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昆明尖音库蚊复合组种类的调查与鉴定

中国畜牧兽医 2024年第9期51卷 4025-4035页

作者：李苏胜杨振兴何于雯王静林云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

【目的】对云南昆明尖音库蚊复合组蚊虫的种类进行调查和鉴定,为蚊媒传染病的防控提供依据。【方法】选取于2022年6月和2023年5月采集于昆明金殿青龙山和黄土坡的尖音库蚊复合组雄虫进行形态学和分子生物学鉴定。通过体视显微镜观察蚊... 详细信息

【目的】对云南昆明尖音库蚊复合组蚊虫的种类进行调查和鉴定,为蚊媒传染病的防控提供依据。【方法】选取于2022年6月和2023年5月采集于昆明金殿青龙山和黄土坡的尖音库蚊复合组雄虫进行形态学和分子生物学鉴定。通过体视显微镜观察蚊虫的形态特征,并切下雄蚊尾器进行观察,根据形态特征鉴定蚊虫种类;扩增蚊虫的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因和乙酰胆碱酯酶基因2(AChE2),对基因序列进行分析。【结果】金殿青龙山采集的蚊虫阳茎中叶末端尖削,内叶外伸部分呈宽叶状;黄土坡采集的蚊虫阳茎中叶末端平齐,阳茎内叶呈刀叶状。基因序列相似性分析结果显示,采集蚊虫的COⅠ基因无显著差异;AChE 2基因将蚊虫区分为两种,金殿青龙山采集蚊虫与致倦库蚊相似性较高,相似性最高为98.1%~100%,黄土坡采集蚊虫与尖音库蚊指名亚种相似性较高,相似性最高为99.7%。COⅠ基因系统发育分析结果显示,6只蚊虫与致倦库蚊、尖音库蚊、骚扰库蚊和淡色库蚊处于同一进化分支,没有明显的遗传进化差异;AChE 2基因系统发育分析结果显示,金殿青龙山采集的蚊虫与致倦库蚊聚为一簇,黄土坡采集的蚊虫与尖音库蚊聚为一簇,分别处于不同进化分支。【结论】本研究采集到2种尖音库蚊复合组蚊虫。金殿青龙山采集蚊虫为致倦库蚊,黄土坡采集蚊虫为尖音库蚊指名亚种。研究表明中国昆明等南方地区存在尖音库蚊指名亚种,应加强西尼罗病毒等有关病毒的监测。

关键词：昆明尖音库蚊复合组致倦库蚊尖音库蚊指名亚种形态学鉴定分子生物学鉴定

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中国帕利亚姆血清群中山病毒的分离及全基因组序列分析

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畜牧与兽医 2024年第7期56卷 65-71页

作者：寇美玲孟锦昕苗海生李乐谢佳芮高林廖德芳李华春宋建领云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

旨在获取中国帕利亚姆血清群中山病毒(Chuzan virus, CHUV)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。应用BHK-21、Vero、MDBK细胞对云南省江城县采集的152份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,针对出现细胞病变样品,采用CHUV VP7蛋白基因片段进... 详细信息

旨在获取中国帕利亚姆血清群中山病毒(Chuzan virus, CHUV)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。应用BHK-21、Vero、MDBK细胞对云南省江城县采集的152份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,针对出现细胞病变样品,采用CHUV VP7蛋白基因片段进行RT-PCR扩增和测序,并对阳性样品进行全长扩增及高通量测序,获得的全基因组序列进行遗传进化分析。结果:1份血液样品可致BHK 21、Vero、MDBK细胞病变;病毒基因组为10节段的“3-3-3-1”带型;病毒基因全长18 914 bp,各基因节段长度在728 bp(Seg-10)~3 930 bp(Seg-1)之间,编码6 072个氨基酸残基,编码蛋白在211(NS3蛋白)~1 295(VP1蛋白)个氨基酸残基之间;通过对保守基因Seg-1,Seg-3、Seg-7的核苷酸系统发育分析,显示与中国本土CHUV亲缘关系最近,为98.17%~99.65%,形成一簇;变异基因Seg-2的核苷酸序列同样与中国本土CHUV毒株相似度最近,为98.76%~99.57%。本研究表明中国CHUV毒株的Seg-1、Seg-3和Seg-7形成了独特的地域型,为深入揭示我国CHUV的致病性和病原学特征提供了基础数据。

关键词：中山病毒分离全基因组测序序列分析帕利亚姆血清群病毒

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我国新分离芒市病毒基因组特征与细胞感染特性研究

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中国人兽共患病学报 2024年第6期40卷 504-511,528页

作者：杨恒李占鸿肖雷李卓然谢佳蕊廖德芳高林李华春昆明学院农学与生命科学学院昆明650214 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

目的获取我国新发现芒市病毒(Mangshi virus, MSV)基因组特征以及在细胞上的感染特性,为开展MSV进化与致病性方面研究奠定基础。方法通过高通量测序技术获取MSV毒株V301/YNJH/2019全基因组序列,使用IQtree、RPD4与Simplot等软件进行... 详细信息

