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利用CRISPR／Cas9系统建立Xist基因敲除猪模型

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遗传 2016年第12期38卷 1081-1089页

作者：李国玲钟翠丽倪生刘德武蔡更元李紫聪杨化强吴珍芳华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多... 详细信息

体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多因素中,X染色体的异常失活是导致克隆效率低下的重要原因,而与X染色体失活密切相关的一个重要基因是Xist基因,这表明Xist基因可能直接或间接地影响猪的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系统为基础,在Xist基因上设计5个CRISPR/Cas系统打靶位点,并筛选出有效的Target 3、Target4 sg RNA,在细胞水平切割效率为1%和3%,在胚胎水平为75%和85.7%。同时将有效的sg RNA体外转录并显微注射至胚胎体内,发现Target 3和Target 4组合效果最好,敲除效率为100%。通过胞浆注射和胚胎移植方法生产出6头克隆猪,有2头活仔实现完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除猪模型,为后续通过敲除猪Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基础。

关键词： Xist CRISPR/Cas 克隆效率猪

亮氨酸对猪乳腺上皮细胞营养转运的影响及调控机制

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动物营养学报 2022年第3期34卷 1895-1907页

作者：朱鹏巍吴采池崔畅郑小雨马梓玮王俊张世海管武太陈芳华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

本试验采用猪乳腺上皮细胞作为体外模型探讨亮氨酸对乳成分合成的影响及其分子机制。分别用0(对照组)、1、5和10 mmol/L的亮氨酸处理猪乳腺上皮细胞24和48 h后,检测细胞活力,分析乳蛋白、氨基酸转运载体、葡萄糖转运载体及脂肪酸转运载... 详细信息

本试验采用猪乳腺上皮细胞作为体外模型探讨亮氨酸对乳成分合成的影响及其分子机制。分别用0(对照组)、1、5和10 mmol/L的亮氨酸处理猪乳腺上皮细胞24和48 h后,检测细胞活力,分析乳蛋白、氨基酸转运载体、葡萄糖转运载体及脂肪酸转运载体的基因表达情况,并进一步检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路中关键蛋白mTOR和核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)的表达和磷酸化情况以期探索体外亮氨酸调控乳成分合成的机制。结果显示:不同浓度亮氨酸处理48 h后细胞活力均较对照组显著提高(P0.05)。与对照组相比,1 mmol/L亮氨酸处理显著提高了S6K1的磷酸化水平(P0.05)。综上可知,在培养基中添加亮氨酸可提高猪乳腺上皮细胞活力,促进乳蛋白、氨基酸转运载体和脂肪酸转运载体基因的表达。

关键词：亮氨酸乳腺上皮细胞营养物质转运 mTOR通路

功能性氨基酸对猪胎盘血管生成及繁殖性能影响的研究进展

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动物营养学报 2022年第7期34卷 4117-4131页

作者：王舒琪罗瑾熹杜俊源谭成全华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

胎盘是介于胎儿与母体间的唯一连接器官,对胎猪发育和存活至关重要。妊娠期间胎猪所需的营养物质几乎均要经胎盘循环系统从母体获得,故胎盘血管管脉系统的正常网络化发育是母猪和仔猪之间营养传输的必要前提。胎盘血管发生和血管生成缺... 详细信息

胎盘是介于胎儿与母体间的唯一连接器官,对胎猪发育和存活至关重要。妊娠期间胎猪所需的营养物质几乎均要经胎盘循环系统从母体获得,故胎盘血管管脉系统的正常网络化发育是母猪和仔猪之间营养传输的必要前提。胎盘血管发生和血管生成缺乏或受阻会导致养分运输滞后,易引发宫内发育迟缓现象。功能性氨基酸是指不仅可作为蛋白质合成原料,还可通过调节机体的关键代谢通路以影响动物的生长发育、繁殖和免疫等诸多生理活动的氨基酸。已有研究报道功能性氨基酸可作为生物活性分子激活血管生成相关信号通路,促进胎盘血管网络化的形成。本文综述了胎盘血管生成对胎猪发育的影响及其关键调控因子,并且归纳总结了关键信号通路介导功能性氨基酸调控猪胎盘血管生成及繁殖性能的研究进展,旨在为靶向促进胎盘血管发育的功能性氨基酸在母猪生产中的开发利用提供参考。

关键词：胎盘血管生成宫内发育迟缓功能性氨基酸

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白消安处理消融猪内源精原干细胞的效果及外源精原干细胞移植

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华南农业大学学报 2021年第1期42卷 1-11页

作者：赵鑫邢萍萍张恒杨化强吴珍芳华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心广东广州510642

【目的】研究猪睾丸组织注射白消安消融猪内源精原干细胞(Spermatogonial stem cell,SSC)的效果,以及猪SSC同种异体移植后对内源性SSC消融受体生殖能力恢复的影响。【方法】采用3 mg/kg剂量的白消安对9头6周龄大白公猪进行睾丸注射,另外... 详细信息

