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猪δ冠状病毒RBD的可溶性表达、纯化及小鼠抗血清制备

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中国兽医学报 2024年第5期44卷 953-958页

作者：崔春梅张爽张国庆蒋嵘高子函郝鹏飞李昌金鑫李乐天金宁一延边大学农学院吉林延吉136200 中国医学科学院人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元吉林长春130122 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130122

为获得猪δ冠状病毒(PDCoV)S蛋白受体结合区(RBD)的可溶性蛋白及特异性多克隆抗体血清,本研究将PDCoV流行株S蛋白(GenBank:QAA06990.1)的RBD序列添加信号肽、纯化标签与酶切位点,命名为PDCoV-RBD(简称PDR),对其进行密码子优化后合成并... 详细信息

为获得猪δ冠状病毒(PDCoV)S蛋白受体结合区(RBD)的可溶性蛋白及特异性多克隆抗体血清,本研究将PDCoV流行株S蛋白(GenBank:QAA06990.1)的RBD序列添加信号肽、纯化标签与酶切位点,命名为PDCoV-RBD(简称PDR),对其进行密码子优化后合成并克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1-PDR。将重组质粒转染至Expi293F细胞进行表达,并利用SDS-PAGE与Western blot进行鉴定;通过Strep-Tactin XT亲和层析纯化目的蛋白,薄层扫描分析蛋白纯度,并以纯化后的PDR蛋白免疫小鼠,制备抗PDR蛋白的特异性多克隆抗体血清,通过间接ELISA测定效价,PDCoV病毒感染细胞后,通过Western blot检测S蛋白与血清的特异性结合效果。结果显示,PDR在Expi293F细胞中获得可溶性表达,纯化得到的目的蛋白大小正确,纯度大于98%;用其免疫小鼠制备的抗血清能特异性结合病毒中天然的S蛋白。本研究获得的PDR蛋白及其小鼠抗血清可为PDCoV的诊断检测与疫苗研制提供必要的物质基础。

关键词：猪δ冠状病毒受体结合区蛋白表达纯化抗血清制备

CRISPR/Cas9基因编辑技术安全性研究进展

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中国病原生物学杂志 2024年第8期19卷 976-979页

作者：方梦雅宋英杰靳力李浩孙岩松刘宗平扬州大学兽医学院江苏扬州225009 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated nuclease 9)技术凭借效率高、简便、成本低和易操作的特点成为当今主流的基因编辑系统,并被广泛应用于基础研究和临床应用研究。然而,CRISPR/Cas9基因编辑技术潜在的安全风险引起广泛关注。已有研究表明,CRISPR/Cas9基因编辑技术存在脱靶、染色体缺失、碎裂和DNA损伤修复功能异常等安全风险。本文主要对CRISPR/Cas9系统潜在的安全风险与防范策略进行概述,为CRISPR/Cas9系统能更加安全有效的应用于临床提供参考。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑安全性风险综述

稳定表达PSMB9-eGFP-His蛋白的THP-1细胞系建立及免疫蛋白酶体活性检测

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2282-2293页

作者：王佳豪冯利杰张瑶徐平安徽医科大学基础医学院安徽合肥230032 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所、中国医学科学院蛋白质组学与药物研发新技术创新单元、北京蛋白质组研究中心医学蛋白质组全国重点实验室北京102206

