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基于CRISPR/Cas9技术的哺乳动物细胞基因敲入的策略优化与效率提升

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生命的化学 2024年第8期44卷 1433-1441页

作者：邹爽孟德豪李贺年张艳芬马宁哈尔滨医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室哈尔滨150081 哈尔滨医科大学附属第二医院检验科哈尔滨150000 黑龙江省遗传改变模式动物重点实验室哈尔滨150081

CRISPR基因编辑系统自问世以来,极大推动了疾病治疗、药物研发、疾病模型构建等领域的研究进展。基于该系统的基因敲入(knock-in,KI)策略已成为基因工程生物制备与基因治疗等应用的常用策略。但外源DNA的敲入,尤其是较大DNA片段的敲入... 详细信息

CRISPR基因编辑系统自问世以来,极大推动了疾病治疗、药物研发、疾病模型构建等领域的研究进展。基于该系统的基因敲入(knock-in,KI)策略已成为基因工程生物制备与基因治疗等应用的常用策略。但外源DNA的敲入,尤其是较大DNA片段的敲入效率一直是该策略有待优化的问题。研究者已从基因(组)编辑系统、DNA损伤修复、细胞周期调节等方面进行了提升KI效率的探索。本文主要针对以上方面进行综述,阐述影响KI效率的关键因素与提升KI效率的优化策略。

关键词： CRISPR/Cas9 基因敲入同源重组修复非同源末端连接

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基于抗体融合荧光蛋白的镰刀菌免疫检测技术

基因组学与应用生物学 2024年

作者：闫瑜雪尚国富陈绍美喻艳琴胡祖权艾民彭晓燕贵州医科大学公共卫生与健康学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵州医科大学基础医学院贵州省感染免疫与抗体工程特色重点实验室贵州医科大学生物与工程学院(健康医药现代产业学院)贵州省高等学校免疫细胞与抗体工程研究中心

镰刀菌(Fusarium spp.)是一类重要的植物病原菌和临床上常见的致病真菌，为实现镰刀菌的快速灵敏检测，本研究通过基因工程操作技术将编码抗镰刀菌单链抗体FvSG7的基因与mNenoGreen (mNG)绿色荧光蛋白和NanoLuc (NLuc)荧光素酶基因构建... 详细信息

镰刀菌(Fusarium spp.)是一类重要的植物病原菌和临床上常见的致病真菌，为实现镰刀菌的快速灵敏检测，本研究通过基因工程操作技术将编码抗镰刀菌单链抗体FvSG7的基因与mNenoGreen (mNG)绿色荧光蛋白和NanoLuc (NLuc)荧光素酶基因构建融合表达载体，优化原核表达条件后进行大量表达纯化；利用SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白FvSG7-mNG-NL的表达情况；利用免疫荧光分析融合蛋白与镰刀菌菌丝的结合特性；利用酶联免疫吸附测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)分析融合蛋白与镰刀菌抗原的结合能力。结果显示，融合荧光蛋白FvSG7-mNG-NL的原核表达载体构建成功，并实现可溶性高效表达。FvSG7-mNG-NL保留单链抗体、荧光素酶以及荧光蛋白的活性，可通过生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer， BRET）增强发光成像，为发展镰刀菌的灵敏快速免疫检测技术奠定了实验基础。

关键词：镰刀菌单链抗体荧光素酶融合蛋白免疫学检测

IDH1基因在肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其初步机制

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解放军医学杂志 2024年第2期49卷 194-203页

作者：林美佳雷宇清叶洲杰朱丽萍王心睿黄雄飞福建医科大学基础医学院病理学系福建福州350004 国家卫健委非人灵长类生育调节技术评价重点实验室/福建省妇幼保健院福建福州350000 福建医科大学妇儿临床医学院福建福州350004 福建省儿童医院心脏外科福建福州350011 福建省妇幼保健院福建福州350001 福建省儿童医院福建福州350011 福建医科大学附属医院福建省妇幼保健院医学研究中心福建福州350001 福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350108

