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基于“脑-肠轴”探讨“五音调神”法对慢性疲劳综合征伴焦虑状态患者的影响

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现代中西医结合杂志 2024年第13期33卷 1765-1769,1812页

作者：苏佳宁王雪妍丹禹钦冯梓芸张梦圆吴雨静李丽山东中医药大学康复医学院山东济南250013 山东中医药大学第二附属医院康复医院山东济南250001

目的基于“脑-肠轴”理论观察“五音调神”法对慢性疲劳综合征(CFS)伴焦虑状态患者的影响。方法选取2023年1-10月在山东中医药大学第二附属医院康复医院治疗的57例CFS伴焦虑状态患者,随机分为对照组(29例)和治疗组(28例)。对照组给予认... 详细信息

目的基于“脑-肠轴”理论观察“五音调神”法对慢性疲劳综合征(CFS)伴焦虑状态患者的影响。方法选取2023年1-10月在山东中医药大学第二附属医院康复医院治疗的57例CFS伴焦虑状态患者,随机分为对照组(29例)和治疗组(28例)。对照组给予认知行为疗法干预,治疗组给予“五音调神”法(宫调式五行音乐联合针刺百会、神庭、印堂)干预,2组均干预4周。比较2组治疗前后Chalder疲劳量表(FS-14)评分、匹兹堡睡眠质量指数量表(PSQI)评分、焦虑自评量表(SAS)评分、生活质量SF-36量表评分、血清5-羟色胺(5-HT)水平、肠道菌群(双歧杆菌及乳酸杆菌)数量。结果治疗后,2组患者FS-14评分、PSQI评分、SAS评分均较治疗前明显降低(P均0.05);2组SF-36评分、血清5-HT水平、双歧杆菌及乳酸杆菌数量均明显高于治疗前(P均行为疗法。

关键词：慢性疲劳综合征焦虑五音调神法脑-肠轴肠道菌群

肥胖损伤下丘脑GnRH神经元功能的研究进展

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中华内分泌代谢杂志 2024年第7期40卷 625-634页

作者：刘媚杨蕾蕾杨芊管庆波于春晓内分泌糖脂代谢与脑老化教育部重点实验室山东第一医科大学附属省立医院内分泌代谢病科济南250012 北京中医药大学东直门医院洛阳医院(洛阳市中医院)放射科洛阳471003

生育能力逐年下降已成为关系到国计民生的重大问题, 肥胖是其主要原因之一。下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)神经元释放GnRH, 通过下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴调控雌激素和雄激素的分泌, 影响性发育和生育能力。保持GnRH神经元功能在维系... 详细信息

生育能力逐年下降已成为关系到国计民生的重大问题, 肥胖是其主要原因之一。下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)神经元释放GnRH, 通过下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴调控雌激素和雄激素的分泌, 影响性发育和生育能力。保持GnRH神经元功能在维系正常的性发育和生育能力过程中发挥重要作用。研究表明, 肥胖可能通过影响GnRH神经元脉冲分泌核心——kisspeptin神经元, 诱导能量感受及代谢因子分泌失衡, 下丘脑炎症状态等多种途径, 直接或间接作用于下丘脑GnRH神经元, 影响GnRH的释放, 最终影响性发育, 损伤生育能力。因此, 本文综述了肥胖诱导下丘脑GnRH神经元功能损伤相关机制的国内外最新进展, 为肥胖患者的临床早期干预、改善生育能力提供新的思路。

关键词：生育能力肥胖 GnRH神经元

前岛叶皮层中间神经元调控小鼠观察性恐惧的机制及六味地黄苷糖缓解恐惧的作用研究

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前岛叶皮层中间神经元调控小鼠观察性恐惧的机制及六味地黄苷糖缓...

作者：李奉安南京中医药大学

学位级别：硕士

恐惧是人类适应环境的基本生存机制,其习得方式多样,主要有直接经验、观察学习和言语传递三种。过去大量基于条件恐惧行为范式的研究让我们对直接经验获得的恐惧有了深入理解,这种方式主要依赖感官输入和经典防御脑区(杏仁核)。而通过... 详细信息

