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基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

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江西农业大学学报 2024年第4期46卷 991-1000页

作者：王宝鑫张文华董霞郑好张晶陈洪波周傲武汉轻工大学动物科学与营养工程学院/动物遗传繁育与精准养殖实验室湖北武汉430023 湖北省家畜种业技术创新中心湖北武汉430023

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设... 详细信息

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA,连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞,筛选单克隆细胞,结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定,进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21-SIRT3-KO),并以流感病毒A/WSN/33为研究对象,感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞,利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平,初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示,在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中,SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失,并导致移码突变;同时,利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达,结果显示与野生型细胞相比,3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白均不表达;流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现,敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系,并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。

关键词：猪肺泡巨噬细胞系 SIRT3 CRISPR/Cas9 炎症反应抗病育种基因编辑

4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

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中国畜牧兽医 2024年第4期51卷 1651-1659页

作者：杨雅琼程鸿星梁明霞刘玉兰付书林张晶陈洪波任红艳郭玲晁哲武汉轻工大学动物科学与营养工程学院动物遗传繁育与精准养殖实验室武汉430023 海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口570312 武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室武汉430023 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室武汉430070

【目的】验证候选基因在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据。【方法】选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为... 详细信息

【目的】验证候选基因在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据。【方法】选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为对照组和GPS组,GPS组仔猪腹腔注射1 mL 2×109 CFU/mL副猪嗜血杆菌SH0165菌液,对照组仔猪腹腔注射等量生理盐水,7 d后采集仔猪脑组织提取DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR检测4个候选基因(LYPD1、PITPNM1、SYP、ACVR1B)的mRNA表达量,并利用重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测副猪嗜血杆菌感染前后4个基因在仔猪脑组织中的DNA甲基化变化。【结果】本研究成功将MSP方法应用于基因的DNA甲基化测序研究,使其不局限于定点检测甲基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,GPS组仔猪LYPD 1、PITPNM 1、SYP、ACVR 1 B基因mRNA表达均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01)。DNA甲基化测序结果显示,除ACVR 1 B基因外,各基因DNA甲基化均上调。【结论】除ACVR 1 B基因外,LYPD 1、PITPNM 1、SYP 3个基因DNA甲基化与mRNA表达水平呈反向关联调控,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织DNA甲基化变化对4个候选基因的表达具有不同的调控模式。

关键词：副猪嗜血杆菌 LYPD 1基因 PITPNM 1基因 SYP基因 ACVR 1 B基因 DNA甲基化

动物免疫学线上线下混合式教学融入课程思政的方法及实践

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中国免疫学杂志 2024年第3期40卷 621-625,635页

作者：李海花李留安胡烨丁巧玲赵瑞利邵华天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300384

目的:在动物免疫学课程中真正实现思想政治教育和专业教育的深度融合,有效提升学生的综合素质。方法:实验采用了动物免疫学线上线下混合式教学融入课程思政的教学方法,对课程设计理念、教学目标、教学设计和教学实施进行研究,并且从成... 详细信息

目的:在动物免疫学课程中真正实现思想政治教育和专业教育的深度融合,有效提升学生的综合素质。方法:实验采用了动物免疫学线上线下混合式教学融入课程思政的教学方法,对课程设计理念、教学目标、教学设计和教学实施进行研究,并且从成绩和思政效果对教学成效进行评价。结果:表明该新型教学模式能够激发学生的学习兴趣,有助于提高学生考试成绩和综合能力的培养。结论:该方法教学效果良好,实现了立德树人的根本任务。

关键词：动物免疫学线上线下教学课程思政教育内涵式发展课程设计学生素质教育

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利用冷冻干燥法制备四烯雌酮固体分散体

畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4131-4140页

作者：朱珍珍刘大虎杨升天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392

本研究旨在制备四烯雌酮(altrenogest,ALT)固体分散体,提高四烯雌酮的溶解度及其生物利用度,为其在实际生产中的应用提供参考依据。以聚乙烯吡洛烷酮K30(polyvinyl pyrrolidone k30,PVPK30)为药物载体,叔丁醇为冻干溶剂,冷冻干燥法制备... 详细信息