目的探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)在肝内胆管癌(iCCA)细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其可能的分子机制。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IDH1基因敲除的HuCCT1细胞(HuCCT1^(IDH1-/-));CCK-8法和克隆形成实验检测IDH1野生型HuCCT1(Hu... 详细信息

目的探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)在肝内胆管癌(iCCA)细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其可能的分子机制。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IDH1基因敲除的HuCCT1细胞(HuCCT1^(IDH1-/-));CCK-8法和克隆形成实验检测IDH1野生型HuCCT1(HuCCT1^(WT))细胞和HuCCT1^(IDH1-/-)细胞的增殖能力;细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blotting检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。生物信息学方法分析上述两种HuCCT1细胞的转录组测序结果,Western blotting验证转录组信息通路相关蛋白的表达。结果与HuCCT1细胞比较,HuCCT1^(IDH1-/-)细胞增殖和克隆形成数目明显减少(P生物学过程;KEGG通路分析显示上述DEGs显著富集在Wnt、MAPK、Rap1、Hippo、TNF等与肿瘤细胞增殖和侵袭转移密切相关的信号通路。Western blotting验证结果显示,与HuCCT1^(WT)比较,HuCCT1^(IDH1-/-)细胞Wnt信号通路的Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论IDH1基因参与调控iCCA细胞HuCCT1的迁移、侵袭及EMT过程,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词：肝内胆管癌异柠檬酸脱氢酶1 细胞迁移细胞侵袭转录组

表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒的构建及鉴定

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国际病毒学杂志 2024年第1期31卷 22-27页

作者：邵云亭楼张蓉符军李山虎黄芳王芃吴成君大连理工大学医学部基础医学院 116024 山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 军事医学研究院生物工程研究所北京100850

目的构建表达HPV16E7基因的重组腺病毒质粒.方法设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段.分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒.利用ccdB正... 详细信息

目的构建表达HPV16E7基因的重组腺病毒质粒.方法设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段.分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒.利用ccdB正反筛选系统与ExoCET/Red重组结合将HPV16E7基因插入Ad4的E1A区,构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒pBR322-Ad4-E 1 Amut-C16E7P,经酶切、测序验证.提取质粒pBR322-Ad4-EIAmut-C 16E7P释放基因组,转染293T细胞以包装和扩增病毒,用病毒感染293T细胞,检测HPV16E7基因在细胞内的转录水平和蛋白表达.重组病毒经肌肉接种BALB/C裸鼠,收集小鼠血清用于病毒中和实验.结果成功构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒,并在293T细胞中成功包装出重组病毒.qRT-PCR和Western blotting验证了重组病毒HPV16 E7基因的成功表达,病毒中和实验结果提示经重组病毒免疫后的小鼠血清能够中和Ad4-HPV16E7.结论成功构建了表达HPV16E7基因的重组腺病毒株,为进一步研究HPV16 E7在癌症发病机制中的作用以及HPV感染相关癌症的治疗方法提供新的思路和依据,并且可能为HPV治疗性疫苗的研究探索提供了一种潜在策略.

关键词： HPV16 E7基因腺病毒重组病毒

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基于生物信息学分析的结直肠癌关键基因筛选

湖北医药学院学报 2024年第4期43卷 390-395,400页

作者：李珂云彭昇曹镐禄曾涵仪石圣成陈水亲万绍贵李珍妮张文娟赣南医科大学基础医学院江西赣州341000 赣南医科大学心脑血管疾病防治教育部重点实验室江西赣州341000 赣南医科大学第一临床医院江西赣州341000 赣南医科大学基础医学院分子病理学中心江西赣州341000

