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人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

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复旦学报（医学版） 2003年第5期30卷 409-413,F002页

作者：杨健王跃祥官孝群马春姑陶贤梅宋后燕复旦大学上海医学院细胞与遗传学系-教育部分子医学重点实验室上海200032

目的　构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体 ,转染人乳腺癌细胞株MDA MB 2 31,观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV30 4和MDA MB 2 31细胞增殖的影响。方法　应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA ,所得的目的片... 详细信息

目的　构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体 ,转染人乳腺癌细胞株MDA MB 2 31,观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV30 4和MDA MB 2 31细胞增殖的影响。方法　应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA ,所得的目的片段与真核表达载体 pcDNA3重组 ,构建重组质粒pcDNA3K5 ,脂质体法将其转染MDA MB 2 31,G4 18筛选阳性克隆 ,PCR鉴定 ,RT PCR和Westernblot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV30 4细胞 ,MTT法检测其增殖情况 ,并用MTT法检测转染 pcD NA3K5对MDA MB 2 31细胞增殖的影响。结果　构建的重组质粒 pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确 ,将其转染MDA MB 2 31后挑取的阳性克隆有 3个经PCR鉴定正确 ,并经RT PCR和Westernblot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV30 4细胞后 ,其存活率降低 ;转染 pcDNA3K5对MDA MB 2 31细胞增殖无明显影响。结论　应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA MB 2 31细胞后 ,其分泌产生的有生物学活性的K5 ,呈现对ECV30 4细胞增殖的抑制作用 ,而对MDA MB 2 31细胞的生长则无影响。

关键词：乳腺癌基因治疗重组新生血管生成抑制因子K5 基因表达真核表达载体构建活性鉴定

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BALB/c小鼠胸腺细胞发育模型的建立

复旦学报（医学版） 2005年第5期32卷 571-575页

作者：邵先安张瑞华蒋正刚孙志平储以微熊思东复旦大学上海医学院免疫学系-教育部分子医学重点实验室上海200032

目的建立胸腺细胞体外研究模型,为T细胞早期发育及相关实验提供有效技术平台。方法无菌摘取14.5天龄胚鼠胸腺,胸腺器官体外培养,FACS检测不同培养时间点细胞存活状况和表型变化,计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果胸腺体外培养显示:经... 详细信息

目的建立胸腺细胞体外研究模型,为T细胞早期发育及相关实验提供有效技术平台。方法无菌摘取14.5天龄胚鼠胸腺,胸腺器官体外培养,FACS检测不同培养时间点细胞存活状况和表型变化,计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果胸腺体外培养显示:经过6d的培养,胸腺细胞存活率均在88.0%以上,由双阴性发育至双阳性细胞,CD4+CD8+双阳性细胞由培养第0天的0上升到第6天的89.07%;细胞数量随胸腺发育(培养时间的增加)而增多,每个胸腺小叶胸腺细胞数量也由培养0d的0.75×104个上升到第6天的1.38×106个。而体内数据显示:胸腺细胞由胚龄14.5d的双阴性阶段发育到新生鼠的双阳性阶段,每个胸腺小叶细胞数量由14.5d的0.75×104个上升到新生鼠的2.56×106个,同时间段CD4+CD8+双阳性细胞比例由0上升到91.22%。体内、外胸腺细胞表型、数量变化趋势一致。结论体外培养状态下胸腺细胞数量和表型变化与体内自然变化趋势一致,在体外培养可以模拟体内胸腺细胞由双阴性到双阳性的发育过程,这将为T细胞发育的研究提供简易、有效的技术平台。

关键词：胸腺细胞双阳性双阴性模型

HIPK2在IL-2撤除诱导T细胞凋亡中的作用

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复旦学报（医学版） 2005年第6期32卷 631-635页

作者：邓富刚王缨熊思东储以微任学芳陈晓菁杨秀利复旦大学上海医学院免疫学系-教育部分子医学重点实验室上海200032

目的研究同源结构域相关的蛋白激酶2(homeodomain-interacting protein kinase2,HIPK2)在白介素2(interleukin2,IL-2)撤除诱导的T细胞凋亡中的表达及其作用。方法IL-2依赖性的T细胞株(CTLL-2),撤除IL-2后可诱导凋亡。运用PI染色和DNA凝胶电泳检测细胞凋亡,实时定量RT-PCR检测HIPK2及其他细胞凋亡相关基因的表达。通过反义技术下调HIPK2的表达,观察HIPK2在IL-2撤除诱导的T细胞凋亡中的作用。结果随IL-2撤除时间延长,CTLL-2细胞凋亡率增加,细胞基因组DNA发生了明显片段化。参与死亡受体凋亡途径的基因FasL和Fas表达没有明显改变(P>0.05),Bcl-2家族中促凋亡基因Bi m表达明显上调(P<0.01),抗凋亡基因Bcl-xL表达明显下调(P<0.05),HIPK2表达明显上调(P<0.05)。下调HIPK2的表达可以显著降低CTLL-2在IL-2撤除后的细胞凋亡率(P<0.01),促凋亡基因Bi m的表达被显著下调(P<0.01),而抗凋亡基因Bcl-xL明显上调(P<0.05)。结论HIPK2可以促进IL-2撤除诱导的CTLL-2T细胞凋亡,这种作用可能与HIPK2上调促凋亡基因Bi m和下调抗凋亡基因Bcl-xL的表达相关。

