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秦川牛LRRN1基因表达分析及其对成肌细胞增殖分化的影响

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农业生物技术学报 2023年第7期31卷 1419-1429页

作者：宋贵兵贾鸿儒蒋蕾昝林森王洪宝西北农林科技大学动物科技学院国家肉牛改良中心

富亮氨酸重复序列神经元蛋白-1基因(leucine rich repeat neuronal protein-1, LRRN1)编码一种Ⅰ型跨膜蛋白，在神经发育与再生进程中发挥重要作用。牛成肌细胞的增殖分化直接影响其肌肉的生长发育，从而影响牛肉的产量。本研究旨在探究... 详细信息

富亮氨酸重复序列神经元蛋白-1基因(leucine rich repeat neuronal protein-1, LRRN1)编码一种Ⅰ型跨膜蛋白，在神经发育与再生进程中发挥重要作用。牛成肌细胞的增殖分化直接影响其肌肉的生长发育，从而影响牛肉的产量。本研究旨在探究LRRN1基因在秦川牛(Bos taurus)不同组织中的表达规律及其对牛成肌细胞增殖分化的影响，以确定其在成肌分化中的主要作用。首先采用q RT-PCR技术检测LRRN1在新生(3日龄)和成年(24月龄)秦川牛不同组织中的表达规律，及其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达特性；利用腺病毒介导的shRNA和pcDNA3.1(+)构建LRRN1基因干扰和过表达载体，转染秦川牛成肌细胞，采用EdU法检测细胞增殖，通过qRT-PCR和Western blot检测增殖标志分子的表达变化；经成肌诱导分化培养基作用后，观察肌管形成表型并检测分化标志分子的表达变化。结果显示，LRRN1在秦川牛各组织中广泛表达，在新生牛和成年牛肾脏和背最长肌中高表达；LRRN1基因表达在成肌分化过程中先升高、后降低，在分化4 d达到峰值，此后逐渐降低，与成肌细胞的体外分化进程具有相同的变化趋势。在成肌细胞中干扰LRRN1基因表达，结果显示，EdU染色的增殖细胞占比显著减少(P<0.05)，增殖标志基因CCNA2(P<0.01)、CCNB1(P<0.05)、PCNA(P<0.01)、CCND2(P<0.05)和CDK1(P<0.05)下调表达，CCND2、CDK1、CCNB1和PCNA蛋白表达量也降低；LRRN1过表达也显著抑制成肌细胞增殖(P<0.05),CCNA2(P<0.05)、CCNB1(P<0.01)、PCNA(P<0.01)和CCNE2(P<0.05)基因表达被抑制，CCNB1、PCNA与CDK1的蛋白表达量也降低。对细胞分化表型进行观察，发现LRRN1干扰抑制肌管形成，抑制分化标志基因MYOG(P<0.01)、MYF5(P<0.01)、MYF6(P<0.01)、MYH3(P<0.01)和CKM(P<0.05)的表达，MYOG、MYF5和MYH3的蛋白表达量也降低；LRRN1过表达则促进肌管形成，MYH3(P<0.01)、MYOD(P<0.05)、MYF5(P<0.05)和MYF6(P<0.05)的基因表达量显著升高，MYOD和MYH3的蛋白表达量也增加。上述结果提示，LRRN1是成肌细胞分化的正向调节因子，但是对成肌细胞增殖的作用尚需更全面和深入的研究。因此，LRRN1对秦川牛肌肉组织的生长发育具有潜在的调控作用，对其深入的功能研究可用于秦川牛的分子育种实践。

关键词：秦川牛富亮氨酸重复序列神经元蛋白-1基因(LRRN1) 成肌细胞细胞增殖分化

饲粮中添加茶皂素对秦川肉牛生长性能、血清指标及瘤胃原虫区系的影响

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中国畜牧杂志 2024年

作者：屈小鹏马婧邓嘉菡梁恩堂王巨泽王晓慧昝林森国家肉牛改良中心西北农林科技大学动物科技学院

本试验旨在研究饲料中添加不同水平茶皂素对秦川肉牛生长性能、血清指标及瘤胃原虫区系的影响。选取16头发育良好、体重（250±10）kg、14月龄的秦川肉牛，按照饲粮中茶皂素添加量的不同分为对照组、10 g/d茶皂素组、20 g/d茶皂素组、30... 详细信息

