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LbCas12a蛋白的原核表达及活性检测

中国畜牧兽医 2022年第5期49卷 1621-1629页

作者：刘茹李小龙张晓倩田小欢余梅赵书红曹建华华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 华中农业大学农业农村部猪遗传育种重点实验室武汉430070 华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

【目的】获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)ND2006的LbCas12a蛋白,以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】根据pMBP-LbCas12a质粒(Addgene,113431)的基因序列合成LbCas12a基因,并将其与pET-28a(+)线性化载体进行同源重组,构建重组质粒pET28a-LbCas12a,经测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后将阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达。通过12%SDS-PAGE凝胶电泳检测确定IPTG诱导的最佳浓度及温度,鉴定重组蛋白的表达形式,通过Ni-NTA树脂亲和层析的方法进行纯化、超滤法浓缩,BCA法检测蛋白浓度。将浓缩后的LbCas12a与猪细小病毒(PPV)靶标DNA、CRISPR RNA(crRNA)及偶联荧光基团的非特异性单链DNA(ssDNA)探针FQ共孵育,设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度(125、250、500、1000 nmol/L)的试验组,检测不同组别ssDNA探针的荧光强度,检测测试位点PPV活性。【结果】测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定结果表明,重组质粒pET28a-LbCas12a构建成功且无移码突变。12%SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明,IPTG诱导表达的最佳浓度为0.5 mmol/L,最佳温度为37℃,表达形式主要为可溶性表达。蛋白浓度检测结果表明,浓缩后的蛋白浓度为485 ng/μL,质量为143 ku。活性检测结果表明,125、250、500、1000 nmol/L LbCas12a蛋白组的荧光强度均极显著高于对照组(P<0.01)。【结论】本研究成功表达出高活性的LbCas12a蛋白,且LbCas12a蛋白具有体外切割ssDNA的反式活性,为后续基于CRISPR-LbCas12a系统的分子检测技术奠定了基础。

关键词： LbCas12a蛋白原核表达蛋白纯化反式活性

利用CRISPR/Cas9技术制备CD163基因SRCR5序列敲除猪

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农业生物技术学报 2020年第9期28卷 1535-1542页

作者：韩晓松高杨刘海龙熊友才谢胜松李长春李新云赵书红阮进学华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是养猪(Sus scrofa)业中的重要传染性疾病之一,CD163 (cluster of differentiation 163)是PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)入侵机体的重要受体,其第7外显子编码的SRCR5 (scavenger receptor cysteine-rich domain 5)是PRRSV侵染细胞的关键结构域。为生产能够抵抗PRRSV的基因编辑猪,本研究利用CRISPR/Cas9技术,同时将靶向猪CD163内含子6和7的2条小向导RNA (small guide RNA, sgRNA)与Cas9表达载体转染大白猪的胎儿成纤维细胞(pig embryonic fibroblast cells,PEFs)。利用有限稀释法挑选32株单克隆细胞,经PCR扩增与测序鉴定,获得SRCR5序列缺失的PEFs,其中纯合敲除效率为6.25%;随后以CD163基因编辑的纯合细胞为供体细胞进行体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT),获得1头正常存活的SRCR5序列缺失猪。本研究通过2条sgRNA精准敲除靶基因的功能结构域,可为相关研究提供方法学参考,所获得的CD163基因编辑猪可用于后续抗病育种研究。

关键词： CRISPR/Cas9 CD163 (cluster of differentiation 163) SRCR5 (scavenger receptor cysteine-richdomain 5) 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 体细胞核移植(SCNT)

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猪精液冻融技术及其影响因素研究进展

华中农业大学学报 2023年

作者：范振港刘鑫苗义良张霞动物育种与健康养殖教育部前沿科学中心华中农业大学动科动医学院/农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室

养猪业是我国畜牧业产业的重要组成。国内生猪养殖主要采用自繁自养模式，配种所使用的精液多采用鲜精或常温稀释保存精液，而精液冻融技术可实现猪精液的长期保存，但与牛、小鼠等物种相比较，猪精液冻融技术还有待于进一步优化改善。... 详细信息

养猪业是我国畜牧业产业的重要组成。国内生猪养殖主要采用自繁自养模式，配种所使用的精液多采用鲜精或常温稀释保存精液，而精液冻融技术可实现猪精液的长期保存，但与牛、小鼠等物种相比较，猪精液冻融技术还有待于进一步优化改善。为进一步改进猪精液冷冻技术并实现在生产上大规模应用，本文主要综述了猪精液冻融技术发展概况、主要技术流程，影响猪精液冻融后精子活力的关键因素，包括精液的采集、冷冻前降温平衡、冷冻保护剂添加和冷冻方法等，以及精子冻融过程中的理化性质变化，包括物理结构损伤、功能性损伤、精子抗冻机制等，最后总结、展望了能够提高猪精液冻融效果的新方法。

