牛呼吸道疾病综合征3种病菌三重TaqMan荧光定量PCR方法的建立

作     者：李富祥 赵文华 高华峰 宋建领 LI Fuxiang;ZHAO Wenhua;GAO Huafeng;SONG Jianling

作者机构：云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室 

出 版 物：《中国兽医科学》 (Chinese Veterinary Science)

年 卷 期：2024年第54卷第12期

页      面：1586-1594页

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：云南省奶牛产业技术体系(2024KJTX-17) 云南省重大科技专项(202302AE090010) 

主　　题：多杀性巴氏杆菌 溶血性曼氏杆菌 牛支原体 牛呼吸道疾病综合征 TaqMan荧光定量PCR 

摘      要：为建立牛呼吸道疾病综合征3种常见病原菌多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）和牛支原体（Mycoplasma bovis）的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法，根据3种病原菌的16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针，通过反应体系和扩增程序优化，建立了3种病原菌的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示，利用建立的方法对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体DNA样品的检测为阳性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门菌等牛常见24种细菌DNA样品的检测为阴性，表明该方法特异性较强；敏感性试验结果显示，该方法对重组质粒pMD-Past、p MD-Mann和p MD-Myco的最低检出限分别为38、45和28 copies/μL，表明该方法敏感性较高；重复性试验结果显示，该方法变异系数≤2.15%，表明该方法重复性较好。利用建立的三重TaqMan荧光定量PCR方法和文献报道的TaqMan荧光定量PCR方法平行检测43份呼吸道疾病病牛的DNA样品，结果显示，两种方法检测多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体的总符合率分别为100%、97.7%和100%。结果表明，本研究建立的三重TaqMan荧光定量PCR方法为牛呼吸道疾病综合征3种常见病原菌的高通量快速检测提供了有效的技术支撑。