本试验旨在研究饲料中添加不同水平茶皂素对秦川肉牛生长性能、血清指标及瘤胃原虫区系的影响。选取16头发育良好、体重（250±10）kg、14月龄的秦川肉牛，按照饲粮中茶皂素添加量的不同分为对照组、10 g/d茶皂素组、20 g/d茶皂素组、30 g/d茶皂素组，每组4头，每头为1个重复。预试期10 d，正试期80 d。结果表明：茶皂素添加组平均日增重均高于对照组（P肉牛生长性能和抗氧化能力，降低瘤胃原虫数量，改变瘤胃原虫区系结构，以平均日增重为主要衡量指标并综合考虑其他指标，推荐添加量为20 g/（d·头）。

关键词：茶皂素血清指标瘤胃原虫秦川肉牛

m;A甲基化修饰相关酶基因在牛脂肪生成中的表达分析

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生物技术通报 2022年

作者：杨昕冉王建芳马鑫浩昝林森西北农林科技大学动物科技学院国家肉牛改良中心

探究参与m;A修饰的相关酶基因包括m;A甲基转移酶METTL3、METTL14、WTAP和m;A去甲基化酶FTO、ALKBH5，在牛不同组织以及前体脂肪细胞增殖和分化过程中的表达水平，为阐明m;A修饰在脂生成中的功能研究提供参考。使用实时荧光定量PCR技术... 详细信息

探究参与m;A修饰的相关酶基因包括m;A甲基转移酶METTL3、METTL14、WTAP和m;A去甲基化酶FTO、ALKBH5，在牛不同组织以及前体脂肪细胞增殖和分化过程中的表达水平，为阐明m;A修饰在脂生成中的功能研究提供参考。使用实时荧光定量PCR技术检测基因在新生和成年秦川肉牛不同组织，以及在前体脂肪细胞中的表达；采用CCK-8和油红O染色检测前体脂肪细胞的生长曲线及其成脂分化中的脂滴形成情况。5个基因均在骨骼肌中低表达，其余组织中高表达，而在成年牛脂肪组织的表达水平均显著高于新生牛（P<0.05）。分离的前体脂肪细胞具有良好的生长状态且可正常成脂分化。在牛前体脂肪细胞增殖期，METTL3、METTL14和WTAP的表达在前期下降，之后有所上升但仍维持较低的表达水平。FTO的表达呈缓慢上升趋势。ALKBH5在增殖前期上升，中期下降，在第4天后不断增加（P<0.01）。在前体脂肪细胞分化过程中，METTL3、METTL14和FTO的表达模式基本一致，在分化前期下降，中期高表达，随后降低。而WTAP和ALKBH5的表达随分化进行逐渐增加。结果表明m;A修饰对秦川牛脂肪发育和沉积具有潜在的重要作用，且m;A甲基化酶可能在体外调控牛前体脂肪细胞的脂生成。

关键词： m A m A甲基化酶牛前体脂肪细胞细胞增殖成脂分化

LRTN4RL1-AS通过miR-27a-3p靶向PPARγ调节奶牛乳腺细胞乳脂合成

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畜牧兽医学报 2023年第4期54卷 1465-1477页

作者：贾鸿儒杨超群王萌吴章情昝林森杨武才西北农林科技大学动物科技学院国家肉牛改良中心杨凌712100

旨在探究lncRNA-LRTN4RL1-AS/miR-27a-3p/PPARγ轴在奶牛乳脂合成中的作用及其调控机制。本研究以奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)为试验对象,对处理组与对照组进行3个生物学重复,通过实时荧光定量(real time ... 详细信息