泛素/蛋白酶体系统(ubiquitin/proteasome system,UPS)在调控细胞内蛋白质稳态过程中发挥重要功能,UPS中蛋白酶体的催化活性受β1(PSMB6)、β2(PSMB7)和β5(PSMB5)亚基调控,在干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、炎症反应、氧化应激等条件诱导下,β1、β2和β5可被相应的β1i(PSMB9)、β2i(PSMB10)和β5i(PSMB8)替换,组装形成免疫蛋白酶体(immunoproteasome)。与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体具有更强的免疫调节作用,如加工递呈MHCⅠ抗原、调节促炎细胞因子的产生及T细胞分化、增殖等。免疫蛋白酶体的异常聚集会导致帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病的发生。为探究PSMB9在细菌感染后发挥的功能,本研究通过构建过表达PSMB9-eGFP-His的慢病毒质粒,利用三质粒系统转染HEK293T包装慢病毒,嘌呤霉素筛选,获得稳定表达PSMB9融合蛋白的人髓系白血病单核细胞THP-1细胞系,利用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)及荧光显微镜验证了PSMB9融合蛋白的表达,通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,q PCR)计算了稳转细胞系中PSMB9-eGFP基因的拷贝数。免疫荧光结果发现eGFP-His不会影响PSMB9的亚细胞定位,镍柱亲和纯化实验证实PSMB9融合蛋白可组装至20S免疫蛋白酶体中,且具有底物切割活性。上述结果证明PSMB9-eGFP基因成功整合入THP-1细胞基因组并稳定表达,可用于探究PSMB9亚基在活细胞模型中不同感染条件及疾病进程中的细胞定位、动态表达和活性的变化,并为其他2个免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10的稳转细胞系构建提供了参考。

关键词：免疫蛋白酶体慢病毒稳转细胞系 PSMB9 THP-1

运用翻译起始区结构优化实现广谱抗病毒蛋白PA在大肠杆菌中的高效表达

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中国生物工程杂志 2024年第9期44卷 53-63页

作者：李秋烨谢德健史姝蔡秀怡谭志霞张彦沈文龙叶湘漓赵志虎湖南师范大学医学院军事科学院军事医学研究院前沿生物技术实验室长沙市第九医院

大肠杆菌是重要的生物工程宿主系统，约1/3上市蛋白质类生物技术药物由大肠杆菌重组生产。但是，密码子偏性所致目的蛋白表达水平较低、不具备真核生物部分翻译后修饰等多种因素，限制了大肠杆菌系统的广泛应用。广谱抗病毒蛋白，对类... 详细信息

大肠杆菌是重要的生物工程宿主系统，约1/3上市蛋白质类生物技术药物由大肠杆菌重组生产。但是，密码子偏性所致目的蛋白表达水平较低、不具备真核生物部分翻译后修饰等多种因素，限制了大肠杆菌系统的广泛应用。广谱抗病毒蛋白，对类似新冠的新突发再发传染性疾病的高效防控具有重要意义。为了实现广谱抗病毒蛋白PA在大肠杆菌中的高效表达、拓展其应用潜能，通过密码子优化、结合mRNA翻译起始区(translation initiation region, TIR)二级结构最小自由能(minimum free energy, MFE)预测等，对PA在大肠杆菌中的表达水平进行了研究。结果发现：密码子的优化，可以实现PA在大肠杆菌中的表达，但是总体表达水平并不是十分理想。TIR二级结构MFE的大小与表达水平高低密切相关，通过密码子的同义突变进而改变TIR局部二级结构、MFE大小，可以进一步提高或降低PA的表达水平，从而从正反两个方面证实全局密码子的优化结合TIR局部二级结构驱动的MFE调整，是实现PA在大肠杆菌中高效表达的一种现实、有效策略，对蛋白质类生物技术药物在原核系统中的高效表达与规模化生产，具有重要应用价值。

关键词：大肠杆菌原核表达翻译起始区 mRNA二级结构密码子优化

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利用邻近标记-质谱联用技术筛选埃博拉病毒相关宿主因子

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生物学杂志 2024年第3期41卷 92-97页

作者：张迅柏宇刘海楠刘萱曹诚安徽大学物质科学与信息技术研究院合肥230601 军事科学院军事医学研究院北京100850

构建VP35与生物素连接酶TurboID融合蛋白,利用埃博拉病毒最小基因组系统(Ebola virus minigenome system, EBOV MG),在细胞中模拟病毒的生命周期和病毒包涵体(virus inlusion body, VIB)的形成过程,通过添加外源生物素,标记VP35相互作... 详细信息