恐惧是人类适应环境的基本生存机制,其习得方式多样,主要有直接经验、观察学习和言语传递三种。过去大量基于条件恐惧行为范式的研究让我们对直接经验获得的恐惧有了深入理解,这种方式主要依赖感官输入和经典防御脑区(杏仁核)。而通过观察或言语间接获得恐惧的方式,不仅涉及恐惧情绪的直接处理,还包括对社会信息的理解和内化,更多依赖于观察者对其他个体行为的解释以及内在的情感共鸣机制。因此,深入探究恐惧习得的差异化机制对于应对不同场景下的恐惧情绪和采取相应治疗方法至关重要。这对经常面临灾难血腥场景的医疗救护、火灾救援和前线作战人员的心理健康治疗尤为重要。岛叶皮层是机体重要的内感受中枢处理器,负责感知、整合、理解和调节身体信号,对解码和理解社会情绪(例如面部表情、身体语言、语音及语调)至关重要。大量临床研究显示,特别是前岛叶皮层(Anterior insular cortex,AIC)的异常激活会引起主观情绪体验和社会情绪感知的变化。AIC主要由兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性GABA能中间神经元组成。中间神经元是局部神经网络活动的关键调节因素。基于表达蛋白的不同,中间神经元又分为三种类型:小清蛋白(Parvalbumin,PV)、生长抑素(Somatostatin,SOM)和血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Polypeptide,VIP)阳性神经元。这些 GABA能中间神经元与兴奋性谷氨酸能神经元共同构成局部微环路,负责AIC感觉信息处理和调控适应性行为。我们前期实验发现AIC脑区GABA能神经元在小鼠观察性恐惧后显著激活,但不同类型中间神经元如何调控观察性恐惧的表达目前还不清楚。近年来,虽然许多实验室开展了关于岛叶皮层在恐惧中的作用研究,但主要还是基于经典的巴普洛夫条件恐惧范式,发现AIC也编码直接经验获得的恐惧,其很可能是通过投射到中央杏仁核调节恐惧防御行为产生。但是,对其在间接恐惧中的调控机制研究较少。虽然有部分研究也开始探讨AIC在观察性恐惧中的神经机制,但采用的行为评价方法与条件恐惧一致,主要以僵直不动时间作为判断动物观察恐惧的唯一指标。而观察性恐惧属于非条件刺激,同时动物因感知差异的影响导致恐惧行为表现形式也更加多样。因此,如何建立一种小鼠观察性恐惧的科学评价模型,以及研究AIC不同类型中间神经元的调控作用是我们本项研究第一部分的重点。我们主要从以下两个方面进行探索:1.改进的小鼠观察性恐惧模型建立和行为评价目的:建立一种小鼠观察性恐惧的科学评价模型,用于后续研究前岛叶皮层在观察性恐惧中的调控机制。方法:通过改进行为测试装置、实验流程、行为评价指标和分析方法建立一种小鼠观察性恐惧的科学评价模型。行为测试装置改进为三箱装置,分为中央电击区及左右两个观察区,可同时对两只小鼠进行观察性恐惧行为检测,观察区划有交互区和角落区。实验流程分为三个阶段:分别是适应阶段、交互阶段和观察恐惧测试阶段。记录小鼠在每个阶段中的运动距离、僵直时间和角落区停留时间,对小鼠自主活动、僵直行为和逃避行为进行评估。采用Z-Score标准化方法对三种行为参数进行标准化处理,最后将这三种行为参数分别进行Z标准化后取平均,得到一个综合Z值(Z-Observational Fear,Z-OF),用于反映小鼠观察性恐惧的行为变化。相比于单一指标评价,增加了判断的准确性。结果:与对照小鼠相比,观察鼠在观察恐惧测试阶段的运动距离有降低趋势但无显著差异、僵直时间显著升高、角落区停留时间显著升高。Z标准化后,与对照组小鼠相比,观察鼠在观察性恐惧测试阶段的Z-OF显著升高。结论:改进后的小鼠观察性恐惧模型可以诱发小鼠观察性恐惧行为,且除了传统的僵直不动时间,增加了小鼠运动距离和角落区停留时间作为行为评价指标,并用Z标准化整合这三个行为参数对小鼠恐惧情绪进行评价。2.前岛叶皮层中PV、SOM和VIP神经元在观察性恐惧中的不同调控作用目的:探究AIC中PV、SOM、VIP中间神经元在小鼠观察性恐惧行为中的活动变化。方法:利用光遗传学和化学遗传学干预调控等技术,结合改进的小鼠观察恐惧行为实验装置,探究在观察性恐惧中AIC脑区PV、SOM、VIP中间神经元的活动特征。以光遗传学和化学遗传学的方法分别激活小鼠AIC脑区PV、SOM、VIP中间神经元,并评价小鼠在观察性恐惧行为的变化。结果:光遗传学调控结果显示,激活AIC脑区PV和VIP神经元时小鼠的Z-OF均显著降低,而激活AIC脑区SOM神经元时小鼠的Z-OF均显著升高。化学遗传学调控结果显示,激活AIC脑区PV和VIP神经元时小鼠的Z-OF均显著降低,激活AIC脑区SOM神经元时小鼠的Z-OF有所升高,但无统计学差异。结论:AIC中PV、SOM、VIP中间神经元均参与观察

关键词：观察性恐惧前岛叶皮层中间神经元光遗传学化学遗传学 LW-AFC HPA轴 RAAS系统

人参总皂苷调控衰老小鼠NAD+代谢及促进IDO2/QPRT表达延缓肝脏衰老机制研究

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人参总皂苷调控衰老小鼠NAD+代谢及促进IDO2/QPRT表达延缓肝脏衰...

