右旋糖酐蔗糖酶的分子改造及其催化性能研究
作者单位：合肥工业大学医学工程学院制药工程系
会议名称：《2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会》
会议日期：2015年
学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术]
摘 要：右旋糖酐蔗糖酶（dextransucase,EC2.***.5.1）是一种分泌型葡萄糖基转移酶,可以将蔗糖分子中的D-葡萄糖基转移到受体分子上,催化程度的差异性可以合成右旋糖酐（dextran）和低聚糖,同时伴有果糖的生成。本实验室已筛选出可产生右旋糖酐蔗糖酶（dexYG）的明串珠菌,利用基因工程技术成功构建了dexYG+pET-28a重组质粒并且成功导入*** BL21（DE3）受体菌。本试验在空间结构模拟分析与前人研究的基础上,以dexYG+pET-28a为模板,采用定点突变技术和分子截短技术相结合的方法对右旋糖酐蔗糖酶（dexYG）改造进行探索。对右旋糖酐蔗糖酶基因（dexYG）的P473、P478、P856、K378、K725和K955进行了定点突变分别成P473S、P478S、P856S、K378T、K725T和K955T,然后进一步突变得到双突变和三突变株:P473S+P478S、P473S+P856S、P478S+P856S、P473S+P478S+P856S、K378T+K725T、K378T+K925T、K725T+K925T和K378T+K725T+K955T,以上突变株的成功获取均采用电泳和基因测序完成检测。获得的突变株相对于野生型酶活均略有提高,双突变与三突变的酶活提高比单突变明显。同时研究了右旋糖酐蔗糖酶（dexYG）的功能区域（催化域和结合域）,合理设计引物进行PCR扩增出两条DNA片段:1-3000bp（a）和201-3000bp（b）,将克隆出的两个DNA片段进行电泳检测和基因测序。DNA片段经过双酶切与pET-28a质粒进行重组,获得了两个重组质粒:dexYGa+pET-28a和dexYGb+pET-28a。将重组质粒转入*** BL21（DE3）受体菌中成功建立pET-28a+dexYGa/BL21和pET-28a+dexYGb/BL21表达体系。pET-28a+dexYGa/BL21体系能够表达出右旋糖苷蔗糖酶,以蔗糖为底物,用dexYG+pET-28a和dexYGa+pET28a表达出的右旋糖苷酶进行催化,利用液相均能检测出大分子右旋糖酐的生成。苷键检测发现改造后的右旋糖酐酶（dexYGa）催化产出的大分子右旋糖酐（α1→3）由5%的上升到16.6%,说明产出的右旋糖酐具有更多的支链。改造后的右旋糖酐蔗糖酶（dexYGb）并没有发现具有直接将蔗糖催化成大分子右旋糖酐的能力,然后当使用麦芽糖进行受体反应,利用液相检测发现出有果糖和寡糖的生成,说明发生了水解反应并进行寡聚糖的合成。在后基因组时代基于蛋白质家族中的海量数据分析,合理的分子改造将会成为右旋糖酐酶分子改造的重要方向,从而推动右旋糖酐蔗糖酶合成多样化右旋糖酐快速发展。