第2期47卷 308-315页

作者：夏洪丽汪志文黎源陈文捷龙梦喻大鹏程俊夏立群鲁义善广东海洋大学深圳研究院广东省水生动物健康评估工程技术研究中心深圳海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台深圳518120 广东海洋大学水产学院广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室湛江524088 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室武汉430000

肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子3(TRAF3)是多种免疫途径中的关键调控因子。从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中克隆获得了TRAF3基因,命名为OnTRAF3(GeneBank No.MN258118),该基因包含1个环指结构域、1个锌指结构域、1个卷曲螺旋和M... 详细信息

肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子3(TRAF3)是多种免疫途径中的关键调控因子。从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中克隆获得了TRAF3基因,命名为OnTRAF3(GeneBank No.MN258118),该基因包含1个环指结构域、1个锌指结构域、1个卷曲螺旋和MATH结构域。多序列比对表明,OnTRAF3与其他已知的TRAF3蛋白具有高度的相似性,尤其是MATH结构域。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,OnTRAF3在各组织中广泛分布,且在脑、皮肤、肠和鳃中表达量较高。在无乳链球菌诱导后,多个组织中的OnTRAF3表达量出现了不同程度的上调,说明OnTRAF3参与了罗非鱼的抗菌免疫应答。亚细胞定位实验显示,OnTRAF3分布在HEK293的细胞质和细胞核中。此外,荧光素酶报告基因实验结果显示,野生型(WT)OnTRAF3可显著激活NF-κB信号,而coiled-coil和MATH结构域缺失后,依然能够显著激活NF-κB活性,而RING和Zinc缺失后,该激活作用则明显减弱,表明RING和Zinc结构域是OnTRAF3在免疫信号通路中行使功能的关键结构域。研究为探索TRAF3在罗非鱼免疫应答中的功能提供了重要的基础。

关键词： TRAF3 免疫反应 NF-κB信号尼罗罗非鱼

深圳红树林沉积物可培养细菌多样性及其生物活性筛选

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广东海洋大学学报 2022年第6期42卷 88-96页

作者：龙梦樊慧敏夏洪丽汪志文喻大鹏夏立群鲁义善广东海洋大学深圳研究院/广东省水生动物健康评估工程技术研究中心/深圳市海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台广东深圳518120 广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088

【目的】研究广东深圳红树林沉积物可培养细菌多样性,筛选潜在生物活性菌株及水产病原菌拮抗菌。【方法】采用稀释涂布法分离纯化深圳红树林沉积物中可培养细菌,基于16S rRNA序列分析细菌物种多样性,通过PCR扩增聚酮合酶基因、非核糖体... 详细信息

【目的】研究广东深圳红树林沉积物可培养细菌多样性,筛选潜在生物活性菌株及水产病原菌拮抗菌。【方法】采用稀释涂布法分离纯化深圳红树林沉积物中可培养细菌,基于16S rRNA序列分析细菌物种多样性,通过PCR扩增聚酮合酶基因、非核糖体肽合成酶基因检测菌株产次级代谢产物潜力,并采用点种法筛选水产病原菌拮抗菌。【结果】获得177株细菌,隶属于4门20属27种,芽孢杆菌属(Bacillus)是优势菌属,6株细菌为潜在新物种,55株细菌的基因组DNA扩增出至少1种生物合成基因,其中有7株细菌对水产病原菌有拮抗活性。【结论】深圳红树林沉积物可培养细菌资源丰富,有应用于活性次级代谢产物发掘和水产病害绿色防控的巨大潜力。

关键词：红树林沉积物细菌多样性拮抗活性水产病原菌生物合成基因

尼罗罗非鱼marco基因克隆、亚细胞定位及表达分析

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广东海洋大学学报 2022年第5期42卷 27-37页

作者：杨观健汪志文黎源李炳喜鲁义善广东海洋大学水产学院广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室广东湛江524088 广东海洋大学深圳研究院广东省水生动物健康评估工程技术研究中心深圳市海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台广东深圳518120

【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)胶原样结构巨噬细胞受体(macrophage receptor with collagenous structure,Marco)的结构特征和免疫功能,为揭示尼罗罗非鱼免疫应答机制提供理论基础。【方法】采用聚合酶链式反应从尼罗... 详细信息

【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)胶原样结构巨噬细胞受体(macrophage receptor with collagenous structure,Marco)的结构特征和免疫功能,为揭示尼罗罗非鱼免疫应答机制提供理论基础。【方法】采用聚合酶链式反应从尼罗罗非鱼脾脏克隆marco基因序列,利用生物信息学和亚细胞定位等手段分析其结构特征,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其表达情况。【结果】尼罗罗非鱼marco基因(Onmarco)的开放阅读框(open reading frame,ORF)长1071 bp,共编码356个氨基酸,具有跨膜结构域、典型的胶原样结构域和C端富半胱氨酸受体(scavenger receptor cystein-rich,SRCR)结构域;多序列比对和系统进化分析表明,Marco在硬骨鱼类中具有较高的保守性;亚细胞定位显示,尼罗罗非鱼Marco(OnMarco)在HEK-293T细胞中为全细胞分布,主要在细胞膜上表达;qRT-PCR结果显示,Onmarco在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,但在血液中的表达量最高;经灭活的无乳链球菌和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,Onmarco在罗非鱼肠道、头肾和脾脏中的表达量均呈时序性变化;用脂多糖(LPS)、Poly I:C和灭活后的无乳链球菌刺激罗非鱼头肾白细胞,Onmarco表达量均显著升高。【结论】Onmarco基因可能在鱼体抵御细菌和病毒入侵的免疫反应中发挥重要作用。

关键词：尼罗罗非鱼 marco 无乳链球菌清道夫受体亚细胞定位表达分析