作者：郭晨长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究以人参总皂苷（GS）为研究对象,基于NAD代谢的关键靶点,结合行为学实验、苏木精-伊红染色（H&E）、Qtrap 6500+液质联用平台、q PCR、Western bot等药效评价体系,分析人参总皂苷对衰老小鼠心、肝、肺、肾、脑NAD+代谢的作用... 详细信息

目的:本研究以人参总皂苷（GS）为研究对象,基于NAD代谢的关键靶点,结合行为学实验、苏木精-伊红染色（H&E）、Qtrap 6500+液质联用平台、q PCR、Western bot等药效评价体系,分析人参总皂苷对衰老小鼠心、肝、肺、肾、脑NAD+代谢的作用,并明确GS延缓肝脏衰老的作用机制,为阐述人参皂苷抗衰老的核心功效提供可靠的实验依据和思路。方法:1在18月龄自然衰老C57BL/6小鼠模型上,以100mg/kg的GS灌胃给药3个月,通过旋转疲劳棒,跑步机和抓力仪检测骨骼肌耐力。采用水迷宫和新物体识别评价神经功能。小动物核磁进行体成分分析。口服葡萄糖耐量试验（Oral Glucose Tolerance Test）评价胰岛素敏感性。利用生化分析仪和心脏超声分析各组小鼠肝功能、心功能和肾功能差异。通过H&E染色评价心、肝、肺、肾、脑组织病理学特征,系统观察GS提升自然衰老小鼠健康状态表型变化。2通过LC-MS建立NAD+代谢分析方法,检测自然衰老小鼠心、肝、肺、肾、脑和血清中NAD+的含量、NAD+/NADH比值以及NAD+代谢物的变化情况,明确GS调控自然衰老小鼠NAD+代谢的作用。3采用q PCR、Western blot等方法,检测自然衰老小鼠肝脏中p16、p21、p53、IL-6、IL-1β、TNF-α、组蛋白H2AX（γ-H2AX）、NAD+代谢酶的表达情况,分析GS影响肝脏衰老的作用机制。结果:1 GS干预3个月后,小鼠瘦肉和含水量无明显变化,但可显著减少衰老小鼠脂肪含量,并降低末期体重。与衰老组相比GS可显著增强抓力,延长爬杆下落时间,改善衰老小鼠骨骼肌耐力。水迷宫和新物体识别结果表明,GS可增强衰老小鼠认知和学习能力。OGTT结果表明GS对衰老小鼠血糖没有影响。生化分析和心脏超声表明,GS可减少谷丙转氨酶（ALT）和肌酸激酶（CK）;有降低乳酸脱氢酶（LDH）的趋势,增加左心室射血分数（EF）和左心室缩短分数（FS）,保护肝功能和心功能。此外,心、肝、肺、肾和脑的H&E结果表明,GS可改善衰老引起的松散的肝细胞排列,炎性浸润,肺泡壁增厚,心肌重构并减轻海马DG区神经细胞的丢失;而肾脏的病理结构无明显变化。2根据LC-MS结果分析表明,NAD+含量在心脏中最高,血清中最少。GS可显著增加自然衰老小鼠肝、脑、肺、肾的NAD+含量以及NAD+/NADH比值。色氨酸（TRP）和犬尿氨酸（KYN）含量在血清中最高,且仅在血清和肝脏中检测到,而GS可增加肝脏KYN和血清3-羟基氨基苯甲酸（3-HAA）的含量,进而影响肝脏从头合成途径。烟酸（NA）在肺和肾中含量最少,烟酸腺嘌呤二核苷酸（Nicotinate adenine dinucleotide,NAAD）在心脏中含量最高。而GS可增加自然衰老小鼠肾脏中NA和NAAD的含量,进而影响肾脏Preiss-Handler途径。另外,GS可减少衰老小鼠脑、肺、肾的烟酰胺（Nicotinamide,NAM）,并增加肝和肺的烟酰胺核糖（Nicotinamide ribose,NR）的含量,进而影响肺的补救合成途径。3 GS干预可显著抑制肝脏p21的m RNA表达以及p16,IL-6,IL-1β和γ-H2AX的蛋白表达,并不同程度的降低IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA表达,抑制DNA损伤,延缓肝脏细胞衰老。更重要的是,GS可明显促进吲哚胺-双加氧酶2（IDO2）和喹啉酸磷酸核糖转移酶（QPRT）的表达,减少ACMS脱羧酶（ACMSD）的表达。进而促进肝脏NAD+的从头合成途径。结论:1 GS可增强衰老小鼠骨骼肌耐力,肝功能和心功能,改善肝脏、肺和心脏的病理结构变化,发挥了延缓衰老的作用。2 GS可增加自然衰老小鼠肝、脑、肺、肾的NAD+含量和NAD+/NADH的比值,调节肝的从头合成途径、肾的Preiss-Handler途径和肺的补救合成途径相关代谢物的含量。3 GS可通过促进IDO2/QPRT的表达促进肝脏从头合成代谢,恢复肝脏NAD+水平和NAD+/NADH的比值,抑制衰老相关分泌表型（SASP）的表达,进而延缓肝脏衰老。