关键词：同源结构域相关的蛋白激酶2 白细胞介素2撤除凋亡

mB7AP-exCD40L融合蛋白的分子设计及其在Pichia pastoris中的表达和生物活性

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复旦学报（医学版） 2005年第4期32卷 401-406,F003页

作者：陈晋储以微邵先安任学芳张洪勇高海峰何球藻熊思东复旦大学上海医学院免疫学系-教育部分子医学重点实验室-上海基因免疫与疫苗研究中心上海200032

目的小鼠B7反义肽与小鼠CD40L胞外区融合蛋白(mB7AP-exCD40L)的分子模拟设计及其酵母表达体系的建立,研究其酵母表达产物的生物活性。方法分子模拟设计mB7AP-exCD40L;构建pPIC9K-mB7AP-exCD40L质粒并用电击法转化PichiapastorisGS115。W... 详细信息

目的小鼠B7反义肽与小鼠CD40L胞外区融合蛋白(mB7AP-exCD40L)的分子模拟设计及其酵母表达体系的建立,研究其酵母表达产物的生物活性。方法分子模拟设计mB7AP-exCD40L;构建pPIC9K-mB7AP-exCD40L质粒并用电击法转化PichiapastorisGS115。Westernblot鉴定融合蛋白的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)研究mB7AP-exCD40L对淋巴细胞增殖的影响。结果构建的重组Pichiapastoris实现了mB7AP-exCD40L的分泌表达,表达蛋白质的相对分子质量约2.6×103,对MLR具有抑制作用。结论分子模拟设计的mB7AP-exCD40L在Pichiapastoris表达体系成功表达,为进一步研究mB7AP-exCD40L在抗移植排斥反应中的作用奠定了基础。

关键词： pastoris 融合蛋白生物活性分子设计混合淋巴细胞反应重组Pichia Western 抗移植排斥反应酵母表达体系分子模拟淋巴细胞增殖相对分子质量 CD40L B7反义肽 GS115 表达产物 blot 分泌表达抑制作用胞外区电击法

真核化的原核表达系统增强HBV preS2/S基因免疫的效果

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中国免疫学杂志 2007年第1期23卷 6-10,15页

作者：袁志刚张进平王缨储以微徐薇熊思东复旦大学上海医学院免疫学系教育部分子医学重点实验室上海200032

目的研究真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒共表达体系与常规真核表达质粒相比在真核细胞中的表达差异;基因免疫小鼠诱生特异性体液免疫应答的能力及二者所诱生的抗体亚型的差异。方法运用分子生物学方法构建真核... 详细信息

目的研究真核化的原核表达系统——pCMV-T7pol/pT7IRES-HBs双质粒共表达体系与常规真核表达质粒相比在真核细胞中的表达差异;基因免疫小鼠诱生特异性体液免疫应答的能力及二者所诱生的抗体亚型的差异。方法运用分子生物学方法构建真核化的原核表达系统,将构建的质粒进行基因免疫,应用DOT-EIA和ELISA等检测其所产生的抗体水平。结果①真核化的原核表达系统在真核细胞中的表达能力明显强于常规真核表达质粒。②真核化的原核表达系统基因免疫小鼠不仅可诱生特异性体液免疫应答,且具有明显增强效应(P免疫应答,而且能够诱生更强的Th2型免疫应答(P免疫应答。

关键词：真核化的原核表达系统基因免疫 HBV

CXCL16在小鼠免疫性肝损伤中的作用及意义

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中华肝脏病杂志 2005年第4期13卷 282-285页

作者：徐焕宾龚燕萍蒋正刚刘瑞梓熊思东复旦大学上海医学院免疫系教育部分子医学重点实验室上海200032

目的研究CXCL16的表达对小鼠免疫性肝损伤中的作用及意义。方法建立卡介苗和内毒素诱导的小鼠肝损伤模型,通过实时定量聚合酶链反应和免疫组织化学分析CXCL16在肝组织中的表达变化,根据肝脏病理变化和免疫组织化学结果分析,比较CXCL16... 详细信息

