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谷氨酸棒杆菌3-磷酸甘油酸脱氢酶的定向进化改造研究

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食品与发酵工业 2024年

作者：黄新燕孙慕娇杜穆花潘越张心语张瑶函徐宁刘君鞠建松魏亮中国科学院天津工业生物技术研究所天津科技大学食品科学与工程学院天津科技大学生物工程学院河北师范大学生命科学学院

3-磷酸甘油酸脱氢酶（3-phosphoglycerate dehydrogenase， PGDH）是L-丝氨酸生物合成途径的限速酶，是影响L-丝氨酸高效合成的关键。该研究以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的PGDH为研究对象，通过对其酶学性质进行... 详细信息

3-磷酸甘油酸脱氢酶（3-phosphoglycerate dehydrogenase， PGDH）是L-丝氨酸生物合成途径的限速酶，是影响L-丝氨酸高效合成的关键。该研究以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的PGDH为研究对象，通过对其酶学性质进行测试分析发现，Cg-PGDH的酶活性仅为1.98 U/mg，而且热稳定性较差，严重制约了L-丝氨酸的高效生物合成。针对这一关键问题，该研究采用定向进化和高通量筛选的方法对Cg-PGDH进行改造，提高酶的催化活性和热稳定性。通过多轮筛选，最终获得了5个催化活性显著提升的突变体，P85Q、D365Y、A389T、A183V、I231V。其中，突变体P85Q的酶活性提升了2.55倍，并显著提高了酶的温度稳定性，最适催化温度达到60℃。随后该研究对P85Q、D365Y、A389T、A183V、I231V等5个突变体的突变位点进行组合突变，获得了温度稳定性进一步提高的突变体P85Q-D365Y。通过对Cg-PGDH突变位点的三维结构解析和分子动力学模拟实验发现，尽管突变体P85Q与D365Y的突变位点不位于Cg-PGDH催化活性中心，但是可通过蛋白结构形变增强Cg-PGDH活性中心130-140区间loop的稳定性，从而增加了酶的底物亲和性和催化活性。相关研究成果为进一步解析PGDH催化机制，提高PGDH催化活性提供了重要的研究基础和方向。

关键词：谷氨酸棒杆菌 3-磷酸甘油酸脱氢酶定向进化和高通量筛选温度稳定性分子动力学模拟

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Fe^(2+)螯合剂对羟脯氨酸发酵的影响

食品与发酵工业 2024年第9期50卷 50-55页

作者：龚雨李长庚李旭徐庆阳天津科技大学生物工程学院天津300457 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

为解决反式-4-羟基脯氨酸发酵过程中Fe^(2+)供应不足、产酸效率低等问题。该研究以大肠杆菌HYP-08为供试菌株,首先通过单因素实验探究Fe^(2+)螯合剂种类及添加量对羟脯氨酸发酵生产的影响,并通过5 L发酵放大验证,以羟脯氨酸产量、生物量... 详细信息

为解决反式-4-羟基脯氨酸发酵过程中Fe^(2+)供应不足、产酸效率低等问题。该研究以大肠杆菌HYP-08为供试菌株,首先通过单因素实验探究Fe^(2+)螯合剂种类及添加量对羟脯氨酸发酵生产的影响,并通过5 L发酵放大验证,以羟脯氨酸产量、生物量,糖酸转化率为指标,进一步探究其在放大过程中的影响,结果表明葡萄糖酸亚铁对羟脯氨酸发酵效果最好,流加发酵生产中,最终确定了10 h开始持连续流加的补料方式,反式-4-羟基脯氨酸生物量及产量达到最高,分别为146.2、118.6 g/L,较优化前提高了12.1%和4.2%,副产物乙酸减少到1.05 g/L,葡萄糖酸亚铁的添加有效增强了菌体活力,提高了羟脯氨酸的产量和糖酸转化率,为微生物发酵生产羟脯氨酸提供了依据。

关键词： Fe^(2+)螯合剂羟脯氨酸连续流加大肠杆菌葡萄糖酸亚铁

不同香型大曲微生态结构及其发酵特性相关性分析

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食品科学 2024年第13期45卷 104-114页

作者：徐锦冯文聪朱澳迪李良董孝元常煦陈茂彬方尚玲工业发酵省部共建协同创新中心发酵工程教育部重点实验室工业微生物湖北省重点实验室湖北工业大学生物工程与食品学院湖北武汉430068 黄鹤楼酒业有限公司湖北武汉430050 湖北安琪酵母股份有限公司湖北宜昌443000