关键词：人参总皂苷衰老烟酰胺腺嘌呤二核苷酸从头合成途径

丰富环境联合橙皮苷在脑出血小鼠铁死亡通路中的神经保护机制研究

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丰富环境联合橙皮苷在脑出血小鼠铁死亡通路中的神经保护机制研究

作者：马瑞甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的通过建立胶原酶诱导的脑出血小鼠模型,探讨丰富环境联合橙皮苷在脑出血小鼠铁死亡通路中神经保护机制。方法1.将实验小鼠按随机数字表法分为假手术(Sham)组、羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶剂对照组、脑出血(ICH)组、橙皮苷高浓度组(High ... 详细信息

目的通过建立胶原酶诱导的脑出血小鼠模型,探讨丰富环境联合橙皮苷在脑出血小鼠铁死亡通路中神经保护机制。方法1.将实验小鼠按随机数字表法分为假手术(Sham)组、羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶剂对照组、脑出血(ICH)组、橙皮苷高浓度组(High 200 mg/kg)、中浓度组(Middle 100 mg/kg)、低浓度组(Low 50 mg/kg)共6组,每组8只,共48只。建立Ⅶ型胶原酶诱导的脑出血模型,并通过Longa评分筛选造模成功小鼠。CMC-Na对照组给予橙皮苷组等体积的0.5%CMC-Na灌胃处理;橙皮苷高中低浓度组采取相应橙皮苷悬浮液灌胃处理;Sham组与ICH组等量生理盐水灌胃。所有实验小鼠均在手术或药物处理后3d进行神经行为学mNSS评分和HE染色。2.将实验小鼠按随机数字表法分为Sham组、ICH组、丰富环境(EE)组、橙皮苷(HSD)组、丰富环境联合橙皮苷(EE+HSD)组、丰富环境+橙皮苷+ML385抑制剂(ML385)组共6组,每组15只小鼠,共90只。造模模型建立、筛选标准同实验一。HSD组、EE+HSD组、ML385组给予橙皮苷悬浮液灌胃,Sham组、ICH组、EE组给予同等体积0.5%CMC-Na灌胃。ML385组腹腔注射ML385(30 mg/kg)抑制剂,其余各组腹腔注射等体积5%DMSO。灌胃和腹腔注射1次/d,共14d。将EE组、EE+HSD组、ML385组小鼠放入丰富环境鼠笼,Sham组、ICH组、HSD组小鼠放至普通鼠笼。在14d时对各分组小鼠进行mNSS评分后,进行HE染色、普鲁士蓝染色,脑含水量检测脑水肿,RT-PCR检测Gpx4、Nrf2 mRNA表达水平,ELISA测定与铁死亡相关因子MDA、Gpx4、ROS、SOD的含量变化,Western Blot检测Nrf2、Gpx4蛋白表达水平。结果***组与CMC-Na组相比mNSS评分差异无统计学意义,Sham组HE染色细胞排列规则、细胞间隙正常,CMC-Na组局部有炎性细胞聚集、细胞间隙增大、细胞排列紊乱。ICH组与Sham组相比,mNSS评分(P脑含水量百分比(P脑含水量百分比(P脑含水量百分比(P脑含水量百分比(P脑含水量百分比(P脑出血小鼠铁死亡通路中的神经保护机制研究显示,相较Sham组,ICH组Nrf2 mRNA(P>0.5)表达差异不具统计学意义,Gpx4 mRNA(P<0.05)表达降低,Nrf2蛋白(P<0.05)表达明显升高、Gpx4蛋白(P<0.01)相对降低,MDA含量(P<0.0001)、ROS含量(P<0.0001)明显升高,SOD含量(P<0.0001)、Gpx4含量(P<0.0001)明显降低。相较ICH组,EE组Nrf2 mRNA(P<0.05)、Gpx4 mRNA(P<0.001)表达升高,MDA含量(P<0.001)、ROS含量(P<0.05)相对降低,SOD含量(P<0.01)、Gpx4含量(P<0.01)相对升高;HSD组Nrf2 mRNA(P<0.05)、Gpx4 mRNA(P<0.