目的研究CXCL16的表达对小鼠免疫性肝损伤中的作用及意义。方法建立卡介苗和内毒素诱导的小鼠肝损伤模型,通过实时定量聚合酶链反应和免疫组织化学分析CXCL16在肝组织中的表达变化,根据肝脏病理变化和免疫组织化学结果分析,比较CXCL16的表达水平和肝脏损伤程度的关系。从模型中各个时间点的肝损伤组织中分离浸润单核细胞,计算浸润的细胞数量变化,并进一步分析其中主要的CD4和CD8T淋巴细胞亚群的数量变化,研究CXCL16在肝脏炎症和损伤中的作用和意义。结果成功复制了小鼠免疫性肝损伤模型,发现在肝脏炎症和损伤中CXCL16表达水平显著上调,CXCL16的表达水平与肝脏损伤程度密切相关,肝脏组织浸润的单核细胞数量明显增加,淋巴细胞尤其是CD4+、CD8+T淋巴细胞数量也有明显的增加。结论小鼠肝脏损伤过程中CXCL16表达水平的增加与肝损伤程度密切相关,CXCL16趋化淋巴细胞浸润可能是导致肝脏损伤的重要机制之一。

关键词： CXCL16 小鼠免疫性肝损伤趋化因子类淋巴细胞

含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究

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复旦学报（医学版） 2005年第2期32卷 130-133页

作者：汪晓华童德妍徐焕宾熊思东复旦大学上海医学院免疫学系-教育部分子医学重点实验室-上海基因免疫与疫苗研究中心上海200032

目的　研制基于表位的SARS- CoV基因疫苗 ,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择。方法　通过网络数据库结合生物软件分析的方法 ,确定可能在SARS- CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位 ,以密码子... 详细信息

目的　研制基于表位的SARS- CoV基因疫苗 ,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择。方法　通过网络数据库结合生物软件分析的方法 ,确定可能在SARS- CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位 ,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率 ,构建了含多抗原表位的嵌合SARS- CoV基因疫苗。结果　多表位串联基因接入真核表达载体后 ,可在真核细胞内高效表达。多表位嵌合SARS -CoV基因疫苗免疫小鼠后 ,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应。结论　该基于多抗原表位的嵌合SARS- CoV基因疫苗可以诱导抗体应答 ,为该疫苗的深入研究奠定了基础。

关键词： SARS-CoV 多抗原表位基因疫苗免疫原性研究嵌合真核表达载体体液免疫反应网络数据库配伍选择减毒疫苗软件分析感染过程表达效率高效表达免疫小鼠融合蛋白抗体应答结构区抗原性密码子细胞内串联

SARS-Cov M蛋白的真核表达及其免疫原性研究

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复旦学报（医学版） 2005年第1期32卷 21-24页

作者：童德妍汪晓华郑秀娟关庆东熊思东复旦大学上海医学院免疫学系-教育部分子医学重点实验室-上海基因免疫与疫苗研究中心上海200032

目的初步研究SARS-Coy病毒M蛋白基因的真核表达效率和免疫原性为进一步的疫苗研究奠定基础。方法以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长M基因,分别克隆至pcDNA4-his／myc和pVAON33载体获得重组质粒pcDNA4-his／myc-M和pVAON33-M。... 详细信息

目的初步研究SARS-Coy病毒M蛋白基因的真核表达效率和免疫原性为进一步的疫苗研究奠定基础。方法以PCR方法在全病毒基因组文库中获得全长M基因,分别克隆至pcDNA4-his／myc和pVAON33载体获得重组质粒pcDNA4-his／myc-M和pVAON33-M。以Western Blot方法利用融合分子羧基段的myc表位检测pcDNA4-his／myc-M转染的293T细胞中M蛋白的真核表达。以ELISA方法检测pVAON33-M质粒基因免疫小鼠诱导产生特异性抗血清。结果pcDNA4-his／myc-M转染后48 h可检测到SARS-Cov M蛋白表达。 pVAON33-M基因免疫能够诱导产生M特异的体液免疫应答。结论本研究的结果表明SARS-Cov M蛋白可以在真核细胞中有效表达并有良好免疫原性,可以作为SARS-Cov疫苗研制的候选抗原之一。

关键词： M蛋白 SARS-Cov 真核表达免疫原性研究转染诱导 DNA 真核细胞克隆文库

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

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生物工程学报 2005年第2期21卷 182-186页

作者：袁志刚张进平储以微王缨徐薇熊思东复旦大学上海医学院免疫学系教育部分子医学重点实验室上海基因免疫与疫苗研究中心上海200032

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达... 详细信息

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。

关键词： T7 RNA聚合酶 T7启动子原核表达系统真核细胞