本研究旨在制备四烯雌酮(altrenogest,ALT)固体分散体,提高四烯雌酮的溶解度及其生物利用度,为其在实际生产中的应用提供参考依据。以聚乙烯吡洛烷酮K30(polyvinyl pyrrolidone k30,PVPK30)为药物载体,叔丁醇为冻干溶剂,冷冻干燥法制备四烯雌酮固体分散体。以固体分散体体外溶出度为评价指标对所得ALT固体分散体的质量进行评估,采用X射线衍射法(X-ray diffraction,XRD)、同步热分析法(simultaneous thermal analysis,TG-DSC)、傅里叶红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)、扫描电镜法(scanning electron microscopy,SEM)等方法来描绘其特性,并研究其在体外的溶出规律。结果显示,四烯雌酮固体分散体最优制备工艺为药载比1∶8,叔丁醇浓度为50%,超声时间80 min。固体分散体在pH为7.4的PBS缓冲液中的平衡溶解度为原料药的5.91倍,1∶8混合物的3.65倍,固体分散体6 h体外累积溶出率为89.09%,ALT原料药和物理混合物的累积溶出率为32.94%、28.93%。综上所述,此方法制备的固体分散体能够有效提高四烯雌酮原料药的溶解度。

关键词：四烯雌酮冷冻干燥法固体分散体溶解度

非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡胸腺细胞的转录组学分析

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中国农业大学学报 2024年第9期29卷 122-134页

作者：廖艳鹏曾宇航经岱昀任超天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392

为研究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(Nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs,NRTUAs)在转录组水平对雏鸡胸腺的免疫调节作用,本研究以接种NRTUAs虫株3 d的雏鸡为试验对象,利用RNA-seq技术对其胸腺组织进行转录组测序以挖掘其... 详细信息

为研究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(Nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs,NRTUAs)在转录组水平对雏鸡胸腺的免疫调节作用,本研究以接种NRTUAs虫株3 d的雏鸡为试验对象,利用RNA-seq技术对其胸腺组织进行转录组测序以挖掘其中的差异表达基因(DEGs),进而对得到的DEGs进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析和蛋白互作网络分析。结果表明:1)筛选出964个DEGs,其中517个基因表达上调,447个表达下调。2)通过GO功能注释发现差异基因在生物过程、细胞组分和分子功能三大类别显著富集在免疫应答、防御反应、对外界刺激反应、对刺激反应、细胞外区域、细胞表面等条目。3)KEGG信号通路富集分析发现DEGs显著集中在细胞因子及其受体相互作用、IgA产生的肠道免疫网络、细胞粘附分子、Toll样受体信号通路等通路上。4)通过蛋白互作网络分析发现9个重要的关键分子,其中IL-6和IL-18具有调节细胞分化促进干扰素产生的功能,IRF1和IRF7能够调节巨噬细胞等细胞的活化以及抗原递呈能力,SOCS1能够防止STAT1信号通路异常活跃而导致的过度炎症反应,CCL4、CCR5和CCL20作为趋化因子能够诱导多种免疫细胞浸润炎症区域,CD40能够增强抗原递呈进而调节机体的免疫功能。综上,NRTUAs虫株刺激雏鸡胸腺后,胸腺细胞的增殖活动减弱,T细胞活化以及细胞因子分泌等活动增强,并且IL-6、IL-18、IRF1、IRF7、SOCS1、CCL4、CCR5、CCL20和CD40是NRTUAs虫株调节雏鸡胸腺细胞的重要分子,本研究为深入探讨NRTUAs虫株调节家禽胸腺的先天性免疫反应的分子机制提供了理论依据。

关键词：非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫转录组学雏鸡胸腺

PTHLH基因对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响及其分子调控机制的初步研究

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中国草食动物科学 2024年

作者：陆杏蓉邓廷贤郑海英杨春艳韦科龙钟华配段安琴马小娅徐媛媛尚江华广西水牛研究所/农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室广西水牛遗传繁育重点实验室

试验旨在探讨PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响，以及PTHLH基因对增殖、表观修饰和多能性相关基因表达模式的调控作用，为理解卵泡颗粒细胞和卵泡发育的分子调控机制提供新的视角。采用脂质体转染法将PTHLH基因过表达载体... 详细信息