目的:筛选结直肠癌发生发展中的关键基因,并分析其与生存预后和肿瘤免疫浸润的关系。方法:从GEO数据库下载结直肠癌基因表达谱GSE178145。用R软件筛选结直肠癌组织与正常组织样本间的差异表达基因(DEGs),通过基因本体(GO)和京都基因与... 详细信息

目的:筛选结直肠癌发生发展中的关键基因,并分析其与生存预后和肿瘤免疫浸润的关系。方法:从GEO数据库下载结直肠癌基因表达谱GSE178145。用R软件筛选结直肠癌组织与正常组织样本间的差异表达基因(DEGs),通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析这些基因以确定它们的生物学作用。构建蛋白相互作用网络(PPI)鉴定结直肠癌进展的关键基因,然后通过GEPIA2数据库验证其表达水平及生存预后情况。最后利用TIMER数据库分析预后相关基因与免疫浸润细胞的相关性。结果:共筛选出897个DEGs。GO分析表明,DEGs主要集中在调控金属离子输运、离子通道活性、收缩纤维等过程。KEGG通路分析表明DEGs主要参与细胞因子-受体相互作用、钙信号传导等通路。通过PPI分析得到10个关键基因,使用GEPIA2数据库验证发现,其中CXCL2、IL-1β、CXCL10和UPS18的差异方向一致且有显著性差异。生存分析显示CXCL2和IL-1β延长结直肠癌患者的生存率。免疫浸润分析得出,CXCL2和IL-1β的表达与巨噬细胞的浸润相关。结论:CXCL2、IL-1β为结直肠癌发生发展中的关键基因,并与结直肠癌的生存预后和免疫浸润有关。

关键词：结直肠肿瘤生物信息学预后肿瘤浸润

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氟在口腔微生态作用中的研究进展

微生物学通报 2024年第10期 3836-3846页

作者：杨洁如吕文飞胡欢任群利王苗李小兰刘建国王倩遵义医科大学口腔医学院贵州省普通高校口腔疾病研究特色重点实验室遵义医科大学贵州省普通高校微生物资源与药物开发特色重点实验室

氟一直是被广泛使用的有效抗龋成分，氟离子能通过抑制微生物代谢关键酶的活性或改变细胞膜通透性来抑制细菌生长，显著抑制变异链球菌(Streptococcus mutans)等主要致龋菌，还能改变龋病患者的口腔微生物组结构。但长期过量使用氟会导... 详细信息

氟一直是被广泛使用的有效抗龋成分，氟离子能通过抑制微生物代谢关键酶的活性或改变细胞膜通透性来抑制细菌生长，显著抑制变异链球菌(Streptococcus mutans)等主要致龋菌，还能改变龋病患者的口腔微生物组结构。但长期过量使用氟会导致口腔耐氟菌株出现，降低氟化物防龋效果。随着高通量测序技术的进步，有助于学者们深入研究口腔微生物氟抗性的分子机制及氟对口腔微生态的影响。近年来氟与新型生物医用材料的联用为耐氟菌株提供了新的防治思路。本文围绕口腔微生物氟抗性的产生及其分子机制、氟对人口腔微生物组的影响，以及氟与新型材料联合运用等方面，对氟在口腔微生态中的影响及作用进行了全面综述，旨在为氟在口腔健康领域的进一步研究和应用提供理论基础。

关键词：氟抗菌机制口腔微生态氟抗性生物医用材料

构建慢病毒介导缺氧诱导因子HIF-1α在宫颈癌细胞中的表达及其对裸鼠移植瘤的作用

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中国病原生物学杂志 2024年第7期19卷 756-760,767页

作者：阿孜尔古丽·阿布都克日木马红白冰阿瓦汗·吐尔迪古丽仙·吐尔逊于涛新疆医科大学基础医学院新疆乌鲁木齐830017 新疆地方病分子生物学重点实验室中亚高发疾病发病机制与防治国家重点实验乌鲁木齐市沙依巴克区妇幼保健服务中心新疆医科大学附属肿瘤医院山东省寄生虫病防治研究所山东第一医科大学(山东省医学科学院)