关键词：铁死亡脑出血丰富环境橙皮苷

基于肠-脑轴研究林下参皂苷组分抑制神经炎症的作用机制

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基于肠-脑轴研究林下参皂苷组分抑制神经炎症的作用机制

作者：蔡泳昱长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:机体衰老以脑结构的变化和功能的改变为重要特征,脑衰老所引起的神经炎症对机体具有严重的危害,并且伴随着学习记忆障碍的症状。肠道菌群是生活在胃肠道中数以万计的微生物,研究认为肠道菌群与大脑之间存在着相互连接的通道“肠-... 详细信息

目的:机体衰老以脑结构的变化和功能的改变为重要特征,脑衰老所引起的神经炎症对机体具有严重的危害,并且伴随着学习记忆障碍的症状。肠道菌群是生活在胃肠道中数以万计的微生物,研究认为肠道菌群与大脑之间存在着相互连接的通道“肠-脑轴”。课题组前期通过体外BV2小胶质细胞实验研究发现:林下参低中极性皂苷组分(LML)具有抑制BV2细胞炎症的作用。因此本研究以LML为研究对象,以肠道菌群代谢物短链脂肪酸(Short-chain fatty acid,SCFAs)介导TLR4/NLRP3途径探究LML对学习记忆障碍模型小鼠神经炎症的抑制作用及机制。本研究旨在阐释LML抑制神经炎症的作用机制,为林下参在延缓衰老方面的应用提供理论基础。方法:***中人参皂苷成分定量分析:利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-QQQ MS)联用技术中负离子多反应监测模式(MRM)对LML中主要的人参皂苷进行定量分析。***对学习记忆障碍模型小鼠神经炎症的抑制作用:选取C57BL/6J小鼠作为实验动物,腹腔注射东莨菪碱(Scopolamine,SCOP)诱导学习记忆障碍模型,设立空白组(CON)、模型组(M)、阳性药组(DPZ)、LML低剂量给药组(LMLL)、LML中剂量给药组(LML-M)和LML高剂量给药组(LML-M)。考察LML对学习记忆障碍小鼠行为学、脏器组织形态、免疫生化指标、脑部炎症蛋白和结肠紧密连接蛋白的影响。***对学习记忆障碍模型小鼠肠道菌群及代谢物SCFAs的调节作用:采用16S r RNA测序技术分析研究LML干预后,学习记忆障碍模型小鼠的粪便微生物结构变化。通过气相色谱-质谱联用技术(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)靶向定量分析LML干预模型动物后粪便样本中的SCFAs的含量变化,探讨LML基于菌群-SCFAs-脑互作抑制模型动物神经炎症的作用机制。4.通过粪菌移植验证LML抑制学习记忆障碍模型小鼠神经炎症的作用机制:选取C57BL/6J小鼠作为实验动物,建立抗生素诱导的伪无菌小鼠模型,设立伪无菌-空白对照组(FMT-CON)、伪无菌-模型组(FMT-M)和伪无菌-LML粪菌移植组(FMT-LML),FMT-M组和FMT-LML组建立学习记忆障碍模型,考察粪菌移植对学习记忆障碍模型小鼠行为学、脏器组织形态、免疫生化指标、脑部炎症蛋白、结肠紧密连接蛋白、肠道菌群和SCFAs的影响。进一步验证LML通过肠道菌群代谢物SCFAs介导TLR4/NLRP3途径发挥抑制神经炎症的作用机制。结果:***中人参皂苷成分的定量分析:基于UPLC-QQQ-MS技术对LML中Rg2、Ra2、Rc、Rb2、Rd、Rg3、Ra1、Rb3、Rb1、Ro进行定量分析,确定其在LML中的含量分别为12.1176mg/g、9.8824mg/g、84.2941mg/g、66.5294mg/g、144.3529mg/g、28.6471mg/g、19.2353mg/g、81.2354mg/g、159.2941mg/g、2.7059mg/g。***对学习记忆障碍模型小鼠神经炎症的抑制作用:LML给药后减少了学习记忆障碍模型小鼠水迷宫逃避潜伏期。LML通过降低血清中TNF-α等炎症因子浓度,升高抗炎因子IL-10的浓度,来抑制模型小鼠炎症反应,并降低DAO等肠道通透性指标,修复肠道屏障损伤阻止LPS进入血循环。结肠HE染色、免疫荧光染色和蛋白免疫印迹的结果表明,LML能够恢复结肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1和SCFAs转运和受体蛋白MCT1、SMCT1、GPR43的表达,并修复肠道屏障的损伤。海马体HE染色、免疫荧光染色、尼氏体染色和蛋白免疫印迹法的结果表明,LML给药可以抑制NLRP3炎症小体的组装,减少海马体内IL-1β的表达,阻止小胶质细胞向促炎的M1表型转变,抑制神经炎症反应,LML-M组的效果更为显著。***对学习记忆障碍模型小鼠肠道菌群及代谢物SCFAs的调节作用:肠道菌群研究结果发现,在门水平上,LML-M组升高Bacteroidete的相对丰度,降低Firmicutes相对丰度,属水平上,升高unclassified＿Muribaculaceae、uncultured＿Bacteroidales＿bacterium和Ligilactobacillus的相对丰度,降低Allobaculum的相对丰度。LML通过调节肠道菌群结构,恢复肠道稳态。KEGG代谢通路分析表明LML-M组在氨基酸代谢等通