关键词：猪精液冻融冷冻保护剂冻精解冻剂精液理化性质

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猪肺泡巨噬细胞极化的异质性与可逆性

农业生物技术学报 2021年第4期29卷 619-630页

作者：吴雅兰王圳玥王道远张伟李新云赵书红朱猛进华中农业大学动物科学技术学院华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室生猪健康养殖省部共建协同创新中心

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)是机体先天免疫第一防线的重要成员,其强可塑性为猪(Sus scrofa)的免疫调控机制解析提供了重要细胞模型。为建立猪肺泡巨噬细胞不同极化亚型及比较两种不同形式的PAMs与3D4/21细胞... 详细信息

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)是机体先天免疫第一防线的重要成员,其强可塑性为猪(Sus scrofa)的免疫调控机制解析提供了重要细胞模型。为建立猪肺泡巨噬细胞不同极化亚型及比较两种不同形式的PAMs与3D4/21细胞系极化的异质性与可逆性,本研究以30日龄健康大白仔猪分离的原代PAMs和商业化3D4/21细胞系为实验材料,利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)加γ干扰素(interferon gamma, IFN-γ)组合和白介素4 (interleukin 4, IL-4)进行极化诱导,分别构建M1和M2细胞模型。PCR和qRT-PCR相对定量结果显示,M1型标志基因IL-1β、趋化因子配体10 (CXC chemokine ligand10, CXCL10)、肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor, TNF)、IL-6、IL-12B在PAMs和3D4/21细胞系M1型中的表达水平均显著高于在对照组(M0)和M2型中的表达水平(P实验结果表明,PAMs极化的可逆性强于3D4/21细胞系,且PAMs由M2型向M1型转换的能力强于由M1型向M2型转换的能力。本研究为进一步探索猪肺泡巨噬细胞极化机制及猪的抗病育种提供了基础资料。

关键词：猪肺泡巨噬细胞 M1型 M2型极化异质性可逆性

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MicroRNA调控哺乳动物骨骼肌发育

遗传 2017年第11期39卷 1046-1053页

作者：李新云付亮亮程会军赵书红华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室农业部猪遗传育种重点开放实验室生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

Micro RNA(mi RNA)是一类长度大约为22 bp的小分子非编码RNA,广泛存在于哺乳动物中,部分mi RNA表达具有时空和组织特异性。哺乳动物中mi RNA主要通过与靶基因3?UTR区结合抑制其翻译,调控机体生物学功能。mi RNA在哺乳动物骨骼肌发育中... 详细信息

Micro RNA(mi RNA)是一类长度大约为22 bp的小分子非编码RNA,广泛存在于哺乳动物中,部分mi RNA表达具有时空和组织特异性。哺乳动物中mi RNA主要通过与靶基因3?UTR区结合抑制其翻译,调控机体生物学功能。mi RNA在哺乳动物骨骼肌发育中发挥重要调节作用。哺乳动物骨骼肌发育是一个复杂的生物学过程,包括骨骼肌干细胞增殖、迁移、分化,成肌细胞增殖、分化、肌管融合,肌纤维肥大,能量代谢,纤维类型转换等。mi RNA参与骨骼肌发育的各个环节,通过靶向各个时期的关键因子调控骨骼肌发育。本文对mi RNA在骨骼肌发育中的调控作用进行了综述,以期为深入理解骨骼肌发育规律提供参考。

关键词： miRNA 骨骼肌肌源性祖细胞卫星细胞成肌细胞

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猪主要经济性状的基因组选择研究

畜牧兽医学报 2019年第2期50卷 439-445页

作者：彭潇尹立林梅全顺王海燕刘小磊朱猛进李新云付亮亮赵书红华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

旨在系统比较GBLUP、SSGBLUP、BayesA、BayesB、BayesC、BayesLASSO、BSLMM和BayesR等8种方法对猪重要经济性状基因组选择的准确性。本研究以本实验室收集的2 585头大白猪达100kg日龄、达100kg背膘厚和母猪乳头数3个性状为分析对象,结合... 详细信息

旨在系统比较GBLUP、SSGBLUP、BayesA、BayesB、BayesC、BayesLASSO、BSLMM和BayesR等8种方法对猪重要经济性状基因组选择的准确性。本研究以本实验室收集的2 585头大白猪达100kg日龄、达100kg背膘厚和母猪乳头数3个性状为分析对象,结合猪50K基因芯片分型数据,以加性模型为基础,利用5倍交叉验证比较8种方法的基因组选择准确性。研究发现,基因组选择的准确性与不同性状估计遗传力呈正相关。交叉验证结果表明,预测准确性最高的性状为达100kg日龄,但不同方法在不同性状中表现并不完全相同,在达100kg日龄和达100kg背膘厚中SSGBLUP基因组预测准确性均为最高,而在母猪乳头数中BayesA的基因组预测准确性最高。综上表明,对小样本开展基因组预测时,中、高等遗传力性状可以选择SSGBLUP方法,低等遗传力性状可以选择BayesA方法。如何优化和选择一种广泛适用于所有性状的方法,可能是未来研究的方向。

