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右旋糖酐蔗糖酶的分子改造及其催化性能研究

右旋糖酐蔗糖酶的分子改造及其催化性能研究

2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会

作者：王育王超张洪斌合肥工业大学医学工程学院制药工程系

右旋糖酐蔗糖酶（dextransucase,EC2.***.5.1）是一种分泌型葡萄糖基转移酶,可以将蔗糖分子中的D-葡萄糖基转移到受体分子上,催化程度的差异性可以合成右旋糖酐（dextran）和低聚糖,同时伴有果糖的生成。本实验室已筛选出可产生右旋糖酐... 详细信息

右旋糖酐蔗糖酶（dextransucase,EC2.***.5.1）是一种分泌型葡萄糖基转移酶,可以将蔗糖分子中的D-葡萄糖基转移到受体分子上,催化程度的差异性可以合成右旋糖酐（dextran）和低聚糖,同时伴有果糖的生成。本实验室已筛选出可产生右旋糖酐蔗糖酶（dexYG）的明串珠菌,利用基因工程技术成功构建了dexYG+pET-28a重组质粒并且成功导入*** BL21（DE3）受体菌。本试验在空间结构模拟分析与前人研究的基础上,以dexYG+pET-28a为模板,采用定点突变技术和分子截短技术相结合的方法对右旋糖酐蔗糖酶（dexYG）改造进行探索。对右旋糖酐蔗糖酶基因（dexYG）的P473、P478、P856、K378、K725和K955进行了定点突变分别成P473S、P478S、P856S、K378T、K725T和K955T,然后进一步突变得到双突变和三突变株:P473S+P478S、P473S+P856S、P478S+P856S、P473S+P478S+P856S、K378T+K725T、K378T+K925T、K725T+K925T和K378T+K725T+K955T,以上突变株的成功获取均采用电泳和基因测序完成检测。获得的突变株相对于野生型酶活均略有提高,双突变与三突变的酶活提高比单突变明显。同时研究了右旋糖酐蔗糖酶（dexYG）的功能区域（催化域和结合域）,合理设计引物进行PCR扩增出两条DNA片段:1-3000bp（a）和201-3000bp（b）,将克隆出的两个DNA片段进行电泳检测和基因测序。DNA片段经过双酶切与pET-28a质粒进行重组,获得了两个重组质粒:dexYGa+pET-28a和dexYGb+pET-28a。将重组质粒转入*** BL21（DE3）受体菌中成功建立pET-28a+dexYGa/BL21和pET-28a+dexYGb/BL21表达体系。pET-28a+dexYGa/BL21体系能够表达出右旋糖苷蔗糖酶,以蔗糖为底物,用dexYG+pET-28a和dexYGa+pET28a表达出的右旋糖苷酶进行催化,利用液相均能检测出大分子右旋糖酐的生成。苷键检测发现改造后的右旋糖酐酶（dexYGa）催化产出的大分子右旋糖酐（α1→3）由5%的上升到16.6%,说明产出的右旋糖酐具有更多的支链。改造后的右旋糖酐蔗糖酶（dexYGb）并没有发现具有直接将蔗糖催化成大分子右旋糖酐的能力,然后当使用麦芽糖进行受体反应,利用液相检测发现出有果糖和寡糖的生成,说明发生了水解反应并进行寡聚糖的合成。在后基因组时代基于蛋白质家族中的海量数据分析,合理的分子改造将会成为右旋糖酐酶分子改造的重要方向,从而推动右旋糖酐蔗糖酶合成多样化右旋糖酐快速发展。

关键词：右旋糖酐蔗糖酶分子改造定点突变催化性能

二种真菌来源的右旋糖酐酶的分离纯化、酶学性质及其催化制备不同分子量右旋糖酐的研究

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二种真菌来源的右旋糖酐酶的分离纯化、酶学性质及其催化制备不同...