以清香型、浓香型和酱香型白酒大曲为研究对象,采用理化分析、顶空固相微萃取气相色谱-质谱检测和高通量测序技术,探究不同香型大曲微生态与理化指标和酒质特征风味化合物的潜在关系。结果表明,清香大曲的糖化力和发酵力最高,浓香型大... 详细信息

以清香型、浓香型和酱香型白酒大曲为研究对象,采用理化分析、顶空固相微萃取气相色谱-质谱检测和高通量测序技术,探究不同香型大曲微生态与理化指标和酒质特征风味化合物的潜在关系。结果表明,清香大曲的糖化力和发酵力最高,浓香型大曲的酯化力和淀粉含量最高,酱香型大曲的酸度最高。3种香型大曲优势细菌属包括乳酸杆菌属(Saccharopolyspora)、魏斯氏菌属(Weissella)、芽孢杆菌属(Bacillus);优势真菌属包括复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、曲霉属(Aspergillus)、嗜热霉菌属(Thermomyces)。相关性分析表明,芽孢杆菌属与糖化力、液化力、发酵力、癸酸乙酯、苯乙醇呈正相关;嗜热霉菌属与己酸乙酯、异戊醇、乳酸乙酯、乙酸、川芎嗪呈正相关。

关键词：不同香型大曲理化指标特征风味化合物微生物群落相关性分析

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纸基打包带的制备及其性能研究

中国造纸 2024年第7期43卷 141-148页

作者：杨博文刘忠杨维红刘晓岚赵志强天津科技大学轻工科学与工程学院中国轻工业造纸与生物质精炼重点实验室天津市制浆造纸重点实验室

本研究以本色针叶木浆为原料，通过浆内添加湿强剂聚酰胺环氧氯丙烷（PAE）、烷基烯酮二聚体（AKD）、阳离子淀粉以及70℃水溶性聚乙烯醇（PVA）纤维的方法，提高纸基打包带的相关强度性能，在最适打浆度（30°SR）下制备定量为120 g/m... 详细信息

本研究以本色针叶木浆为原料，通过浆内添加湿强剂聚酰胺环氧氯丙烷（PAE）、烷基烯酮二聚体（AKD）、阳离子淀粉以及70℃水溶性聚乙烯醇（PVA）纤维的方法，提高纸基打包带的相关强度性能，在最适打浆度（30°SR）下制备定量为120 g/m2的纸基打包带，然后利用免扣热熔打包机对纸基打包带进行热封黏合实验；探究了干燥温度、造纸助剂添加量以及70℃水溶性PVA纤维对纸基打包带物理性能、热封温度、热封时间及热封强度的影响。结果表明，当干燥温度95℃，湿强剂PAE添加量2%，施胶剂AKD添加量0.3%，阳离子淀粉添加量1.2%,70℃水溶性PVA纤维添加量15%，热封温度165℃，热封时间6 s时，纸基打包带的干抗张指数达90.3 N·m/g，湿抗张指数达26.3 N·m/g，撕裂指数达19.6 mN·m2/g，耐破指数达6.45 kPa·m2/g，热封处的抗张指数，高达99.2 N·m/g。

关键词：纸基打包带水溶性PVA纤维热封性本色针叶木浆

高通量构建与筛选信号肽库提高枯草芽孢杆菌外源蛋白的表达分泌

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微生物学报 2024年第8期64卷 3059-3072页

作者：李昊霓李颖于思礼涂然花尔并刘扬王猛天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

【目的】基于信号肽在分泌表达系统中的重要作用,利用自动化高通量设备,搭建枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)酶蛋白信号肽库的高通量自动化构建与筛选平台,探索枯草芽孢杆菌中不同信号肽对酶蛋白的表达分泌作用。【方法】首先以大肠杆... 详细信息

