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高通量测序技术：解决法医学疑难生物检材鉴定的关键工具

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中国法医学杂志 2024年第6期39卷 730-740页

作者：陈安琪张素华复旦大学法庭科学研究院

微量、降解与混合检材检验鉴定一直以来都是法医物证领域的难题。基于毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）的短串联重复序列（short tandem repeat,STR）检测是法医DNA检验的常规手段。然而，由于其可检测的遗传标记数量有限，... 详细信息

微量、降解与混合检材检验鉴定一直以来都是法医物证领域的难题。基于毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）的短串联重复序列（short tandem repeat,STR）检测是法医DNA检验的常规手段。然而，由于其可检测的遗传标记数量有限，在处理复杂和疑难检材时，效能常常受限。随着生物技术的不断革新，越来越多遗传标记借由以二代测序（next generation sequencing,NGS）以及三代测序技术为代表的高通量测序技术得以检测，并在疑难检材的基因分型中起到重要作用。本文综述了高通量测序技术在疑难生物检材中的主要检测手段及应用价值，展望了该检测技术未来的发展方向及应用前景。

关键词：法医遗传学疑难检材二代测序技术三代测序技术基因分型

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加工工艺对绿茶关键呈香成分的影响

食品科学 2023年第8期44卷 194-200页

作者：尤秋爽石亚丽朱荫杨高中严寒林智吕海鹏农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室中国农业科学院茶叶研究所浙江杭州310008 中国农业科学院研究生院北京100081

以龙井43茶树品种的一芽二叶鲜叶为原料,按照传统工艺分别加工成炒青、烘青、蒸青、晒青4类绿茶,继而采用搅拌棒吸附萃取结合气相色谱-嗅闻-质谱技术研究分析了加工工艺对绿茶关键呈香成分的影响。结果表明:从炒青绿茶、烘青绿茶、蒸青... 详细信息

以龙井43茶树品种的一芽二叶鲜叶为原料,按照传统工艺分别加工成炒青、烘青、蒸青、晒青4类绿茶,继而采用搅拌棒吸附萃取结合气相色谱-嗅闻-质谱技术研究分析了加工工艺对绿茶关键呈香成分的影响。结果表明:从炒青绿茶、烘青绿茶、蒸青绿茶、晒青绿茶样品中分别鉴定出了31、27、25、30种关键呈香成分,均以表现出花香、果香、青气特征的香气化合物为主;其中13种香气成分是4类绿茶共有的关键呈香成分,包括β-紫罗酮、萘、芳樟醇、芳樟醇氧化物I、香叶醇、1-辛烯-3-醇、2-庚酮、庚醛、己醛、乙酸叶醇酯、(E,E)-2,4-癸二烯醛、α-紫罗酮、苯乙醇。此外,研究表明,β-罗勒烯和(Z)-3-己烯基-α-甲基丁酸酯对炒青绿茶的香气品质有重要贡献,2-戊基呋喃、苯乙醛和α-松油醇对烘青绿茶的香气品质有重要贡献,而香叶基丙酮、γ-松油烯和α-柠檬醛对晒青绿茶的香气品质有重要贡献。研究结果有助于为揭示绿茶香气品质形成机理和研发绿茶香气品质定向加工调控技术提供参考依据。

关键词：绿茶关键呈香成分搅拌棒吸附萃取气相色谱-嗅闻-质谱加工工艺

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红小豆生物技术研究进展

生物技术通报 2013年第3期29卷 10-14页

作者：高义平董福双王海波河北省农林科学院遗传研究所植物转基因中心石家庄050051 保定市农业科学研究所保定071000

红小豆是一种重要的杂粮作物,其生物技术的研究和应用正逐步深入。从DNA水平和细胞水平对红小豆的生物技术研究进展进行综述,包括红小豆种质资源的分子鉴定、遗传图谱构建、基因的克隆与转化、组织培养研究等方面,并提出目前尚待研究的... 详细信息

红小豆是一种重要的杂粮作物,其生物技术的研究和应用正逐步深入。从DNA水平和细胞水平对红小豆的生物技术研究进展进行综述,包括红小豆种质资源的分子鉴定、遗传图谱构建、基因的克隆与转化、组织培养研究等方面,并提出目前尚待研究的问题及未来发展方向。