关键词：林下参低中极性人参皂苷组分(LML) 神经炎症肠道菌群短链脂肪酸粪菌移植

基于“肠—脑”轴研究陪伴改善小鼠卒中后抑郁的作用机制

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基于“肠—脑”轴研究陪伴改善小鼠卒中后抑郁的作用机制

作者：江素婷南京中医药大学

学位级别：硕士

研究目的:通过局灶性脑缺血后给予孤养与束缚应激4周,建立小鼠卒中后抑郁（post-stroke depression,PSD）模型,研究陪伴改善PSD模型小鼠的抑郁样行为与“肠-脑”轴之间的相关性,明确陪伴改善PSD的相关分子生物学机制,为PSD的防治提供科... 详细信息

研究目的:通过局灶性脑缺血后给予孤养与束缚应激4周,建立小鼠卒中后抑郁（post-stroke depression,PSD）模型,研究陪伴改善PSD模型小鼠的抑郁样行为与“肠-脑”轴之间的相关性,明确陪伴改善PSD的相关分子生物学机制,为PSD的防治提供科学依据。研究方法:（1）本研究应用成年SPF级雄性C57BL/6小鼠,通过阻塞大脑中动脉（middlecerebral artery occlusion,MCAO）随后进行单笼饲养和束缚应激4周建立PSD模型。在MCAO手术3天后,对陪伴（pair-housing,PH）组小鼠,每只模型小鼠与1只正常的雄性小鼠进行同笼饲养4周。同时,另一陪伴组小鼠给予抗生素水进行清菌处理（pair-housingplus antibiotic water,PH+ABX）,该组的两只小鼠分别饮用抗生素水（氨苄西林1 g/L、硫酸新霉素1 g/L、甲硝唑1g/L、万古霉素0.5 g/L）4周。此外,另两组PSD模型小鼠分别给予粪便微生物移植（100 μl/day）(fecal microbiota transplantation,FMT)或氟西汀（20 mg/Kg/day）(fluoxetine,FLX)治疗,持续4周。经造模处理后,评估小鼠体重的变化,通过糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验和悬尾实验等评价小鼠的抑郁样行为。（2）通过16S rDNA肠道菌群测序检测小鼠肠道菌群的变化,观察陪伴、粪便微生物移植及清菌处理对PSD模型小鼠肠道菌群的影响。（3）通过苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,H&E）染色,观察小鼠结肠组织的病理形态学变化。（4）通过过碘酸-希夫（periodicacid-schiff,PAS）染色,观察比较不同处理组小鼠结肠组织中杯状细胞的数量。（5）采用免疫荧光法（immunofluorescence,IF）检测结肠中紧密连接蛋白Occludin、胞质紧密连接蛋白-1（zonulaoccludens-1,ZO-1）以及巨噬细胞的数量变化,脑内海马脑区中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化以及神经干细胞的增殖情况。（6）通过免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）,检测结肠组织中CD4型和CD8型淋巴细胞的表达与分布。（7）通过逆转录聚合酶链反应法（real-time quantification polymerase chain reaction technology,RT-PCR）测定小鼠结肠组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素 1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素 6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）等mRNA表达水平,观察结肠的炎症反应。（8）运用液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry,LC/MS）,定量分析脑纹状体中的神经递质水平,包括5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、谷氨酸（glutamic acid,Glu）、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）、去甲肾上腺素（noradrenaline,NE）及多巴胺（dopamine,DA）含量的变化。（9）通过尼氏染色法,观察海马组织中神经元尼氏小体的数量及形态等变化,评估小鼠脑内神经元损伤的情况。研究结果:（1）与正常对照（control,Ctrl）组相比,PSD组小鼠体重自MCAO模型后第7天至4周后均显著下降;PH组在MCAO后第21天体重显著下降,其它则无显著的变化。（2）与Ctrl组相比,PSD组小鼠的糖水消耗率显著降低、旷场中心区域的停留时间和行走总距离均显著缩短,以及强迫游泳实验和悬尾实验的不动时间明显延长;与PSD组相比,PH组和FMT组小鼠的糖水消耗率、中心区域的停留时间和行走总距离及不动时间均明显改善;PH+ABX组小鼠的上述行为学结果与PH组之间的差异无统计学意义。（3）在肠道菌群ASV分析中,PSD组小鼠的肠道菌群的独特特征较Ctrl组显著减少,PH组和FMT组小鼠的肠道菌群独特特征较PSD组显著增多,而与PH组相比,PH+ABX组小鼠的肠道菌群独特特征显著减少;肠道菌群Alpha多样性分析显示,PSD组小鼠的肠道菌群物种丰富性及多样性较Ctrl组明显减少,PH组和FMT组的肠道菌群物种丰富性及多样性高于PSD组;肠道菌群β多样性分析显示,PSD组和Ctrl组之间肠道微生物群落组成差异明显,PH组肠道微生物组成更接近Ctrl组,FMT组、P