目的获取我国新发现芒市病毒(Mangshi virus, MSV)基因组特征以及在细胞上的感染特性,为开展MSV进化与致病性方面研究奠定基础。方法通过高通量测序技术获取MSV毒株V301/YNJH/2019全基因组序列,使用IQtree、RPD4与Simplot等软件进行系统发育树的构建与基因重配分析;测定病毒在白伊蚊细胞(C6/36)、非洲绿猴肾细胞(Vero)与仓鼠肾细胞细(BHK)上的增殖特性,通过血清中和试验调查当地牛羊上病毒的感染情况。结果病毒基因组全长20 623 bp,由12节段的双链RNA(Seg-1至Seg-12)组成。序列分析显示V301/YNJH/2019为基因重配毒株,病毒的Seg-1与Seg-11与我国湖水沉积物中发现的MSV对应基因节段序列高度相似,而Seg-2至Seg-10以及Seg-12则与我国蚊上分离的MSV毒株具有最近的亲缘关系。病毒在C6/36与BHK细胞上可高效增殖并引起细胞明显的细胞病变,在Vero细胞上可低水平复制但不引起细胞病变。在芒市采集的20份羊血清样本中未检测到MSV的中和抗体,但在采集20份牛血清中检测到2份阳性样本,其中和抗体效价分别为1∶128与1∶54。结论 V301/YNJH/2019为基因重配毒株,病毒可感染C6/36、BHK与Vero细胞,在芒市牛群中检测到感染动物。

关键词：芒市病毒全基因组测序基因重配细胞感染特性流行病学调查

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流行性出血病的研究进展

中国动物传染病学报 2024年

作者：杨恒肖雷李占鸿高林朱建波李华春昆明学院农学与生命科学学院云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室

流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus， EHDV)呈世界范围分布，病毒可感染多种野生与家养反刍动物，引起动物的流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease， EHD)。近年来多种血清型EHDV在世界多地的牛群中引起... 详细信息

流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus， EHDV)呈世界范围分布，病毒可感染多种野生与家养反刍动物，引起动物的流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease， EHD)。近年来多种血清型EHDV在世界多地的牛群中引起疫情暴发，给畜牧业带来巨大的经济损失，EHD被世界动物卫生组列为法定报告跨境动物疫病。我们的流行病学调查结果显示在EHDV在我国的南方与北方地区均有流行，其中云南、贵州、广西、广东、江苏等省份采集牛血清样本的抗体阳性率均在75.1%至100%之间。通过设置哨兵动物进行病毒的分离，我们从我国的云南、广东与广西相继分离出EHDV-1、-5、-6、-7与-10与-11等六种血清型的EHDV共计约150余株，其中EHDV-11为世界范围首次发现的新血清型EHDV。多种血清型EHDV在我国南方与北方牛群中的广泛流行使我国面临EHD暴发的风险，开展EHDV流行病学的研究十分必要。本文结合国内外现有文献，对EHDV病原学特征、流行情况、分子生物学特征、检测技术与防控措施等方面的研究进展进行综述，以期为我国EHD的研究与防控提供参考。

关键词：流行性出血病病毒流行性出血病研究进展

1株多重耐药大肠杆菌噬菌体BP32的分离鉴定及生物学特性分析

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中国畜牧兽医 2024年第8期51卷 3540-3551页

作者：吴静楠李占鸿李富祥张振兴张以芳宋建领云南农业大学动物医学院昆明650201 云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

[目的]拟分离1株可裂解多重耐药大肠杆菌的噬菌体,明确其生物学特性及基因组特征。[方法]本研究从病死山羊肺脏组织中分离大肠杆菌,并通过药敏试验分析其耐药性。以大肠杆菌ER2738菌株为宿主菌,从养殖场污水中进行噬菌体的初步增殖,通... 详细信息