目的探讨使用慢病毒载体介导的HIF-1α对裸鼠宫颈癌移植瘤生长、增殖和转移的影响,并寻找宫颈癌新的基因治疗靶点。方法采用慢病毒介导技术,分别在SiHa和C33a细胞中提高C33a细胞的HIF-1α表达,同时敲减SiHa细胞的HIF-1α表达。通过qRT... 详细信息

目的探讨使用慢病毒载体介导的HIF-1α对裸鼠宫颈癌移植瘤生长、增殖和转移的影响,并寻找宫颈癌新的基因治疗靶点。方法采用慢病毒介导技术,分别在SiHa和C33a细胞中提高C33a细胞的HIF-1α表达,同时敲减SiHa细胞的HIF-1α表达。通过qRT-PCR和Western blot技术验证慢病毒转染后HIF-1α表达的效率,并构建裸鼠移植瘤模型。从而验证HIF-1α表达改变对裸鼠体内肿瘤形成、增殖速度、肿瘤体积和肿瘤重量的影响及HIF-1α表达改变对肿瘤发展过程的影响。结果敲减和过表达HIF-1α的SiHa和C33a细胞分别注射于裸鼠左侧腋窝皮下,1周后形成肿瘤,4周后测量移植瘤体积。干扰HIF-1α的裸鼠移植瘤体积较对照组较小,两者差异具有统计学意义(P<0.05),即干扰HIF-1α对裸鼠瘤体的生长具有抑制作用;而HIF-1α过表达后,裸鼠移植瘤体积较对照组较大,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α的表达改变与宫颈癌细胞的增殖和恶化存在一定相关性,HIF-1α表达的改变可以调控肿瘤增殖过程。

关键词：宫颈癌缺氧诱导因子-1α 裸鼠皮下移植瘤模型稳定转染

青少年颈椎间盘突出症有限元模型建立及应力分析

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中国组织工程研究 2025年第3期29卷 448-454页

作者：赵宇昕亮亮金凤许阳阳康志杰方源和雨洁王星王海燕李筱贺内蒙古医科大学基础医学院人体解剖教研室内蒙古自治区呼和浩特市010010 内蒙古医科大学第一临床医学院内蒙古自治区呼和浩特市010010 内蒙古医科大学附属医院影像科内蒙古自治区呼和浩特市010010 长治市人民医院康复医学科山西省长治市046000

背景:颈椎间盘突出症可引起肩颈部疼痛、上肢放射性疼痛,发病率逐年上升并趋于年轻化,充分了解青少年颈椎生物力学特点,对于延缓青少年颈椎间盘突出症具有重要意义。目的:利用有限元分析技术重建正常青少年及青少年颈椎间盘突出症患者... 详细信息