【目的】基于信号肽在分泌表达系统中的重要作用,利用自动化高通量设备,搭建枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)酶蛋白信号肽库的高通量自动化构建与筛选平台,探索枯草芽孢杆菌中不同信号肽对酶蛋白的表达分泌作用。【方法】首先以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHP13以及pMA5为骨架,将编码毒性蛋白的ccdB基因插入大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体的启动子和目标基因之间,构建针对绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)以及普鲁兰酶(pullulanase,PulA)的信号肽筛选载体。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板,扩增173条信号肽序列,基于高通量自动化设备搭建枯草芽孢杆菌外源蛋白表达及活性筛选平台,构建含有不同信号肽的外源蛋白重组菌株,筛选并考察不同信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。【结果】RpmG、AspB、CitH、LytF和YkwD这5个信号肽具有较强的引导GFP胞外蛋白分泌能力,其中RpmG引导GFP胞外分泌能力最强,其重组菌株与对照菌株相比胞外GFP的荧光值提高了236%。针对PulA的信号肽筛选,其中41个信号肽与PulA的适配性很低,2个信号肽RpmG、AspB引导PulA胞外分泌的能力较强。含AspB信号肽的PulA重组菌株分泌率可达到74%,与对照菌株相比分泌率提高了68%;RpmG信号肽引导的PulA酶活与其他信号肽相比最高,总酶活可达116 U/mL,细胞外酶活为52 U/mL。【结论】本研究建立了枯草芽孢杆菌酶蛋白信号肽库的高通量自动化构建与筛选平台,分别获得可以提高GFP和PulA表达分泌的信号肽。该自动化平台允许大量样品的并行处理,这简化了纯手工的重复性实验工作,并且我们发现高通量实验平台不论在时间和成本方面都优于手工操作。自动化高通量平台的优势将随着样本量的增加而更加显著。综上所述,我们建立的自动化高通量筛选平台不仅可以加速外源蛋白的信号肽筛选优化过程,也为其他高附加值蛋白酶的工业菌种改造提升和迭代提供新的技术支撑。

关键词：枯草芽孢杆菌信号肽外源蛋白分泌自动化高通量筛选

2'⁃岩藻糖基乳糖功能及其微生物生产菌种构建研究进展

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食品研究与开发 2024年第8期45卷 207-216页

作者：刘琳赵藤高俊哲李俊众孙雪宗剑飞刘逸寒李玉李庆刚天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室/天津市工业微生物重点实验室/工业酶国家工程实验室天津300457 山东合成远景生物科技有限公司山东潍坊262500

2'⁃岩藻糖基乳糖(2'⁃fucosyllactose,2'⁃FL)在人乳寡糖中含量最高,占比可达30%。2'⁃FL能够有效促进婴儿大脑发育、提高婴儿免疫力,对青少年、成年人、老年人也大有裨益,已被广泛应用于婴幼儿配方奶粉、功能性食品饮料及医疗辅剂中。微... 详细信息

2'⁃岩藻糖基乳糖(2'⁃fucosyllactose,2'⁃FL)在人乳寡糖中含量最高,占比可达30%。2'⁃FL能够有效促进婴儿大脑发育、提高婴儿免疫力,对青少年、成年人、老年人也大有裨益,已被广泛应用于婴幼儿配方奶粉、功能性食品饮料及医疗辅剂中。微生物合成2'⁃FL具有易实现大规模生产、可使用廉价原料作为底物等优势。目前2'⁃FL最主要的工业生产菌种为大肠杆菌,其他食品安全级菌株如酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等也陆续被改造用来生产2'⁃FL,并已取得一定成效。该文对2'⁃FL作用于人体的机制、应用领域及2'⁃FL合成菌种构建现状等进行综述,并对未来发展趋势进行展望。

关键词： 2'⁃岩藻糖基乳糖人乳寡糖代谢工程工业微生物菌种构建

体外重构STUB1介导α-1抗胰蛋白酶突变体Z蛋白泛素化修饰反应体系

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生物工程学报 2024年第2期40卷 517-528页

作者：凌雪代艳叶晓张肖雅林佳雨饶朗田朝光中国科学技术大学生命科学与医学部安徽合肥230026 中国科学院天津工业生物技术研究所国家合成生物技术创新中心低碳合成工程生物学重点实验室天津300308 天津科技大学生物工程学院天津300457

α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein,ATZ)是引发α-1抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency,AATD)的主要原因,研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义。STUB1是一种重要的E3泛素... 详细信息

α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein,ATZ)是引发α-1抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency,AATD)的主要原因,研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义。STUB1是一种重要的E3泛素连接酶,参与调节多种蛋白质的泛素化修饰。然而,STUB1是否参与ATZ的泛素化修饰尚未明确。本研究首先将ATZ和STUB1的编码基因克隆到pET28a质粒,构建了这2个蛋白的表达质粒。随后,将重组质粒转入大肠杆菌表达系统,在优化诱导条件实现了重组蛋白的异源表达。通过金属螯合亲和层析技术纯化得到目的蛋白,并通过蛋白质谱分析验证了其氨基酸序列的准确性。利用纯化的ATZ和STUB1重组蛋白,构建了一个体外泛素化修饰反应体系。实验结果显示,在ATP、E1泛素激活酶和E2泛素结合酶的协同作用下,STUB1成功催化了ATZ的泛素化修饰。本研究提供了一种体外获得Z型突变体ATZ纯化蛋白的方法,并确认了STUB1介导ATZ的泛素化修饰功能,推进了对α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白在细胞内降解过程的调控机制的理解。