关键词：红小豆种质资源遗传图谱基因克隆组织培养

猪伪狂犬病毒变异株的分离鉴定及双重PCR诊断方法的建立

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猪伪狂犬病毒变异株的分离鉴定及双重PCR诊断方法的建立

作者：练斯南佛山科学技术学院

学位级别：硕士

猪伪狂犬病(porcine pesudorabies,PR)是由猪伪狂犬病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)引起的一种高度接触性传染病,它能引起怀孕母猪流产、产死胎和木乃伊,成年猪咳嗽、喘气、消瘦,哺乳仔猪出现神经症状、呕吐、拉稀等,该病对猪群... 详细信息

猪伪狂犬病(porcine pesudorabies,PR)是由猪伪狂犬病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)引起的一种高度接触性传染病,它能引起怀孕母猪流产、产死胎和木乃伊,成年猪咳嗽、喘气、消瘦,哺乳仔猪出现神经症状、呕吐、拉稀等,该病对猪群的健康危害很大。近年来,由于伪狂犬病毒变异株的流行,使得伪狂犬病的防控工作更加困难,许多免疫了 gE基因缺失苗的规模化猪场仍爆发该病。为了解广东省猪伪狂犬病野毒株的基因变异和遗传演化情况,并且开展伪狂犬病的快速检测方法的研究,以便于该病的防控,本论文进行了以下几个方面研究:1.广东省猪伪狂犬病毒的分离鉴定本实验从广东省佛山市的疑似发生伪狂犬病的某猪场采集病料,通过对病料组织的PRV-gE基因的PCR扩增,初步确定了该猪场为PRV感染。接着筛选出伪狂犬病毒阳性的组织病料作为分毒材料。将阳性病料接种在非洲绿猴肾细胞(Vero)上传代培养,通过对细胞培养液猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)、圆环病毒2型(Porcircovirus type 2,PCV2)的PCR检测,结果显示CSFV、PCV2和PRRSV的PCR扩增结果均为阴性,PRV的PCR扩增结果为阳性,说明从病料中分离到PRV毒株无这些病原体存在。分离的病毒在Vero细胞上盲传5代后,可引起细胞出现稳定的细胞病变,测定TCID50为10-7.5/0.1mL。接着对分离毒株进行电镜观察、小白鼠接种实验及gE基因序列测定、分析,进一步鉴定了该病毒为PRV,并命名为PRVFS-2015株。***-2015株的gE、gC和TK基因测序及分析对PRVFS-2015株的gE、gC和TK基因进行扩增及序列测定、分析。结果显示,FS-2015株的gE、gC和TK基因与国内外PRV参考毒株的核酸相似性在97.5%～99.7%、95.8%～100%和99.4%～100%,氨基酸的相似性在95.3%～99.7%、92.3%～100%和99.1%～100%。氨基酸变异位点分析表明FS-2015株的gE、gC和TK基因均有位点突变。遗传进化分析表明FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201,HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,亲缘关系近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和 SL株的亲缘关系较远,基因变异较大。3.伪狂犬病毒双重PCR检测方法建立本研究针对PRVgE和gB基因序列,分别设计了2对引物,经过PCR反应条件和体系的优化,最终建立了PRV的双重PCR检测方法。通过PCR特异性、灵敏性实验表明,该双重PCR检测方法对PRV能扩增出gE(316 bp)和gB(432 bp)目的片段,对其他参考毒株扩增结果均为阴性,对PRVgE和gB核酸检测的敏感性分别为3.3×103 copies/μL和4.4×103 copies/μL。应用本研究建立的双重PCR方法对80份病猪组织进行PRV检测,结果显示PRV野毒感染阳性率是45%。

关键词： PRV 分离鉴定 gE/gC/TK 双重PCR

应用rep-PCR分型技术筛选潜在治疗性乳杆菌

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生物工程学报 2011年第5期27卷 817-823页

作者：王江张瑞芬周莉苏小虎胡春红王萌向阳杨毅朱宝利冯涛重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室重庆400016 中国科学院微生物研究所北京100101 惠斯康健康科技(北京)有限公司北京100086 中国科学院大气物理研究所医务室北京100029 卫生部北京医院检验科生化室北京100730 北京协和医院妇产科北京100005

分离鉴定阴道弯曲乳酸杆菌并对其进行基因分型分析和产H2O2能力测定,初步筛选具有潜在防治女性生殖道感染的弯曲乳酸杆菌菌株。将健康妇女阴道分泌物接种到de Man,Rogosa and Sharpe(MRS)培养基,分离培养乳酸杆菌。通过16S rRNA序列进... 详细信息