【目的】研究猪睾丸组织注射白消安消融猪内源精原干细胞(Spermatogonial stem cell,SSC)的效果,以及猪SSC同种异体移植后对内源性SSC消融受体生殖能力恢复的影响。【方法】采用3 mg/kg剂量的白消安对9头6周龄大白公猪进行睾丸注射,另外3头注射2 mL二甲基亚砜作为对照。3周后,对试验组公猪以相同剂量进行第2次睾丸注射。第2次注射3周后,采集试验组和对照组公猪睾丸进行相关检测,评估内源性SSC消融情况。第2次白消安注射1个月后,以两步酶消化法处理5~7日龄大白仔猪睾丸分离得到睾丸单细胞悬液,并用明胶差速贴壁法进行纯化,纯化后以免疫荧光和流式细胞术分析SSC的纯度。异体移植SSC 4个月后,用微卫星标记检测受体公猪精液以及睾丸组织中供体来源SSC的存在。【结果】以3 mg/kg剂量的白消安处理大白公猪2次后,睾丸组织苏木精−伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,试验组睾丸曲细精管中各级生精细胞消融但其支持细胞结构完好,可以支持外源性SSC的定植及发育。免疫荧光以及流式细胞术结果表明,分离得到的睾丸单细胞悬液经纯化后UCHL-1阳性细胞占比由差速贴壁前的16.3%提高到了50.8%。苏木精−伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,猪SSC移植4个月后,移植组睾丸组织生精细胞恢复,在受体睾丸曲细精管基底膜上可检测到UCHL-1阳性SSC。受体睾丸组织的微卫星标记分析显示了供体SSC的存在,表明移植进入受体睾丸中的供体SSC可以在受体睾丸中定植存活超过4个月;精液微卫星标记未检测到供体来源的精子。【结论】以3 mg/kg剂量的白消安注射公猪睾丸能有效消融内源性SSC,可以用来制备SSC移植的受体猪。两步酶消化及明胶差速贴壁法可成功分离纯化猪SSC。猪SSC经同种异体移植后可以在受体睾丸中定植存活超过4个月。

关键词：猪精原干细胞白消安细胞移植精子发生

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轮毂式永磁直流测功机系统的研究

振动．测试与诊断 2016年第5期36卷 829-834页

作者：张铁民黄鹏焕黄沛盛黄翰梁莉华南农业大学工程学院/国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

轮毂电机性能好坏直接影响电动车性能,因此有必要对轮毂电机动态特性进行测试。笔者通过分析永磁直流测功机系统的工作原理,设计了框架式测功机结构,采用双万向联轴器联接发电机输出轴、转矩转速传感器和被测电机的输入轴,并通过一对外... 详细信息

轮毂电机性能好坏直接影响电动车性能,因此有必要对轮毂电机动态特性进行测试。笔者通过分析永磁直流测功机系统的工作原理,设计了框架式测功机结构,采用双万向联轴器联接发电机输出轴、转矩转速传感器和被测电机的输入轴,并通过一对外啮合齿轮副建立了发电机与被测电机的机械传输链。设计了基于脉宽调制信号的直流测功机系统加载电路,采用等效的模拟负载代替真实负载,构建了轮毂式永磁直流测功机系统。实验结果表明,该轮毂式直流测功机系统结构简单、控制容易、使用方便,满足了中小功率轮毂电机的动态特性测试的需要。

关键词：模拟负载测功机轮毂电机脉宽调制

基于音频特征和模糊神经网络的禽流感病鸡检测

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农业工程学报 2019年第2期35卷 168-174页

作者：张铁民黄俊端华南农业大学工程学院广州510642 华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

为了能在早期发现禽流感并进行预防,该文提出了一种基于音频特征和模糊神经网络的禽流感病鸡检测方法。依据获取的家禽音频和环境及其他噪声的谱熵差别大的特点,在复杂环境中分析并提取出鸡声,丢弃非鸡声段,对提取的鸡声进行分析及处理... 详细信息

为了能在早期发现禽流感并进行预防,该文提出了一种基于音频特征和模糊神经网络的禽流感病鸡检测方法。依据获取的家禽音频和环境及其他噪声的谱熵差别大的特点,在复杂环境中分析并提取出鸡声,丢弃非鸡声段,对提取的鸡声进行分析及处理,计算短时过零率、短时能量以及短时过零率与短时能量混合特征,用作判别患禽流感的病鸡和健康鸡的依据。利用T-S模糊神经网络,对提取出来的家禽音频特征进行训练和识别,试验表明隶属度函数为钟形函数、隶属度个数为2时模糊神经网络对试验提取的3个鸡声特征组成的3组测试集的敏感性分别为75.47%、80.39%和76.92%,特异性分别为80.85%、79.59%和72.92%,正确识别率分别为78%、80%和75%。该研究为规模化家禽养殖场及大型家禽流通市场的禽流感病禽识别提供一套快速、高效检测方法。