旨在探究lncRNA-LRTN4RL1-AS/miR-27a-3p/PPARγ轴在奶牛乳脂合成中的作用及其调控机制。本研究以奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)为试验对象,对处理组与对照组进行3个生物学重复,通过实时荧光定量(real time quantitative PCR,RT-qPCR)、WB(Western blot)、油红O染色和甘油三酯检测、双荧光素酶报告等技术检测lncRNA-LRTN4RL1-AS对BMECs中甘油三酯积累及脂质合成相关基因表达量的影响,验证LRTN4RL1-AS-miR-27a-3p-PPARγ存在内源竞争RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)的靶向关系。结果表明,LRTN4RL1-AS主要在细胞质中表达,干扰LRTN4RL1-AS后显著抑制了BMECs的脂滴形成和甘油三酯积累(P<0.05),显著下调脂质合成相关基因CEBPα(P<0.01)、CEBPβ(P<0.01)和PPARγ(P<0.05)表达,且显著上调脂质分解基因HSL表达(P<0.05);双荧光素酶报告试验发现,转染mimics-miR-27a-3p,LRTN4RL1-AS突变型组荧光素酶活性显著高于LRTN4RL1-AS野生型组(P<0.01),证实LRTN4RL1-AS与miR-27a-3p之间存在靶向结合关系;共转染试验发现,inhibitor-miR-27a-3p逆转了干扰LRTN4RL1-AS对乳脂合成的抑制作用(P<0.05),同时降低了si-LRTN4RL1-AS对PPARγ基因的表达抑制。结果显示,LRTN4RL1-AS通过竞争性结合miR-27a-3p调控PPARγ表达来调节BMECs乳脂合成。

关键词：乳脂肪 lncRNA PPARγ miR-27a-3p

不同添加量的植物水解单宁对秦川肉牛血清生化指标和瘤胃消化指标、瘤胃微生物区系的影响

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动物营养学报 2022年第3期34卷 1642-1654页

作者：常玮学杨英超夏志军赵春平梅楚刚昝林森西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 国家肉牛改良中心杨凌712100

本试验旨在探究饲粮中添加植物水解单宁对秦川肉牛血清生化指标、瘤胃消化指标、瘤胃微生物区系的影响。选取20头健康状况良好、体重为(280±20)kg的秦川肉牛,随机分为5组,每组4头。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加3.22... 详细信息

本试验旨在探究饲粮中添加植物水解单宁对秦川肉牛血清生化指标、瘤胃消化指标、瘤胃微生物区系的影响。选取20头健康状况良好、体重为(280±20)kg的秦川肉牛,随机分为5组,每组4头。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加3.22、6.44、9.66、12.88 g/kg DM植物水解单宁,分别为试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组。预试期15 d,试验期30 d。结果表明:1)对照组血清中肌酐和尿酸的含量显著高于各试验组(P0.05)。3)对照组ACE指数、Chao1指数均显著高于试验组(P<0.05);添加植物水解单宁后Shannon指数逐渐下降。拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门相对丰富度占总菌门的92%以上。添加植物水解单宁后,试验组拟杆菌门相对丰度显著高于对照组(P<0.05),而对照组厚壁菌门相对丰度显著高于试验组(P<0.05)。试验组瘤胃菌群中瘤胃球菌属相对丰度极显著高于对照组(P<0.01),F082_unclassified菌属相对丰度显著高于对照组(P<0.05)。对照组瘤胃液中理研菌科RC9肠道群、琥珀菌属、乙酸糖发酵菌属、瘤胃球菌科_NK4A214、克里斯滕森菌科R-7肠道群相对丰度均极显著高于试验组(P<0.01)。对照组中伯克氏菌群相对丰度显著高于试验组(P<0.05)。由此可知,添加植物水解单宁能够有效提高蛋白质的吸收,提高秦川牛免疫力,降低瘤胃中甲烷杆菌的相对丰度,从而减少甲烷产量。

关键词：植物水解单宁秦川肉牛血清生化指标微生物区系

人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

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中国农业科学 2020年第18期53卷 3805-3817页

作者：田媛王力龙凤昝林森成功西北农林科技大学动物科技学院国家肉牛改良中心

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、... 详细信息

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子(LYZop22)和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体(pGL3-LYZcw/op22/op)和人溶菌酶过表达载体(pcDNA-LYZcw/op22/op),将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞(BFFC)和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子(RSCU>1.5)和7个低频密码子(RSCU0.05);而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍(P0.05),而LYZop则分别提高了22倍(P<0.01)和17.8倍(P<0.01),mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。