试验旨在探讨PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞活性的影响，以及PTHLH基因对增殖、表观修饰和多能性相关基因表达模式的调控作用，为理解卵泡颗粒细胞和卵泡发育的分子调控机制提供新的视角。采用脂质体转染法将PTHLH基因过表达载体转染到水牛卵泡颗粒细胞中；利用MTT细胞活性检测试剂测定细胞活力；用STRING在线分析PTHLH及相关蛋白的互作网络；用qRT-PCR检测转染后水牛卵泡颗粒细胞中增殖、表观修饰和多能性相关基因的表达情况，分析PTHLH基因过表达对水牛卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响。结果显示，PTHLH基因过表达极显著降低了水牛卵泡颗粒细胞的活性(P<0.0001）；过表达组细胞中增殖相关基因（CCNB1、CCND1、CDKN1B、CDKN1A和CDK2）的表达极显著下调（P<0.0001）；甲基化相关基因DNMT1和羟甲基化相关基因TET3的表达极显著下调(P<0.001或P<0.01），甲基化相关基因DNMT3B和IDH1的表达显著下调（P<0.05），而羟甲基化相关基因TET1和TET2的表达显著上调（P<0.05）；乙酰化相关基因（HDAC1、HDAC2、HAT1、P300和CBP）的表达极显著下调( P<0.001或P＜0.0001）；与此同时，多能性相关基因OCT4和SOX2的表达极显著上调( P<0.01或P<0.001），而NANOG基因的表达极显著下调( P<0.01）。综上，PTHLH基因过表达抑制了水牛卵泡颗粒细胞的细胞活性，对增殖相关基因（CCNB1、CCND1、CDKN1B、CDKN1A和CDK2）、甲基化相关基因DNMT1与羟甲基化相关基因TET3、乙酰化相关基因（HDAC1、HDAC2、HAT1、P300和CBP）和多能性相关基因NANOG的表达具有负调控作用，而对羟甲基化相关基因TET1和TET2，以及多能性相关基因OCT4和SOX2的表达具有正调控作用，为今后研究卵泡发生机理奠定基础。

关键词：水牛 PTHLH基因卵泡颗粒细胞基因表达

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磷脂分子调控畜禽肉品质研究进展

食品科学 2024年第8期45卷 303-311页

作者：张凯华臧明伍王守伟张哲奇李丹李笑曼郝蕊中国肉类食品综合研究中心北京食品科学研究院肉类加工技术北京市重点实验室北京100068 天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300384

磷脂是一类结构复杂、功能多元的极性脂质分子,包括甘油磷脂和鞘磷脂2类。作为细胞膜的重要组成部分,磷脂分子参与生命体细胞信号传导、脂滴形成、细胞凋亡等多种生理活动,磷脂分子的代谢、水解及氧化赋予肉类食品独特的质地、风味和营... 详细信息

磷脂是一类结构复杂、功能多元的极性脂质分子,包括甘油磷脂和鞘磷脂2类。作为细胞膜的重要组成部分,磷脂分子参与生命体细胞信号传导、脂滴形成、细胞凋亡等多种生理活动,磷脂分子的代谢、水解及氧化赋予肉类食品独特的质地、风味和营养品质。磷脂分子的功能特性因其连接的极性基团和sn-1/sn-2位点脂肪酸种类不同而有所差异,脂质组学为磷脂分子结构确证与表征提供了强大技术支撑。本文介绍了肌内磷脂分子的结构与功能、检测及分析方法,重点综述了磷脂分子参与畜禽肉肌内脂肪沉积、调控宰后生鲜肉品质及加工肉制品品质的研究进展,以期为精准调控畜禽肉品质提供参考借鉴。

关键词：磷脂分子甘油磷脂鞘磷脂脂质组学肉品质

蛋白翻译后修饰在PRRSV感染中的作用机制

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中国畜牧杂志 2024年第8期60卷 13-20页

作者：刘后春周傲陈洪波彭先文梅书棋吴俊静动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430064 动物遗传繁育与精准养殖实验室武汉轻工大学动物科学与营养工程学院湖北武汉430023