关键词：神经网络识别提取谱熵短时过零率短时能量鸡病检测

哺乳动物体细胞核移植表观遗传重编程研究进展

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遗传 2019年第12期41卷 1099-1109页

作者：杨旭琼吴珍芳李紫聪华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是唯一能赋予体细胞基因组全能性的生殖工程技术,对动物种质资源保存、畜牧业发展和生物医学研究等具有重大意义。尽管该技术已经取得了许多研究进展,但哺乳动物克隆胚胎的发育效率依... 详细信息

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是唯一能赋予体细胞基因组全能性的生殖工程技术,对动物种质资源保存、畜牧业发展和生物医学研究等具有重大意义。尽管该技术已经取得了许多研究进展,但哺乳动物克隆胚胎的发育效率依然很低,严重限制其在畜牧业和生物医学上的应用。导致克隆胚胎发育效率低的主要原因是体细胞重编程错误或重编程不完全,主要表现为:印记基因Xist表达异常、DNA甲基化异常,组蛋白修饰异常等。本文简要介绍了体细胞核移植技术,系统总结了哺乳动物克隆胚胎发育效率低的主要影响因素,以期为提升体细胞克隆效率相关研究与实践提供理论参考。

关键词：体细胞核移植 Xist DNA甲基化组蛋白修饰

木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达

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中国农业科学 2013年第22期46卷 4774-4783页

作者：张献伟张冠冠吴珍芳孟繁明刘德武张茂许卫华郑恩琴贺晓燕李真李紫聪华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心

【目的】构建木聚糖酶（XynB）与甘露聚糖酶（ManA）的融合酶基因,使其能在哺乳动物表达系统中表达并分泌兼有木聚糖酶和甘露聚糖酶活性的双功能融合酶。【方法】利用基因融合技术（SOE-PCR）,把11条Linker融合到木聚糖酶（XynB）和甘... 详细信息

【目的】构建木聚糖酶（XynB）与甘露聚糖酶（ManA）的融合酶基因,使其能在哺乳动物表达系统中表达并分泌兼有木聚糖酶和甘露聚糖酶活性的双功能融合酶。【方法】利用基因融合技术（SOE-PCR）,把11条Linker融合到木聚糖酶（XynB）和甘露聚糖酶（ManA）基因间,构建真核表达载体,经转染猪肾细胞（pK15）收集细胞培养液,用DNS法测定其酶活并进行酶学分析。【结果】经表达分析12条不同Linker构建的融合酶与亲本酶酶活,发现用Linker a3、pS3和具有"自我剪切"能力T2A构建的融合酶在木聚糖酶和甘露聚糖酶活性都显著高于两亲本酶。融合酶XynB-a3-ManA的木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活比亲本酶XynB和ManA分别提高了54.06%和104.40%;该融合酶在酸性环境3.0—7.0起作用,对pH3.0;.0具有一定的耐受力。【结论】首次获得可在哺乳动物系统表达分泌的增强型双功能XynB-ManA融合酶。

关键词：木聚糖酶甘露聚糖酶 Linker 融合酶酶活测定

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电动轮式畜禽巡检车负载驱动试验及分析

振动．测试与诊断 2019年第5期39卷 967-972,1129页

作者：张铁民张衡超陈辉梁莉华南农业大学工程学院广州510642 国家生猪种业工程技术研究中心广州510642

针对电动轮式小车的轮毂电机驱动控制及其稳定性问题,笔者采用嵌入式控制器和电流、速度双闭环控制方法,建立了轮毂电机的驱动控制系统。设计了电机驱动电路、速度检测电路、电流检测电路及过流过载保护电路,采用模糊自适应比例积分微分... 详细信息

针对电动轮式小车的轮毂电机驱动控制及其稳定性问题,笔者采用嵌入式控制器和电流、速度双闭环控制方法,建立了轮毂电机的驱动控制系统。设计了电机驱动电路、速度检测电路、电流检测电路及过流过载保护电路,采用模糊自适应比例积分微分(proportion integration differentiation,简称PID)控制算法,在测功机平台上模拟电动轮式小车在受突变负载时的实际运行状况,对该控制系统的稳定性进行试验与分析。试验结果表明:该小车启动稳定,在施加不同负载情况下能够维持稳定的速度运行,在过流过载情况下触发保护系统,防止电流过大烧毁硬件电路,进行堵转试验系统未出现故障。此驱动控制系统安全可靠,稳定性好,可为分析验证电动轮式小车驱动控制系统的稳定性提供参考。

关键词：驱动控制双闭环模糊自适应PID 稳定性分析