关键词：卒中后抑郁 “肠-脑”轴陪伴社会互动炎症

人参多糖GP4的制备及其抑制β-淀粉样蛋白异常聚集的作用机制研究

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人参多糖GP4的制备及其抑制β-淀粉样蛋白异常聚集的作用机制研究

作者：李金梦长春中医药大学

学位级别：硕士

目的:本实验旨在通过从人参水提物中分离纯化出人参多糖GP4,明确其相对分子质量及理化性质。基于Aβ42内源表达的AD细胞、3D迷你脑及转基因线虫AD模型,探究人参多糖GP4对β-淀粉样蛋白异常聚集的调控作用,揭示人参多糖GP4抑制β-淀粉样... 详细信息

目的:本实验旨在通过从人参水提物中分离纯化出人参多糖GP4,明确其相对分子质量及理化性质。基于Aβ42内源表达的AD细胞、3D迷你脑及转基因线虫AD模型,探究人参多糖GP4对β-淀粉样蛋白异常聚集的调控作用,揭示人参多糖GP4抑制β-淀粉样蛋白异常聚集的分子机制。方法:（1）利用水提醇沉和Sevage法等制备人参多糖GP4;应用高效凝胶渗透色谱法、高效液相色谱法、FT-IR光谱等评估GP4的均一性、相对分子质量等,并对其理化性质进行表征。（2）建立3D迷你脑类器官,免疫荧光法检测3D迷你脑中神经细胞标志物的荧光强度。（3）利用Aftin-5诱导Aβ异常聚集建立AD模型,明确GP4给药浓度。（4）酶联免疫吸附法检测AD模型中Aβ42、Aβ40、及炎症因子IL-6、IL-10等表达水平。（5）以不同浓度GP4干预AD线虫,确定给药浓度;GP4对不同时期AD线虫进行干预,明确最佳干预方式;利用行为学实验,表征GP4早期干预治疗对AD线虫死亡率、氧化应激、认知能力的功效;Th T染色评估GP4抑制Aβ积聚的能力。（6）利用氧耗率及ATP水平测定AD细胞的氧耗量及代谢水平;免疫荧光检测AD模型中线粒体自噬相关蛋白水平及线粒体蛋白HSP60和溶酶体标记蛋白LAMP2的共定位情况。（7）构建pink-1基因的RNA干涉质粒,通过RT-q PCR技术,明确干涉效率;应用Th T染色来量化体内Aβ的聚集情况。结果:（1）人参多糖GP4相对分子质量为4.7k Da,其单糖组成为葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和甘露糖,摩尔比为75.9:9.5:7.7:5.6:0.9:0.3:0.1。（2）诱导人多能干细胞聚集生长分化成3D迷你脑;免疫荧光确定3D迷你脑类器官模型建立成功;6E10染色显示3D迷你脑中存在Aβ内源表达。（3）经GP4处理24h后显著降低AD模型中Aβ42水平。（4）GP4对AD模型中IL-6和TNF-α具有抑制作用,并上调IL-10的水平。（5）1和10 mg/m L GP4可缓解AD线虫的瘫痪表型,且10mg/m L的GP4早期干预效果最优;GP4早期干预可延长线虫寿命,增强其抗氧化及认知功能,并降低Aβ的聚集。（6）40μg/m L的GP4显著提高AD细胞模型的OCR水平,而20μg/m L和40μg/m L的GP4均对胞内ATP水平有积极作用。（7）GP4可增加AD模型中线粒体自噬相关蛋白PINK1和parkin的表达水平,及线粒体蛋白HSP60和溶酶体标记蛋白LAMP2的共定位。（8）GP4能增强AD线虫中自噬体特异性标签DCT-1和溶酶体蛋白LGG-1的共定位;Th T染色结果表明,pink-1基因敲低后,GP4的干预未能减少AD线虫体内Aβ聚集。结论:本研究从人参中分离纯化出相对分子质量为4.7k Da的人参多糖GP4,其对包括细胞、3D迷你脑及线虫在内的AD模型中的Aβ异常聚集及神经经炎症具有显著的抑制作用,线粒体自噬的激活可能是其抑制Aβ异常聚集的作用机制。

关键词：阿尔茨海默病 β-淀粉样蛋白人参多糖秀丽隐杆线虫 3D迷你脑线粒体自噬

经典致幻剂对TMT诱导的大鼠本能恐惧22kHz超声发声和小鼠甩头反应的影响及神经机制研究

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经典致幻剂对TMT诱导的大鼠本能恐惧22kHz超声发声和小鼠甩头反应...