The Ninth National Symposium on Enzyme Engineering

作者：张洪斌甘微苇吴定涛胡雪芹合肥工业大学医学工程学院制药工程系

右旋糖酐酶(Dextranase,E.C.3.***.1.1 1)能够催化水解右旋糖酐中的α-1,6糖苷键,释放出异麦芽糖、异麦芽三糖等,该酶及其催化产物在食品、医药、化工等领域具有广泛用途。本研究成功从土壤中筛选出两株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001和F10... 详细信息

右旋糖酐酶(Dextranase,E.C.3.***.1.1 1)能够催化水解右旋糖酐中的α-1,6糖苷键,释放出异麦芽糖、异麦芽三糖等,该酶及其催化产物在食品、医药、化工等领域具有广泛用途。本研究成功从土壤中筛选出两株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001和F1002,通过菌株形态、培养特征以及ITS rDNA序列分析,确定F1001为棘孢青霉,F1002为哈茨木霉。随后对菌株F1001和菌株F1002发酵条件进行研究,确定两种菌株的最佳碳源为右旋糖酐T70,最佳氮源为NaNO;菌株F1001的最佳培养条件为培养基初始pH5.0,培养温度28℃,培养时间5天;菌株F1002的最佳培养条件为培养基初始pH6.0,培养温度28℃,培养时间6天。对F1001及F1002右旋糖酐酶分别进行硫酸铵盐析和Sepharose 6B凝胶色谱层析分离得到两种纯化后的右旋糖酐酶,F1001右旋糖酐酶从粗酶液到纯化产物共纯化了7.884倍,回收率为13.2%,纯化酶的比活力高达20608 U/mg;而F1002右旋糖酐酶从粗酶液到纯化产物共纯化了8.3倍,回收率为10.73%,纯化酶的比活力高达2782 IU/mg;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测得F1001右旋糖酐酶的分子量为66 kDa,F1002右旋糖酐酶分子量为62 kDa。随后对两种酶的酶学性质进行研究,两种右旋糖酐酶催化右旋糖酐的主产物均为异麦芽糖和异麦芽三糖,由此确定二者均属于内切右旋糖酐酶;F1001右旋糖酐酶的酶促反应最适温度为35℃,最适pH为5.0,最适底物为3%右旋糖酐T70,Cu和Zn对酶活有较强的促进作用,低浓度的Cu使酶活力提高到134.7%,Mtn对酶催化活力抑制作用较强;F1002右旋糖酐酶的酶促反应最适温度为25℃,最适pH为5.0,最适底物为5%右旋糖酐T70,Mg、Al、Zn对酶活具有促进作用,分别使活力提高到108.71%、110.20%、124.22%,Mn和Ca对酶活有较强的抑制作用。对棘孢青霉右旋糖酐酶的动力学研究表明,该酶对底物右旋糖酐的亲和力随着分子量的增大而增大,在同时存在两种分子量右旋糖酐的溶液中具有优先降解高分子量右旋糖酐的特点。在对右旋糖酐酶充分研究的基础上,结合本实验室已经制备的右旋糖酐蔗糖酶的催化功能,运用协同催化的机理,进行双酶协同催化不同分子量右旋糖酐的研究,制备三种不同分子量的药用右旋糖酐,即右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20,总收率为80.32%,其纯度、分子量分布和溶解度均优于临床使用产品;同时通过协同调控也可制备出高产率(73%)的低聚右旋糖酐(5719Da,7630Da,9831Da)和低聚异麦芽糖(聚合度DP 2-15)。本研究为新右旋糖酐酶的应用、酶法定向制备不同分子量右旋糖酐及功能性低聚糖提供了打下了基础。

关键词：右旋糖酐酶右旋糖酐右旋糖酐蔗糖酶低聚糖

生物医学工程专业(本科)教学实践基地的建设

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生物医学工程专业(本科)教学实践基地的建设

2007中国生物医学工程联合学术年会

作者：刘健陈强陈波高莉合肥工业大学电气与自动化工程学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化工程学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化工程学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化工程学院生物医学工程系