关键词：人溶菌酶牛乳蛋白基因密码子优化荧光素酶检测实时荧光定量PCR Western-blot

秦川牛MGP基因生物信息学分析及表达特性研究

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中国畜牧兽医 2024年第6期51卷 2261-2272页

作者：蒋蕾王玉鑫万媛昝林森王洪宝西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 国家肉牛改良中心杨凌712100

【目的】预测基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)的基本功能,揭示MGP基因在秦川牛中的组织表达规律以及在秦川牛前体脂肪细胞不同分化时期的表达特性,为进一步研究MGP基因对秦川牛脂肪发育调控的作用机制提供理论依据。【方法】运用... 详细信息

【目的】预测基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)的基本功能,揭示MGP基因在秦川牛中的组织表达规律以及在秦川牛前体脂肪细胞不同分化时期的表达特性,为进一步研究MGP基因对秦川牛脂肪发育调控的作用机制提供理论依据。【方法】运用生物信息学在线软件对多物种MGP蛋白进行相似性比对及系统进化树构建,并对牛MGP蛋白的理化性质、亚细胞定位等进行预测;使用油红O染色检验秦川牛前体脂肪细胞的分化效果;利用实时荧光定量PCR技术检测MGP基因在秦川牛不同组织中的表达情况,以及在前体脂肪细胞不同分化时期的表达特性。【结果】相似性比对结果显示,牛MGP蛋白与山羊的相似性最高(99%),与斑马鱼的相似性最低(31%)。系统进化树显示,牛和山羊的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远。MGP基因编码103个氨基酸;理论等电点为9.27,偏碱性;总平均疏水指数为―0.630,为亲水性蛋白;含有Sec/SPⅠ类型的信号肽,无跨膜结构,属于分泌蛋白;存在5个丝氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点,具有包含γ-羧基谷氨酸(Gla)的GLA_domain;二级结构中α-螺旋占比最高(55.34%)。油红O染色结果确定了分离培养的前体脂肪细胞分化效果良好。实时荧光定量PCR结果显示,MGP基因在秦川牛心脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在大肠和肾周脂肪中也有较高的表达水平,在小肠中的表达量显著低于其他组织(P<0.05);MGP基因在前体脂肪细胞不同分化时期呈现先升高后降低的表达趋势,在前体脂肪细胞诱导分化第2天的表达量显著高于其他时间点(P<0.05),第10天的表达量显著低于其他时间点(P<0.05)。【结论】试验预测了MGP蛋白基本的结构和功能;MGP基因在秦川牛心脏组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低;MGP基因在前体脂肪细胞不同分化时期表现出先升高后降低的表达趋势。

关键词：秦川牛 MGP基因组织表达前体脂肪细胞

Krüppel-Like Factor 3(KLF3)基因对牛脂肪沉积的作用

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中国农业科学 2019年第7期52卷 1272-1281页

作者：郭红芳宁越成功昝林森西北农林科技大学动物科技学院国家肉牛改良中心

【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇... 详细信息

【目的】通过研究牛KLF3基因对牛脂肪分化和脂肪酸代谢关键基因表达量的作用,进而探讨KLF3基因对脂质沉积的影响。【方法】合成干扰siRNA,筛选得到KLF3基因干扰效率最高SiRNA,分离培养秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪细胞生长至70%-90%汇合度时转染筛选得到的KLF3基因SiRNA和阴性对照SiRNA(NC),并进行诱导分化培养至第0天和第4天时,利用荧光定量PCR方法研究分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteinsα, C/EBPα),脂肪酸代谢关键基因脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylaseα, ACCα)和脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)基因在牛脂肪细胞分化不同时期干扰KLF3基因处理组和对照组之间表达量的变化,同时在干扰KLF3基因处理并进行诱导脂肪细胞分化的第4天采用油红O染色法观察干扰KLF3基因处理组和对照组之间脂滴差异及采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定甘油三酯含量进一步确定KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢的作用。【结果】KLF3-Si2具有最高的干扰效率达到73%。转染KLF3-Si2后PPARγ的表达量在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4天与对照组相比分别下调了58%和37%,达到了差异极显著(P<0.01),C/EBPα的表达量也分别下调了64%和41%,达到了差异极显著(P<0.01)。脂质代谢的关键基因FABP4的表达量与对照组相比在牛脂肪细胞诱导分化的第0天和第4天分别下调了89%和60%,而ACCα的表达量干扰KLF3处理组与对照组相比在脂肪细胞诱导分化第0天和第4天分别下调了50%和37%,而FAS的表达量则分别下调了73%和19%,都分别达到了差异极显著(P<0.01)。在牛脂肪细胞诱导分化第4天油红O染色和甘油三酯含量测定也发现干扰KLF3基因处理组与对照组相比脂滴减少,甘油三酯含量显著下降(P<0.05)。【结论】干扰牛KLF3基因可以抑制牛脂肪细胞分化和脂肪酸代谢关键基因表达量下调,进而影响脂肪的沉积。