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重威胁全球养猪业的病原体,其致病机制尚未完全解析。蛋白翻译后修饰对蛋白质功能至关重要,可精细调控蛋白质活性、稳定性和定位,进而影响细胞生长、分化和凋亡等生物学过程。PRRSV在入侵宿主细胞... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重威胁全球养猪业的病原体,其致病机制尚未完全解析。蛋白翻译后修饰对蛋白质功能至关重要,可精细调控蛋白质活性、稳定性和定位,进而影响细胞生长、分化和凋亡等生物学过程。PRRSV在入侵宿主细胞时,会触发一系列复杂生物学过程,其中蛋白翻译后修饰在病毒感染宿主中扮演着至关重要的角色,能够影响宿主对病毒的识别,并参与调节病毒复制、增殖及致病等过程。本文综述了磷酸化、泛素化、糖基化、棕榈酰化、乙酰化、乳酸化等蛋白翻译后修饰在PRRSV感染中的作用机制,以期为PRRSV致病机制研究提供新的思路,为PRRSV防治药物的研发提供理论依据。

关键词：蛋白翻译后修饰 PRRSV 病毒感染猪

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牛骨骼肌卫星细胞发育过程中的转录组和翻译组联合分析

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中国畜牧兽医 2024年第11期 4665-4677页

作者：马苏芳杨雯晴张冰冰郭若楠许赢心张林林郭益文胡德宝郭宏丁向彬李新天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室

【目的】利用转录组测序(transcriptome sequencing, RNA-Seq)和全长翻译组测序(ribosome-nascent-chain-complex sequencing, RNC-Seq)分析比对转录和翻译两个不同水平上牛骨骼肌的生长发育过程，解析其发育特征和规律，并筛选出可能... 详细信息

【目的】利用转录组测序(transcriptome sequencing, RNA-Seq)和全长翻译组测序(ribosome-nascent-chain-complex sequencing, RNC-Seq)分析比对转录和翻译两个不同水平上牛骨骼肌的生长发育过程，解析其发育特征和规律，并筛选出可能在转录组和翻译组共同参与牛肌肉生长发育过程的关键基因，为后续功能基因的筛选和利用提供目标靶点。【方法】采集4月龄牛胚胎的骨骼肌卫星细胞的增殖期(proliferative period, GM)和分化期第2天(the second day of differentiation, DM2)的样品进行RNA-Seq和RNC-Seq分析，对其差异表达基因进行生物信息学分析，从翻译调控的角度分析与骨骼肌发育相关的差异基因。【结果】BSMSCs的DM2期相较于GM期差异基因筛选表明，转录组共筛选获得2 808个差异基因(上调基因1 749个，下调基因1 059个),翻译组共筛选获得3 740个差异基因(上调基因1 769个，下调基因1 971个),转录组和翻译组共有的差异表达基因725个，其中表达趋势相同的基因618个，表达趋势相反的基因107个。功能富集分析获得103个与骨骼肌发育相关的基因。进一步深入分析发现，转录水平的调控和翻译水平的调控具有相对独立性，且翻译调控对转录调控具有一定的回调作用，筛选获得了22个与牛肌肉的生长发育密切相关的标靶基因(CDK1、SERPINE1、THBS1、IGFBP3、CNB1、GADD45A、CYCS、CDK2、CCND1、CCNE2、ZMAT3、ACTB、ACTA1、TNNT1、MYH7、ACTG1、TUBA1C、TNNC1、KIF20A、TUBB4B、MYL3、TUBB3)及13个存在翻译回调现象的关键基因(GREM1、EGR1、SFRP4、NKD2、DKK3、IGFBP3、CTSK、ITGAV、CTSV、CDKN1A、SESN3、GADD45A、ZMAT3)。【结论】本研究筛选获得了22个可能与牛肌肉的生长发育密切相关的关键基因和13个存在翻译回调的关键基因，为进一步利用分子手段调节牛肌肉生长发育过程及进行新品种培育提供了重要的靶点。

关键词：牛骨骼肌卫星细胞转录组测序全长翻译组测序生物信息学

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