建立有利于培养学生实践能力和创新意识的实践教学体系、开发具有交叉学科特点的实验教学内容和方法,一直是本科专业建设中的难点和重点。本文介绍了我校几年来生物医学工程专业（本科）建设的基本思路和基本情况,并探讨了本专业教学实... 详细信息

建立有利于培养学生实践能力和创新意识的实践教学体系、开发具有交叉学科特点的实验教学内容和方法,一直是本科专业建设中的难点和重点。本文介绍了我校几年来生物医学工程专业（本科）建设的基本思路和基本情况,并探讨了本专业教学实践基地建设中的若干问题。

关键词：生物医学工程交叉学科培养方案教学实践基地

新的肝细胞生长因子HPPCn的表达、纯化及体外活性检测

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中国生物工程杂志 2007年第10期27卷 6-11页

作者：魏苹杜劭君崔春萍张达矜张霄翔吴祖泽合肥工业大学化学工程学院合肥230009 军事医学科学院辐射与放射医学研究所北京100850

目的:建立rhHPPCn在大肠杆菌中的表达体系,纯化表达产物并检测其体外生物活性。方法:以pUC18-HPPCn为模板,构建原核表达载体pET-24a(+)-HPPCn,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达目标蛋白,离子交换色谱法纯化目标蛋白,Westernblot分析其免... 详细信息

目的:建立rhHPPCn在大肠杆菌中的表达体系,纯化表达产物并检测其体外生物活性。方法:以pUC18-HPPCn为模板,构建原核表达载体pET-24a(+)-HPPCn,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达目标蛋白,离子交换色谱法纯化目标蛋白,Westernblot分析其免疫原性,MTT法和3H-TdR掺入法检测其体外活性。结果:成功构建出原核表达载体pET-24a(+)-HPPCn,并诱导使目标蛋白的表达量较高,表达产物中HPPCn23%以可溶形式存在,两步离子交换后可得纯度为94.2%,Westernblot鉴定为目的蛋白,MTT法和3H-TdR掺入法检测其具有明显的促肝癌细胞系增殖活性。结论:成功构建出原核表达载体并实现了目标蛋白高表达,两步离子交换法纯化出所需纯度的蛋白,并验证了其较强的体外促肝癌细胞系增殖活性。

关键词： HPPCn 原核表达阴离子交换层析肝癌细胞系增殖

浅谈工科院校生物医学工程专业生理学的课程建设

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医学信息 2009年第10期22卷 2007-2009页

作者：高莉刘健陈强合肥工业大学电气学院生物医学工程系

生理学是生物医学工程专业的一门核心基础医学课程,在工科院校生物医学工程专业开展生理学教学应注重体现课程的专业特色和自身特色。课程建设要结合本专业培养目标,建立合理的师资队伍、灵活选用教材,整合并及时更新教学内容、加强实... 详细信息

生理学是生物医学工程专业的一门核心基础医学课程,在工科院校生物医学工程专业开展生理学教学应注重体现课程的专业特色和自身特色。课程建设要结合本专业培养目标,建立合理的师资队伍、灵活选用教材,整合并及时更新教学内容、加强实验室建设,进而提高教学水平,为学生提供良好的学习平台。

关键词：生物医学工程生理学课程建设

脐带血检测对早产儿并发症预测作用的研究进展

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国际检验医学杂志 2024年第17期45卷 2141-2144页

作者：董志隆(综述) 黄华飞徐志国(审校) 南开大学生命科学学院天津300071 国家干细胞工程产品产业基地天津市脐带血库天津300384 嘉兴市妇幼保健院新生儿科浙江嘉兴314009 湖州学院生命健康学院制药工程系浙江湖州313000 协和华东干细胞基因工程有限公司浙江湖州313000

早产儿并发症发病率高,为新生儿健康带来严重的负面影响。然而,传统的检测方式难以满足早发现、早诊断、早治疗的临床需求。因此,发掘早产儿并发症的预测因素有着积极的临床意义。脐带血中含有各类丰富的生物标志物,且具备易获取、对婴... 详细信息