关键词： α-1抗胰蛋白酶泛素化 E3泛素连接酶蛋白纯化蛋白酶体

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城市污水处理过程污泥膨胀识别与抑制综述

控制理论与应用 2024年第5期41卷 798-807页

作者：潘红光张莹婷折洋洋杨勇西安科技大学电气与控制工程学院陕西西安710054 工业物联网与网络化控制教育部重点实验室重庆400065

污泥膨胀是活性污泥法污水处理过程中常见的一类异常工况,且具有严重危害性,研究污泥膨胀的识别和抑制方法对城市污水处理过程正常运行意义重大.本文主要针对城市污水处理过程中污泥膨胀的识别和抑制方法进行综述.首先,文章概述了城市... 详细信息

污泥膨胀是活性污泥法污水处理过程中常见的一类异常工况,且具有严重危害性,研究污泥膨胀的识别和抑制方法对城市污水处理过程正常运行意义重大.本文主要针对城市污水处理过程中污泥膨胀的识别和抑制方法进行综述.首先,文章概述了城市污水处理过程,介绍了污泥膨胀的概念、主要特点、类型和成因;其次,概述了基于微生物生理特征、机理模型、图像识别和数据驱动的污泥膨胀识别方法,分析其发展现状并指出优缺点;然后,概述了基于过程调控和机理特征的污泥膨胀抑制方法,分析其发展现状并对比优缺点;最后,总结全文,指出了城市污水处理过程污泥膨胀识别和抑制面临的主要问题,并对其研究趋势进行了展望.

关键词：污泥膨胀活性污泥法城市污水处理过程识别抑制

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一种新TG酶的发掘、纯化、酶学性质测定及重组表达

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微生物学通报 2024年

作者：杨科科李子龙修涵李国莹秦慧民王为善天津科技大学生物工程学院中国科学院微生物研究所江苏一鸣生物股份有限公司

【背景】谷氨酰胺转氨酶 (Transglutaminase EC 2.***.2.13) 简称TG酶，能够催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基基团与赖氨酸残基的ε-氨基基团之间交联，形成异性肽键，从而改变蛋白质的构象和功能。目前TG酶已经广泛应用到食品、生物医药、... 详细信息

【背景】谷氨酰胺转氨酶 (Transglutaminase EC 2.***.2.13) 简称TG酶，能够催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基基团与赖氨酸残基的ε-氨基基团之间交联，形成异性肽键，从而改变蛋白质的构象和功能。目前TG酶已经广泛应用到食品、生物医药、纺织、皮革加工等领域。【目的】从天然茂原链霉菌中挖掘性能优异的TG酶，并将其在工业底盘菌株中重组表达提高产量。【方法】通过发酵测定了一株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis) CGMCC4.266的TG酶生产能力。使用CaptoS阳离子交换层析柱对该TG酶(TGe)进行纯化。通过测定TGe的最适pH和pH稳定性、最适温度和温度稳定性以及交联酪蛋白的能力来分析其酶学性质。将工业茂原链霉菌内源tg基因进行敲除构建Δtg，然后将tge基因在Δtg中重组表达。【结果】TGe最适pH 5.0，在pH 4.0-10.0范围内保持较高的活性。最适反应温度为50 ℃，与商品化酶相当。在4-40 ℃范围内TGe稳定性较好，在40-65 ℃范围内TGe活性略优于商品化酶。酪蛋白交联实验表明，在50 ℃条件下，TGe交联能力明显优于商品化酶。tge在Δtg中重组表达，TGe产量显著提高可达6.3 U/mL，相较野生菌株提高162.5%，且TGe催化活性不受影响。【结论】对天然茂原链霉菌中的TG酶进行挖掘表征，是获取性能更加优异TG酶的有效方式。异源TG酶在成熟工业菌株中成功表达为提高茂原链霉菌TG酶产量提供了新策略。

关键词： TG酶酶学性质纯化重组表达