构建VP35与生物素连接酶TurboID融合蛋白,利用埃博拉病毒最小基因组系统(Ebola virus minigenome system, EBOV MG),在细胞中模拟病毒的生命周期和病毒包涵体(virus inlusion body, VIB)的形成过程,通过添加外源生物素,标记VP35相互作用蛋白。定量质谱丰度差异分析筛选出537个潜在的VP35互作蛋白,Gene Ontology(GO)分析发现其中包括大量与RNA结合相关蛋白。从中选取EIF4B和ZNF598进行初步验证,二者均与VP35存在相互作用,且敲低上述基因可显著抑制EBOV转录复制病毒样颗粒(trVLP)的复制效率。结果证实,邻近标记-质谱联用技术可以用于病毒-宿主相互作用蛋白挖掘,为病毒致病机制研究及抗病毒靶点挖掘提供重要手段。

关键词：邻近标记埃博拉病毒病毒包涵体 TurboID VP35

产气荚膜梭菌致病机制及其治疗性抗体研究进展

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中国药理学与毒理学杂志 2024年第4期38卷 304-313页

作者：赵品楠罗龙龙军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所国家安全特需药品全国重点实验室北京100850

产气荚膜梭菌(CP)是一种常见的人兽共患病菌,广泛存在于自然界中,其分泌的外毒素给人类健康和畜牧业造成较大影响和损失。CP最主要的致病毒素为α,β,ε和τ毒素及肠毒素和坏死性肠炎B样毒素,其导致的疾病各不相同。抗生素治疗是目前治... 详细信息

产气荚膜梭菌(CP)是一种常见的人兽共患病菌,广泛存在于自然界中,其分泌的外毒素给人类健康和畜牧业造成较大影响和损失。CP最主要的致病毒素为α,β,ε和τ毒素及肠毒素和坏死性肠炎B样毒素,其导致的疾病各不相同。抗生素治疗是目前治疗CP感染的主要手段,但由于耐药性不断增长,控制CP感染愈发困难。近年来随着基因工程技术的快速发展,针对不同外毒素的疫苗或抗体有可能成为应对CP感染的新一代免疫治疗手段。研究表明,针对CPα毒素的疫苗可预防小鼠A型CP感染;抗α毒素的单链抗体、双价单链抗体和纳米抗体等,可与α毒素特异性结合,有效中和α毒素的磷脂酶C活性,在小鼠模型中对致死量α毒素攻击具有保护作用。本文简述CP的主要致病因子、致病机制和基因工程抗体治疗研究进展,为CP感染防治提供参考。

关键词：产气荚膜梭菌毒素抗体

新型发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗的制备及免疫原性研究

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中国病原生物学杂志 2024年第5期19卷 507-513页

作者：杨盼刘乐乐田莉韩越赵忠欣孙培录郑学星夏咸柱郑文文山东大学齐鲁医学院公共卫生学院山东济南250012 山东省临沂市人民医院山东第一医科大学(山东省医学科学院)药物研究所军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

目的评估和比较采用H_(2)O_(2)与β-丙内酯为灭活剂制备新型发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)灭活疫苗的免疫原性。方法将SFTSV分别用H_(2)O_(2)与β-丙内酯灭活,并与铝胶佐剂配伍制成灭活疫苗免疫小鼠,持续21 d测小鼠体重、进食量、... 详细信息

目的评估和比较采用H_(2)O_(2)与β-丙内酯为灭活剂制备新型发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)灭活疫苗的免疫原性。方法将SFTSV分别用H_(2)O_(2)与β-丙内酯灭活,并与铝胶佐剂配伍制成灭活疫苗免疫小鼠,持续21 d测小鼠体重、进食量、精神状态等,评估疫苗的安全性。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中SFTSV特异性抗体水平,中和实验测定小鼠血清中SFTSV中和抗体水平,使用流式细胞术测定脾脏中B细胞的募集与活化水平。结果研究制备的两种灭活疫苗均表现出良好的安全性,SFTSV中和抗体均值在免疫后8周效价均能达到1∶300以上,诱导的免疫反应均倾向于Th2型,且具有较高的B细胞的活化水平,其中H_(2)O_(2)灭活剂组诱导产生的中和抗体效价高于β-丙内酯灭活剂组。结论成功制备了两种在小鼠中诱导强烈体液免疫反应的SFTSV灭活候选疫苗,并提供了相关的免疫参数。H_(2)O_(2)作为灭活剂已显示出一定的优势,有助于开发有效的疫苗,为制备发热和血小板减少综合征病毒新型灭活疫苗提供研究依据。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒灭活疫苗中和抗体灭活剂 H_(2)O_(2)