关键词：秦川牛前脂肪细胞 KLF3 脂肪沉积

秦川肉牛PAI 1基因生物信息学分析及其对肌内脂肪细胞增殖和分化的影响

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中国畜牧兽医 2023年第5期50卷 1729-1741页

作者：张殿琦马鑫浩杨志梅梅楚刚昝林森西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 国家肉牛改良中心杨凌712100

【目的】对秦川肉牛纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)基因进行生物信息学分析,检测PAI 1基因在秦川肉牛不同组织中的表达水平并研究其功能,为秦川肉牛肌内脂肪沉积的分子育种提供理论依据。【方法】以分... 详细信息

【目的】对秦川肉牛纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)基因进行生物信息学分析,检测PAI 1基因在秦川肉牛不同组织中的表达水平并研究其功能,为秦川肉牛肌内脂肪沉积的分子育种提供理论依据。【方法】以分离自秦川肉牛背最长肌的肌内脂肪细胞为试验材料,PCR扩增PAI 1基因CDS区,对所获序列进行相似性分析及系统进化树构建,并通过生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和功能。通过实时荧光定量PCR检测PAI 1基因在秦川肉牛不同组织中的表达量。合成PAI 1基因siRNA并转染秦川肉牛肌内脂肪细胞,试验分为两组:对照组(NC)和干扰组(si-PAI1),通过EdU染色、CCK-8检测、流式细胞术、油红O染色观察表型变化,采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测转录和翻译水平标志基因(PCNA、CDK1、CCND2、PPARG、PLIN2、FABP4)的表达。【结果】试验成功扩增出PAI 1基因CDS区,大小为1054 bp。牛PAI 1基因氨基酸序列与水牛、山羊、人、小鼠、绵羊、黑猩猩的相似性分别为96.8%、95.8%、85.3%、76.9%、95.8%和85.3%。系统进化树表明,牛与水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远。生物信息学分析发现,细胞周期相关激酶参与了PAI 1基因的磷酸化修饰;PAI1蛋白二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;PAI 1基因启动子上游2000 bp存在成脂相关转录因子的结合位点。实时荧光定量PCR结果发现,PAI 1基因在秦川肉牛各组织中均有表达,其中在肾周脂肪中的表达量最高,在背最长肌中的表达量最低。干扰PAI 1基因后,与对照组相比,干扰组处于增殖期的细胞数量明显增多,CDK 1、PCNA和CCND 2基因mRNA表达水平极显著或显著上调(P<0.01;P<0.05),CDK1和PCNA蛋白表达水平明显增加。随着肌内脂肪细胞的分化,与对照组相比,干扰组脂滴数量明显增加,PPARγ、PLIN 2和FABP 4基因mRNA表达水平均极显著上调(P<0.01)。【结论】PAI 1基因在物种间的保守性较强,可能通过磷酸化和转录因子参与肌内脂肪细胞的增殖和分化,干扰PAI 1基因可促进肌内脂肪细胞的增殖和分化,提示该基因可能对肌内脂肪的沉积有重要的调控作用。

关键词：秦川肉牛 PAI 1基因生物信息学肌内脂肪细胞