分离鉴定阴道弯曲乳酸杆菌并对其进行基因分型分析和产H2O2能力测定,初步筛选具有潜在防治女性生殖道感染的弯曲乳酸杆菌菌株。将健康妇女阴道分泌物接种到de Man,Rogosa and Sharpe(MRS)培养基,分离培养乳酸杆菌。通过16S rRNA序列进行乳酸杆菌分类鉴定,重复序列片段PCR扩增方法进行弯曲乳酸杆菌的基因分型,并进一步采用pH直接测酸法和辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺与过氧化氢反应显色法检测了10株弯曲乳酸杆菌产酸和产H2O2能力。经过序列比对鉴定,共得到65株乳酸杆菌。其中,弯曲乳杆菌Lactobacillus crispatus 19株,詹氏乳杆菌Lactobacillus jensenii 17株,发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 12株;rep-PCR分型发现不同种类的乳酸杆菌和同一种弯曲乳酸杆菌均表现为不同的带型指纹图;10株弯曲乳酸杆菌均产酸,其中T22-3和T29-5两株弯曲乳酸杆菌产H2O2量最高。结果表明个体阴道内乳酸杆菌分布具有差异,弯曲乳酸杆菌具有种内多样性,产H2O2丰富的T22-3和T29-5两株弯曲乳酸杆菌有可能作为防治女性生殖道感染的有益菌株。

关键词：弯曲乳杆菌基因分型阴道菌群过氧化氢

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基于转录组鉴定天农麻鸡胴体性状关键基因

基于转录组鉴定天农麻鸡胴体性状关键基因

作者：赵迪佛山科学技术学院

学位级别：硕士

胴体性状是畜禽产肉效率的重要指标,是由微效多基因调控的复杂性状,具有中高遗传力。目前关于肉鸡胴体性状遗传基础的研究相对较少,其候选基因仍有待进一步挖掘。本研究以上市日龄天农麻母鸡为试验素材,基于转录组表达谱筛选胴体性状的... 详细信息

胴体性状是畜禽产肉效率的重要指标,是由微效多基因调控的复杂性状,具有中高遗传力。目前关于肉鸡胴体性状遗传基础的研究相对较少,其候选基因仍有待进一步挖掘。本研究以上市日龄天农麻母鸡为试验素材,基于转录组表达谱筛选胴体性状的关键基因,结合表达量与全基因组重测序鉴定关键位点,为阐明影响肉鸡胴体性状的关键功能基因和变异位点提供参考。试验一:利用转录组表达谱筛选胴体性状关键基因。以399只126日龄天农麻母鸡为研究对象,测定活重、屠体重(率)、全净膛重(率)等7个性状,采集胸肌组织进行转录组测序。通过关联分析(线性混合模型、套索算法、弹性网络和岭回归)、加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)和差异表达分析筛选到全净膛重性状的关键基因丝氨酸蛋白酶抑制剂家族B成员6(Serpin family B member 6,SERPINB6),全净膛率性状的关键基因ANTXR1、COL18A1、FBLN1、HHIP和OGN,通路富集分析进一步筛选到TGF-β信号通路等,这6个关键基因和通路与肌肉、骨骼生长发育显著相关。试验二:不同群体验证关键基因差异表达。基于天农麻鸡胴体性状高低组(50:50)分析发现SERPINB6等5个关键基因极显著差异表达(P市日龄全净膛重和基因表达量时,黄羽肉鸡全净膛重极显著低于白羽肉鸡,黄羽肉鸡表达量也极显著低于白羽肉鸡。该基因可作为影响全净膛重的关键基因。试验三:全净膛重性状关键基因的eQTL分析。对试验群体进行全基因组重测序,利用SERPINB6基因的m RNA表达量进行eQTL分析,并提取该关键基因的全部SNP与胴体表型进行关联分析,均鉴定到2个SNPs(rs317934171和rs14200392)对全净膛重有显著影响,分别能解释遗传变异的2.09%和1.91%。仅rs317934171位点转录因子结合发生变化,且预测到gga-mi R-1615作用于该位点。进一步利用双荧光素酶报告系统检测到该位点显著增强SERPINB6基因的启动子活性,表明rs317934171可作为影响全净膛重的关键变异位点。综上所述,通过转录组的差异表达分析和eQTL分析等,鉴定到全净膛重关键基因SERPINB6,以及基因3'UTR区域与转录因子Adf-1结合的rs317934171位点,该位点显著增强启动子活性。