非洲猪瘟病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

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病毒学报 2024年第4期40卷 802-810页

作者：李海宋煜吴汉李桂珍陈纯李海涛邵敏王晓虎扈荣良周鹤峰遵义医科大学珠海校区生物工程学院珠海519000 广东省农业科学院动物卫生研究所广州510000 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所长春130062

利用非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30、p72和MGF360⁃12L重组蛋白及其酶标单克隆抗体(Monoclonal antibodies,mAbs),建立一种快速、准确检测ASFV抗体的竞争ELISA法。分别利用纯化的ASFV p30、p72和MGF360⁃12L重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过聚乙二醇(PEG)诱导融合获得阳性杂交瘤细胞,腹水经辛酸⁃硫酸铵法纯化得到相应的mAbs,并使用HRP标记,建立竞争ELISA法并优化反应条件,对该法的临界值、敏感性、特异性和符合率进行评估。制备的p30、p72和MGF360⁃12L重组蛋白纯度良好,融合后的细胞株经Western blot鉴定具有良好的反应性和特异性,筛选的杂交瘤细胞株均为IgG类抗体,纯化后的mAbs符合抗体IgG分子量大小,经HRP标记后活性较高。竞争ELISA优化结果显示,血清与酶标mAbs最佳稀释倍数分别为1∶8和1∶3200,临界值判定PI≤14.71%为阴性,PI≥18.97%为阳性,在14.71%≤PI≤18.97%期间为可疑,试剂盒敏感性为1∶128,经检测临床样品表明符合率极高。成功建立了ASFV抗体的快速检测方法,为ASFV的预防和大规模血清样品检测提供有效监测工具,并为ASFV疫苗免疫效果评估提供有效技术手段。

关键词：非洲猪瘟病毒单克隆抗体竞争ELISA p30 p72 MGF360

SHERLOCK-HBA检测方法的建立及其在血液鉴别中的应用

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生物化学与生物物理进展 2024年第8期51卷 1971-1982页

作者：姚乾威何红霞胡胜赵一霞罗雨季安全孙启凡山西医科大学法医学院太原030001 公安部鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室北京100038 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

目的基于规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质系统(Cas)技术建立检测血液特异性血红蛋白α(HBA)mRNA的方法,以准确、快速地鉴定血液样本。方法本研究通过设计和筛选血液特异性HBA mRNA上的CRISPR RNA(crRNA)短片段,基于C... 详细信息

目的基于规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质系统(Cas)技术建立检测血液特异性血红蛋白α(HBA)mRNA的方法,以准确、快速地鉴定血液样本。方法本研究通过设计和筛选血液特异性HBA mRNA上的CRISPR RNA(crRNA)短片段,基于CRISPR/Cas技术原理建立了SHERLOCK-HBA检测方法,对5种体液(包括外周血、月经血、唾液、阴道分泌液、精液)共79份样本进行检测以评价所建方法鉴别血液的能力,并通过种属特异性实验、灵敏度实验、模拟混合斑检测、模拟降解样本检测、实际案件样本检测等进一步验证实验体系的法医学应用能力。结果该方法检测人源血液的相对荧光单位(RFU)值显著高于非血液(P研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas技术的SHERLOCK-HBA检测体系,能准确、灵敏地鉴定血液,操作简单、快速,为快速识别血液类样本提供了新的思路和参考。

关键词：法医遗传学血液鉴定血红蛋白α CRISPR/Cas SHERLOCK