背景:颈椎间盘突出症可引起肩颈部疼痛、上肢放射性疼痛,发病率逐年上升并趋于年轻化,充分了解青少年颈椎生物力学特点,对于延缓青少年颈椎间盘突出症具有重要意义。目的:利用有限元分析技术重建正常青少年及青少年颈椎间盘突出症患者的颈椎模型,分析C_(1)-T_(1)颈椎椎体活动度和纤维环、髓核、终板及小关节软骨的生物力学特征。方法:选择正常青少年和青少年颈椎间盘突出症患者各1例,将连续扫描的颈椎CT原始影像数据以DICOM格式导入Mimics 21.0,分别重建C_(1)-T_(1);随后将建立好的模型导入3-Matic软件进行椎间盘重建,将完善的模型导入Hypermesh软件,对椎体、髓核、纤维环、韧带进行网格划分,生成有效的几何模型,赋予材料属性后将最终模型导入ABAQUS软件中。观察C_(1)-C_(7)各节段颈椎椎体在不同工况下的关节活动度,并分析各节段颈椎纤维环、髓核、终板及小关节软骨的生物力学特征。结果与结论:(1)正常青少年与颈椎间盘突出症青少年患者颈椎模型C1在6种工况下的关节活动度均高于其他椎体,且正常青少年各节段颈椎椎体活动度均大于颈椎间盘突出症青少年患者;(2)正常青少年颈椎模型纤维环及髓核应力最大值在C_(2-3)左侧屈工况(0.43 MPa,0.17 MPa),颈椎间盘突出症青少年患者颈椎模型应力最大值在C_(7)-T_(1)左侧屈工况(0.54 MPa,0.18 MPa);(3)正常青少年颈椎模型终板应力最大值在C_(3)上终板左侧屈工况(1.46 MPa),颈椎间盘突出症青少年患者模型终板应力最大值在C7下终板左侧屈工况(1.32 MPa);(4)正常青少年颈椎小关节软骨应力最大值在C_(2-3)左旋转工况(0.98 MPa),颈椎间盘突出青少年患者的小关节软骨在不同工况下以C_(1-2)应力增加最明显,应力最大在左侧屈(3.50 MPa);(5)提示与正常青少年相比,颈椎间盘突出症青少年患者颈椎曲度改变,颈椎整体关节活动度下降;颈椎间盘突出症青少年患者纤维环、髓核及终板在C_(7)-T_(1)节段应力明显增大;C_(1-2)左侧小关节软骨应力明显,颈椎曲度异常可能是引起应力改变的主要因素。

关键词：青少年颈椎间盘突出症颈椎应力有限元分析生物力学

Y染色体短串联重复序列微流控芯片复合扩增检测体系研究

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生物化学与生物物理进展 2024年第3期51卷 696-705页

作者：王道宇万群庄斌赵丽健韩俊萍李彩霞中国人民公安大学侦查学院北京100038 山东第一医科大学基础医学院济南250000 北京博奥晶典生物技术有限公司北京101111 北京市公安局朝阳分局刑事侦查支队北京100025 公安部鉴定中心现场物证溯源技术国家工程实验室北京市现场物证检验工程技术研究中心北京100038

目的构建Y染色体短串联重复序列(Y-STR)微流控芯片扩增检测试剂,并进行性能验证,实现Y-STR基因座的快速全集成检测。方法使用Y-STR微流控芯片检测体系,对其灵敏度、成功率和分型准确率、峰平衡性、精准性和准确性、检材适应性、混合物... 详细信息

目的构建Y染色体短串联重复序列(Y-STR)微流控芯片扩增检测试剂,并进行性能验证,实现Y-STR基因座的快速全集成检测。方法使用Y-STR微流控芯片检测体系,对其灵敏度、成功率和分型准确率、峰平衡性、精准性和准确性、检材适应性、混合物检测能力和抗抑制性进行验证评估。结果DNA标准品9948的模板量≥8 ng,血卡片数≥3片以及口腔拭子刮擦次数≥7次时可获得Y-STR完整分型;165份样本的全集成检测成功率为91.52%,分型准确率为99.74%;不同荧光通道之间的峰高比值为89.81%;10次运行的等位基因分型标准品的片段大小标准差均在0.5 bp以内,20份样本全集成检测的等位基因片段和相应的等位基因标准品之间的片段准确性均在0.5 bp以内;能够对口腔拭子、血卡、唾液卡、烟蒂、血棉签、布片精斑等检材进行准确分型;混合样本中较小贡献者与较大贡献者在1∶3的比例时可获得完整基因分型;在不同浓度的腐殖酸(50~400 mg/L)、靛蓝(20~100 nmol/L)、血红蛋白(100~500μmol/L)等抑制物的干扰下,该体系可获得完整基因分型。结论该体系可应用于国产Quick TargSeq法医DNA现场快速检测系统使用,可在法医学实践中选用。

关键词：法医物证学微流控芯片 Y染色体短串联重复序列