前岛叶皮层中间神经元调控小鼠观察性恐惧的机制及六味地黄苷糖缓解恐惧的作用研究

作     者：李奉安 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周文霞;石天尧

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：观察性恐惧 前岛叶皮层 中间神经元 光遗传学 化学遗传学 LW-AFC HPA轴 RAAS系统 

摘      要：恐惧是人类适应环境的基本生存机制,其习得方式多样,主要有直接经验、观察学习和言语传递三种。过去大量基于条件恐惧行为范式的研究让我们对直接经验获得的恐惧有了深入理解,这种方式主要依赖感官输入和经典防御脑区(杏仁核)。而通过观察或言语间接获得恐惧的方式,不仅涉及恐惧情绪的直接处理,还包括对社会信息的理解和内化,更多依赖于观察者对其他个体行为的解释以及内在的情感共鸣机制。因此,深入探究恐惧习得的差异化机制对于应对不同场景下的恐惧情绪和采取相应治疗方法至关重要。这对经常面临灾难血腥场景的医疗救护、火灾救援和前线作战人员的心理健康治疗尤为重要。 岛叶皮层是机体重要的内感受中枢处理器,负责感知、整合、理解和调节身体信号,对解码和理解社会情绪(例如面部表情、身体语言、语音及语调)至关重要。大量临床研究显示,特别是前岛叶皮层(Anterior insular cortex,AIC)的异常激活会引起主观情绪体验和社会情绪感知的变化。AIC主要由兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性GABA能中间神经元组成。中间神经元是局部神经网络活动的关键调节因素。基于表达蛋白的不同,中间神经元又分为三种类型:小清蛋白(Parvalbumin,PV)、生长抑素(Somatostatin,SOM)和血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Polypeptide,VIP)阳性神经元。这些 GABA能中间神经元与兴奋性谷氨酸能神经元共同构成局部微环路,负责AIC感觉信息处理和调控适应性行为。我们前期实验发现AIC脑区GABA能神经元在小鼠观察性恐惧后显著激活,但不同类型中间神经元如何调控观察性恐惧的表达目前还不清楚。 近年来,虽然许多实验室开展了关于岛叶皮层在恐惧中的作用研究,但主要还是基于经典的巴普洛夫条件恐惧范式,发现AIC也编码直接经验获得的恐惧,其很可能是通过投射到中央杏仁核调节恐惧防御行为产生。但是,对其在间接恐惧中的调控机制研究较少。虽然有部分研究也开始探讨AIC在观察性恐惧中的神经机制,但采用的行为评价方法与条件恐惧一致,主要以僵直不动时间作为判断动物观察恐惧的唯一指标。而观察性恐惧属于非条件刺激,同时动物因感知差异的影响导致恐惧行为表现形式也更加多样。因此,如何建立一种小鼠观察性恐惧的科学评价模型,以及研究AIC不同类型中间神经元的调控作用是我们本项研究第一部分的重点。我们主要从以下两个方面进行探索: 1.改进的小鼠观察性恐惧模型建立和行为评价 目的:建立一种小鼠观察性恐惧的科学评价模型,用于后续研究前岛叶皮层在观察性恐惧中的调控机制。 方法:通过改进行为测试装置、实验流程、行为评价指标和分析方法建立一种小鼠观察性恐惧的科学评价模型。行为测试装置改进为三箱装置,分为中央电击区及左右两个观察区,可同时对两只小鼠进行观察性恐惧行为检测,观察区划有交互区和角落区。实验流程分为三个阶段:分别是适应阶段、交互阶段和观察恐惧测试阶段。记录小鼠在每个阶段中的运动距离、僵直时间和角落区停留时间,对小鼠自主活动、僵直行为和逃避行为进行评估。采用Z-Score标准化方法对三种行为参数进行标准化处理,最后将这三种行为参数分别进行Z标准化后取平均,得到一个综合Z值(Z-Observational Fear,Z-OF),用于反映小鼠观察性恐惧的行为变化。相比于单一指标评价,增加了判断的准确性。 结果:与对照小鼠相比,观察鼠在观察恐惧测试阶段的运动距离有降低趋势但无显著差异、僵直时间显著升高、角落区停留时间显著升高。Z标准化后,与对照组小鼠相比,观察鼠在观察性恐惧测试阶段的Z-OF显著升高。 结论:改进后的小鼠观察性恐惧模型可以诱发小鼠观察性恐惧行为,且除了传统的僵直不动时间,增加了小鼠运动距离和角落区停留时间作为行为评价指标,并用Z标准化整合这三个行为参数对小鼠恐惧情绪进行评价。 2.前岛叶皮层中PV、SOM和VIP神经元在观察性恐惧中的不同调控作用 目的:探究AIC中PV、SOM、VIP中间神经元在小鼠观察性恐惧行为中的活动变化。 方法:利用光遗传学和化学遗传学干预调控等技术,结合改进的小鼠观察恐惧行为实验装置,探究在观察性恐惧中AIC脑区PV、SOM、VIP中间神经元的活动特征。以光遗传学和化学遗传学的方法分别激活小鼠AIC脑区PV、SOM、VIP中间神经元,并评价小鼠在观察性恐惧行为的变化。 结果:光遗传学调控结果显示,激活AIC脑区PV和VIP神经元时小鼠的Z-OF均显著降低,而激活AIC脑区SOM神经元时小鼠的Z-OF均显著升高。化学遗传学调控结果显示,激活AIC脑区PV和VIP神经元时小鼠的Z-OF均显著降低,激活AIC脑区SOM神经元时小鼠的Z-OF有所升高,但无统计学差异。 结论:AIC中PV、SOM、VIP中间神经元均参与观察