关键词：猪基因组选择遗传力准确性

基于GBLUP与惩罚类回归方法的猪血液性状基因组选择研究

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畜牧兽医学报 2017年第12期48卷 2258-2267页

作者：张巧霞张玲妮刘飞刘向东刘小磊赵书红朱猛进华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

旨在探讨GBLUP与惩罚类回归方法用于猪血液性状基因组选择的相关问题。以本实验室收集的免疫资源猪群体13个血液性状为分析对象,结合Illumina公司猪SNP60K基因芯片分型数据,以加性模型和加性-显性模型为基础,利用GBLUP和3种惩罚类回归方... 详细信息

旨在探讨GBLUP与惩罚类回归方法用于猪血液性状基因组选择的相关问题。以本实验室收集的免疫资源猪群体13个血液性状为分析对象,结合Illumina公司猪SNP60K基因芯片分型数据,以加性模型和加性-显性模型为基础,利用GBLUP和3种惩罚类回归方法(ridge、lasso与elastic-net)开展基因组选择分析。研究发现,基因组选择的准确性与性状芯片遗传力估计值呈正相关。交叉验证分析结果表明,4种方法对13个血液性状预测准确性最高的性状均是MCV(平均红细胞体积),而加性模型和加性-显性模型的预测准确性在不同性状中的表现不同。在多数性状中,lasso和elastic-net回归的预测准确性低于ridge回归和GBLUP法,但在NE%(嗜中性细胞百分比)等少数性状中则刚好相反。综上说明,没有适用于所有性状的最佳基因组预测方法,基因组预测方法的选择应考虑目标性状的遗传特性。本研究为猪免疫性状基因组选择的实际应用提供了重要参考信息。

关键词：猪血液性状基因组选择 GBLUP 惩罚类回归

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猪RNA聚合酶Ⅱ单克隆抗体的制备与应用

畜牧兽医学报 2021年第10期52卷 2783-2791页

作者：田小欢刘茹孙艳任瑞敏余梅赵书红曹建华华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 华中农业大学农业农村部猪遗传育种重点实验室武汉430070 华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

旨在制备猪RNA聚合酶Ⅱ的单克隆抗体并进行初步应用。本研究采用生物信息方法预测免疫原,将其化学合成后免疫5只4~8周龄Bal b/c雌性小鼠,对免疫后呈现阳性的小鼠进行细胞融合试验,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并获得能稳定分泌抗RNA ... 详细信息

旨在制备猪RNA聚合酶Ⅱ的单克隆抗体并进行初步应用。本研究采用生物信息方法预测免疫原,将其化学合成后免疫5只4~8周龄Bal b/c雌性小鼠,对免疫后呈现阳性的小鼠进行细胞融合试验,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并获得能稳定分泌抗RNA PolⅡ的杂交瘤细胞。鉴定结果显示,RNA PolⅡ单克隆抗体的重链为IgG 2A型,轻链为Kappa型。利用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了8株稳定分泌RNA PolⅡ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将其初步应用到染色质免疫共沉淀(ChIP-seq)技术,并与商业化抗体的富集性进行比较,结果表明,本研究得到的单克隆抗体富集性更强。本研究获得的猪RNA PolⅡ单克隆抗体可为表观遗传学的研究提供理论基础,并且提供重要的生物学材料。

关键词： RNA PolⅡ 单克隆抗体猪杂交瘤细胞

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多杀性巴氏杆菌分子分型方法简述

微生物学报 2016年第10期56卷 1521-1529页

作者：彭忠梁婉吴斌华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室生猪健康养殖协同创新中心湖北武汉430070 华中农业大学动物科学技术学院农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室生猪健康养殖协同创新中心湖北武汉430070

多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立,操作过程繁琐,技术要求高,... 详细信息

多杀性巴氏杆菌是一种能感染多种动物甚至是人的重要革兰氏阴性病原菌。目前临床上用于多杀性巴氏杆菌诊断的分型方法主要包括血清学分型方法和分子分型方法。其中血清学分型方法主要基于免疫学实验技术建立,操作过程繁琐,技术要求高,工作量大,不适用于临床上大规模快速开展多杀性巴氏杆菌流行病学调查的需要;而基于分子生物学手段建立的分子分型方法相对于传统的血清学分型方法而言具有快速、简单、灵敏、灵活等特点,特别是某些分子分型方法与传统的分型方法形成了较为精确的对应关系,因而在临床上得到了广泛的应用。目前适用于临床上开展多杀性巴氏杆菌分离鉴定的分子分型方法主要包括多重PCR方法及多位点序列分型法(MLST),其中多重PCR方法又包括基于荚膜编码区及脂多糖外核编码簇建立的PCR方法。本文将重点就这3种常用的多杀性巴氏杆菌分子分型方法进行综述,介绍其建立原理、实现手段以及各自的优缺点,为临床上开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查特别是分子流行病学调查提供参考。

关键词：多杀性巴氏杆菌分子分型方法多重PCR 多位点序列分型