关键词：天农麻鸡全净膛重 SERPINB6 eQTL

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亚麻籽饼粕中支链氨基酸的初步制备研究

亚麻籽饼粕中支链氨基酸的初步制备研究

作者：冯结铧佛山科学技术学院

学位级别：硕士

亚麻籽饼粕是亚麻籽榨油后的副产物,其蛋白质含量丰富,占饼粕总重量的30%以上。目前,其常作为动物饲料或当成废弃物处理,其蛋白质资源不仅未得到充分的利用且给环境增加了一定的负担。亚麻籽饼粕中氨基酸种类齐全,含有人体所需的8种必... 详细信息

亚麻籽饼粕是亚麻籽榨油后的副产物,其蛋白质含量丰富,占饼粕总重量的30%以上。目前,其常作为动物饲料或当成废弃物处理,其蛋白质资源不仅未得到充分的利用且给环境增加了一定的负担。亚麻籽饼粕中氨基酸种类齐全,含有人体所需的8种必需氨基酸,其中支链氨基酸(BCAAs)含量占总氨基酸15%左右。BCAAs是机体内重要的能源物质,具有多种生理功能,其在食品、医药领域应用广泛,极具市场价值。而目前BCAAs的生产多采用微生物发酵法,尚未见从植物原料中提取制备的BCAAs的相关报道。鉴于亚麻籽饼粕中含有较丰富的BCAAs,因此,本文选定亚麻籽饼粕为原料,初步探究了从中提取蛋白质、进一步水解蛋白质制备支链氨基酸的方法,以期为充分利用亚麻籽蛋白资源,尤其为支链氨基酸相关产品开发奠定科学基础。主要研究结果如下:(1)测定了亚麻籽饼粕基本营养成分的含量,结果表明,亚麻籽饼粕中BCAAs占总氨基酸含量的17.35%,提示亚麻籽饼粕是BCAAs的较好原料来源。(2)采用碱溶酸沉法提取亚麻籽饼粕粗蛋白,考察了p H、料液比(w/v)、提取温度和提取时间4个单因素对粗蛋白提取率的影响。在单因素试验的基础上,通过正交试验优化亚麻籽粗蛋白提取工艺,得到最佳工艺:p H 9.5、料液比1∶35(v/w)、提取温度55℃、提取时间2.0 h,验证试验测得该工艺下粗蛋白提取率达到53.96%。(3)采用超声辅助酶法对亚麻籽粗蛋白进行水解,探究了超声频率、加酶量、p H、水解温度和水解时间5个单因素对亚麻籽粗蛋白水解效果的影响。在单因素试验的基础上,设计Box-Behnken响应面分析试验,优化亚麻籽粗蛋白水解工艺,得到最佳水解工艺:超声频率6463.29 Hz,酶添加量3.47%,p H 9.40,水解温度47.60℃。在实际操作中将工艺参数调整为:超声频率6500 Hz,酶添加量3.5%,p H 9.4,水解温度45℃,此时水解度达到31.72%,与预测值的相对误差为0.72%,说明该响应面模型准确有效。(4)初步探究了薄层层析法分离鉴定亚麻籽粗蛋白水解液中BCAAs的方法,确定了最佳展开剂比例为正丁醇-丁醋酸-水:5∶2∶3,可有效实现BCAAs的分离鉴定。(5)采用膜分离技术对亚麻自粗蛋白水解液中的氨基酸进行分离纯化,收集不同截留分子量(4000 Da、2000 Da、1000 Da、500 Da、200 Da)超滤、纳滤膜过滤后的样品透过液,采用高效液相色谱法进行氨基酸分析,结果显示,500 Da的滤膜对BCAAs的富集效果最佳,此时透过液中的总游离氨基酸含量为4.644 mg/m L,BCAAs的含量为1.349 mg/m L,BCAAs提取率为29.85%。