[目的]拟分离1株可裂解多重耐药大肠杆菌的噬菌体,明确其生物学特性及基因组特征。[方法]本研究从病死山羊肺脏组织中分离大肠杆菌,并通过药敏试验分析其耐药性。以大肠杆菌ER2738菌株为宿主菌,从养殖场污水中进行噬菌体的初步增殖,通过点滴法确定分离噬菌体的宿主谱,采用双层琼脂平板法分离纯化特异性裂解大肠杆菌的噬菌体,进一步对其形态、最佳感染复数(MOI)、生长曲线、酸碱度和温度耐受性等生物学特性进行研究;通过高通量测序平台测定其全基因组序列,并对其基因组及遗传进化特征进行分析。[结果]从病死山羊肺脏中分离到1株多重耐药性大肠杆菌,命名为YNEC001。从养殖场污水中分离到1株可特异性裂解YNEC001菌株的噬菌体BP32,电镜观察显示噬菌体BP32属于肌尾科噬菌体,最佳MOI为0.1,潜伏期约为30 min,爆发期持续约60 min,裂解量约为660 PFU/cell,在30~50℃和pH 4.0~10.0条件下可保持稳定的活性。噬菌体BP32基因组长度为166346 bp,GC含量偏低(35.42%),未发现耐药基因和毒力因子,基因组共包含261个开放阅读框(ORF),其中125个为已知功能基因,含有8个tRNA。在全基因组水平上,噬菌体BP32与肠杆菌噬菌体Escherichia phage BF15(MW822007)核苷酸序列相似性最高(98.25%),但基于末端酶大亚基序列的进化分析则表明BP32与大肠杆菌噬菌体Escherichia phage vB_EcoM_SP1(MT682709)的亲缘关系最近,而与Escherichia phage BF15(MW822007)的关系较远。[结论]本研究分离到1株多重耐药大肠杆菌YNEC001,并分离到可特异性裂解YNEC001菌株的噬菌体BP32,该噬菌体具有较强的裂解能力和良好的稳定性,具备开发为耐药性大肠杆菌治疗制剂的潜力。

关键词：多重耐药大肠杆菌噬菌体生物学特征全基因组分析

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2020年云南省鸡呼吸系统疫病病因分析

家畜生态学报 2024年第3期45卷 68-74页

作者：张振兴李占鸿王斌宋建领云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 威信县动物疫病预防控制中心云南威信657900

为了分析云南省2020年度鸡呼吸系统疫病病因,分别在昆明、红河、曲靖、大理、楚雄、昭通等地111个养鸡场采集疑似发生呼吸系统疫病鸡肺脏、脾脏、喉气管等组织混合样品111份。采用PCR检测方法对疑似样品进行副鸡禽杆菌、鸡毒支原体(MG)... 详细信息

为了分析云南省2020年度鸡呼吸系统疫病病因,分别在昆明、红河、曲靖、大理、楚雄、昭通等地111个养鸡场采集疑似发生呼吸系统疫病鸡肺脏、脾脏、喉气管等组织混合样品111份。采用PCR检测方法对疑似样品进行副鸡禽杆菌、鸡毒支原体(MG)、滑液囊支原体(MS)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽流感病毒(AIV)、鼻气管鸟杆菌(ORT)等传染性疾病病原核酸检测,对部分核酸样品进行测序验证。结果表明,副鸡禽杆菌、MG、MS、NDV、IBV、ILTV、ATV、ORT的检测阳性率分别为18.92%(21/111)、10.81%(12/111)、5.41%(6/111)、4.50%(5/111)、2.70%(3/111)、39.64%(44/111)、9.00%(10/111)、18.92%(21/111);混合感染占32.43%(36/111),2种、3种和4种病原混合感染分别占18.92%(21/111)、11.71%(13/111)和1.80%(2/111)。由此可见,云南省2020年度鸡呼吸系统疾病由多种原因引起,其中以副鸡禽杆菌、ILTV、ORT为主。

关键词：鸡呼吸系统疫病进化分析阳性率

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 395-400页

作者：杨恒李占鸿宋子昂高林李卓然廖德芳肖雷李华春昆明学院农学与生命科学学院昆明650214 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224 南京农业大学动物医学院南京210095

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,... 详细信息

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

关键词：帕利亚姆病毒血清型鉴定实时荧光定量RT-PCR 检测方法

口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立

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中国动物检疫 2024年第6期41卷 97-102页

作者：寇美玲谢佳芮李占鸿张振兴苏晓航王轶男宋建领苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短... 详细信息

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。

关键词：口蹄疫病毒重组酶介导链置换核酸扩增侧流层析试纸恒温扩增快速检测

蓝舌病病毒感染对BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素应答的影响

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中国兽医学报 2024年第8期44卷 1639-1644,1690页

作者：罗世美陈韵伊李其沙周艳梅王怡斐廖芯玉胡雪柔魏远健李梦琴朱萌张迅陈贝蕊马鲜平谢佳芮寇美玲苗海生李芳易华山西南大学动物医学院重庆荣昌402460 云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 重庆市大足区动物疫病预防控制中心重庆大足402360

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒,为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析... 详细信息

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒,为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析干扰素通路基因mRNA表达特征,以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-Ⅰ和TBK1蛋白表达。结果表明,在诱导24 h时,干扰素信号通路基因表达的变化最为明显,IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ、TBK1、MDA5、VISA、TRAF3基因的mRNA表达水平呈上调表达,而IKKε、TRAF6基因的mRNA表达水平呈下调表达,在蛋白水平上MDA5、TBK1蛋白上调表达而RIG-Ⅰ、TRAF3蛋白下调表达,表明BTV感染诱导BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答,为进一步探究IFN-Ⅰ信号通路调控基因在BTV感染的宿主细胞抗病毒免疫机制研究奠定基础。

关键词：蓝舌病病毒天然免疫 Ⅰ型干扰素 BHK-21