早产儿并发症发病率高,为新生儿健康带来严重的负面影响。然而,传统的检测方式难以满足早发现、早诊断、早治疗的临床需求。因此,发掘早产儿并发症的预测因素有着积极的临床意义。脐带血中含有各类丰富的生物标志物,且具备易获取、对婴儿无伤害等优势,是理想的检测标本。有很多研究探索了脐带血中的标志物单独或联合检测用于各类早产儿并发症的预测价值,以促进早产儿并发症的提前干预并改善疾病的预后。该文对脐带血检测用于预测各类早产儿并发症的作用进行了综述。

关键词：脐带血早产儿支气管肺发育不良脑室内出血

RP-HPLC法测定比格犬血浆中格列美脲的浓度

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中国药房 2009年第34期20卷 2671-2673页

作者：汤菁菁张霄翔高永良合肥工业大学化学工程学院制药工程系合肥市230009 军事医学科学院毒物药物研究所北京市100850

目的:建立反相高效液相色谱法测定比格犬血浆中格列美脲(GM)的浓度。方法:色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C8,柱温为30℃,流动相为乙腈-甲醇-10mmol·L-1磷酸二氢钾(65∶40∶95,pH7.2),流速为1.0mL·min-1,检测波长为227nm。以吉非罗齐为... 详细信息

目的:建立反相高效液相色谱法测定比格犬血浆中格列美脲(GM)的浓度。方法:色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C8,柱温为30℃,流动相为乙腈-甲醇-10mmol·L-1磷酸二氢钾(65∶40∶95,pH7.2),流速为1.0mL·min-1,检测波长为227nm。以吉非罗齐为内标,采用液-液萃取法预处理血浆样品,测定6只比格犬单剂量给予GM舌下喷雾剂(2mg)后不同时间点的血药浓度。结果:GM检测浓度线性范围为50～2500ng·mL-1,最低检出限为20ng·mL-1,日内和日间RSD均小于15%,萃取回收率为71.27%～103.5%,方法回收率为87.97%～98.95%。结论:本方法样品处理简单,灵敏度高,适合分析生物样品中的GM。

关键词：格列关脲比格犬血药浓度高效液相色谱法

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与时俱进,开创生物医学工程系的新局面

与时俱进,开创生物医学工程系的新局面

第六次全国生物医学工程教育研讨会

作者：宗仁鹤李国丽刘春叶运骅朱维勇刘良成李维华合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系

合肥工业大学电气与自动化工程学院于2000年10月提出开办生物医学工程专业的申请,经过校学术委员会的评估后上报教育部,于2001年3月获得教育部的批准, 并在2001年7月正式招收本科生,并在安徽省教育厅教学研究基金中立项（项目标号: 2001...

合肥工业大学电气与自动化工程学院于2000年10月提出开办生物医学工程专业的申请,经过校学术委员会的评估后上报教育部,于2001年3月获得教育部的批准, 并在2001年7月正式招收本科生,并在安徽省教育厅教学研究基金中立项（项目标号: 2001074）,以我校2001级学生为试点,开展交叉学科——生物医学工程专业的教学研究。本文基于国家产业结构调整,引发学科专业调整的政策,分析了面临的新形势和现状,着重介绍我校2002年度的教学研究工作及其成果,旨在与兄弟院校进行交流,吸取丰富营养。

关键词：

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交叉的边缘学科是新兴的学科增长点

光电子技术与信息 2003年第3期16卷 42-45页

作者：宗仁鹤李国丽刘春叶运骅朱维勇刘良成李维华合肥工业大学电气与自动化学院生物医学工程系安徽合肥230009

基于国家产业结构调整引发学科专业调整的政策,分析了面临的新形势和现状,以我校2001级学生为试点,进行交叉学科——生物医学工程专业的教学研究。结论为:交叉学科是新兴的学科增长点,生命科学类专业可能是继信息类专业后最热门的专业。

关键词：创新交叉学科生物医学工程