关键词：亚麻籽饼粕饼粕亚麻籽饼粕蛋白支链氨基酸提取

HPLC-UV-FTICRMS/MS^n法分离鉴定葛根素原料药中4种有关物质

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质谱学报 2010年第3期31卷 143-151页

作者：王鹏远吴彩胜吴松张金兰中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

采用高效液相色谱-紫外检测器-傅里叶变换离子回旋共振质谱(HPLC-UV-FTICRMS/MSn)技术获得了葛根素及其有关物质的MSn和HRMS数据,分析其可能的裂解机制,推断有关物质的结构,并依据HRMS数据确证了有关物质及其部分碎片的分子组成,最终鉴... 详细信息

采用高效液相色谱-紫外检测器-傅里叶变换离子回旋共振质谱(HPLC-UV-FTICRMS/MSn)技术获得了葛根素及其有关物质的MSn和HRMS数据,分析其可能的裂解机制,推断有关物质的结构,并依据HRMS数据确证了有关物质及其部分碎片的分子组成,最终鉴定葛根素原料药中4种有关物质,其准分子离子峰[M+H]+分别为m/z433.112 95、433.112 92、417.118 01和417.118 01,通过质谱裂解机制研究以及与文献数据的对比,推测它们的结构分别为3’-羟基葛根素、染料木素-8-C-葡萄糖苷、新葛根素B和新葛根素A。

关键词：葛根素电喷雾电离(ESI) 傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS) 结构鉴定

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长期保护性耕作对丛枝菌根真菌多样性的影响

中国生态农业学报 2018年第7期26卷 1048-1055页

作者：张贵云张丽萍魏明峰刘珍范巧兰吕贝贝姚众柴跃进山西省农业科学院棉花研究所运城044000 山西省临汾市农机局临汾041000

为了明确我国北方干旱地区长期保护性耕作以及深松对丛枝菌根真菌(AMF)多样性的影响,笔者于2014年在山西省临汾市连续22年实施保护性耕作的长期定位试验基地,针对免耕覆盖(NTS)、深松免耕覆盖(SNTS)及传统耕作(TT)3种处理方式,进行了不... 详细信息

为了明确我国北方干旱地区长期保护性耕作以及深松对丛枝菌根真菌(AMF)多样性的影响,笔者于2014年在山西省临汾市连续22年实施保护性耕作的长期定位试验基地,针对免耕覆盖(NTS)、深松免耕覆盖(SNTS)及传统耕作(TT)3种处理方式,进行了不同耕作条件下土壤AMF物种丰度、孢子密度、Shannon多样性指数以及AMF侵染率等因素的比较研究。结果显示,长期保护性耕作(NTS和SNTS)共分离鉴定出AMF 7属9种,其中根孢囊霉属(Rhizophagus)和斗管囊霉属(Funneliformis)各2种,球囊霉属(Glomus)、近明球囊霉属(Claroideoglomus)、无梗囊霉属(Acaulospora)、硬囊霉属(Sclerocystis)和隔球囊霉属(Septoglomus)各1种;而传统耕作(TT)共分离鉴定出AMF 6属8种,没有检测到无梗囊霉属。NTS、SNTS和TT处理在不同土层的AMF优势种基本一致,0~40 cm土层为摩西斗管囊霉(***)和变形球囊霉(***),40~80 cm土层为摩西斗管囊霉、变形球囊霉和聚丛根孢囊霉(***),80~120 cm土层为聚丛根孢囊霉,120 cm土层以下只有NTS和SNTS处理中存在聚丛根孢囊霉,说明保护性耕作措施促进了AMF向土壤深层发展。NTS和SNTS处理在同一土层的AMF物种丰度、孢子密度和Shannon多样性指数均高于TT处理,SNTS处理高于NTS处理。同一耕作措施不同土层的AMF物种丰度、孢子密度和Shannon多样性指数均随土层加深而逐渐降低;NTS和SNTS处理在小麦各生育期的丛枝侵染率和孢子密度均高于TT处理;各处理在小麦拔节期的AMF侵染率最高,分别为14.9%、16.1%和10.6%,而在收获期的土壤孢子密度最高,分别为111.7个·(100g)^(-1)、125.0个·(100g)^(-1)和90.3个·(100g)^(-1)。研究认为,长期免耕覆盖、尤其深松免耕覆盖,提高了AMF多样性。该研究结果可为中国北方旱作农田生态系统中AMF自然潜力的充分发挥,以及保护性耕作技术的合理应用提供科学依据。

关键词：丛枝菌根真菌(AMF) 免耕深松物种丰度多样性侵染率孢子密度