作者：王媛媛南京中医药大学

学位级别：硕士

经典致幻剂是主要作用于5-HT2A受体发挥药理效应的精神活性物质,可以改变人的认知、感知觉、情绪,甚至使人产生幻觉等。有研究表明经典致幻剂可以缓解人的恐惧情绪,但缺乏相关动物实验以及机制研究。鉴于经典致幻剂对自发活动的影响,在... 详细信息

经典致幻剂是主要作用于5-HT2A受体发挥药理效应的精神活性物质,可以改变人的认知、感知觉、情绪,甚至使人产生幻觉等。有研究表明经典致幻剂可以缓解人的恐惧情绪,但缺乏相关动物实验以及机制研究。鉴于经典致幻剂对自发活动的影响,在这里选择不通过行为,可直接反映主观感受的发声进行评价。通过建立2,4,5-三甲基-3-噻唑啉(2,5-dihydro-2,4,5-trimethylthiazoline,TMT)诱导大鼠 22 kHz 超声发声(ultrasonic vocal-izations,USV)模型,探究经典致幻剂4-乙酰氧基-N,N-二甲基色胺(4-acetoxy-N,N-dimethyltryptamine,4-AcO-DMT)对大鼠22 kHz USV的影响,并进行神经机制方面的探究。小鼠甩头反应(head twitch response,HTR)模型是目前研究经典致幻剂致幻效应的重要模型,经典致幻剂的HTR效应强度与其人体效应强度具有明显相关性,但小鼠HTR是否代表幻觉目前尚无定论,所以探究HTR背后的神经生物学机制对经典致幻剂的作用机制以及研究其幻觉效应具有重要的意义。第一章探究经典致幻剂4-AcO-DMT对TMT诱导的大鼠本能恐惧22 kHz USV的影响及神经机制。首先比较不同的场地大小和TMT浓度从而建立稳定的TMT诱导大鼠22 kHz USV模型,在此模型基础上对4-AcO-DMT进行药效学评价,发现1.0 mg/kg以上的4-AcO-DMT可以显著抑制TMT诱导的大鼠22 kHz USV。关于4-AcO-DMT抑制TMT诱导的大鼠22 kHz USV的可能影响因素,通过两箱实验排除了 4-AcO-DMT对大鼠嗅觉的影响,通过冷热刺激诱导大鼠22 kHz USV实验排除了 4-AcO-DMT对大鼠发声功能的影响,通过呼吸频率监测和环甲肌、腹外斜肌肌电记录排除了 4-AcO-DMT对大鼠的呼吸的影响,通过自发活动实验排除了 1.0 mg/kg 4-AcO-DMT对大鼠自发活动的影响。最后通过监测实验过程中大鼠心率变化发现4-AcO-DMT可以抑制TMT诱导的心率增加,以及4-AcO-DMT缩短TMT诱导的大鼠僵直不动(Freezing)行为时间,验证了 4-AcO-DMT通过缓解TMT诱导的本能恐惧情绪从而抑制了 22 kHz USV。探究4-AcO-DMT抑制TMT诱导的大鼠22 kHz USV的神经机制,通过EGR1免疫荧光染色、脑区损毁实验、化学遗传学、神经元特异性消融以及拮抗剂等方法,揭示了 4-AcO-DMT通过激活PrL脑区的VIP神经元上的5-HT2A受体来缓解TMT诱导的本能恐惧情绪,从而抑制22 kHz USV。第二章探究经典致幻剂对小鼠HTR的影响及神经机制。首先基于甩头模型对4-AcO-DMT、DOM、Mescaline进行药效学评价,寻找它们诱导小鼠HTR的最大效应剂量。通过探究经典致幻剂对不同类型神经元的5-HT2A受体条件性敲除小鼠HTR的影响,发现经典致幻剂主要通过皮层椎体神经元介导小鼠HTR。建立非药物性的、自然状态下的花生油诱导小鼠HTR模型,通过宽场钙成像、脑区损毁等方法发现M2脑区可能是介导小鼠HTR的关键脑区,希望通过比较经典致幻剂诱导的小鼠HTR与花生油诱导的小鼠HTR在神经机制方面的异同,探究经典致幻剂是否通过幻觉从而诱导HTR。

关键词：经典致幻剂 22 kHz超声发声本能恐惧甩头反应