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p53^(V149F)突变打靶载体及细胞模型的构建

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云南农业大学学报（自然科学版） 2024年第3期39卷 64-71页

作者：曹攀蔡洁张晓银熊喆角德灵赵恒徐凯祥赵红业云南省动物基因编辑与体细胞克隆技术重点实验室云南昆明650201 云南省异种器官移植工程研究中心云南昆明650201 云南农业大学植物保护学院云南昆明650201 云南农业大学动物医学院云南昆明650201

[目的]构建p53基因突变模型,为研究p53基因突变引发肿瘤的发生和进展提供细胞模型资源。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据p53^(V149F)突变位点的序列,在线设计合成单链向导sgRNA,构建CRISPR打靶载体;将重组载体转染细胞,流式分... 详细信息

[目的]构建p53基因突变模型,为研究p53基因突变引发肿瘤的发生和进展提供细胞模型资源。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据p53^(V149F)突变位点的序列,在线设计合成单链向导sgRNA,构建CRISPR打靶载体;将重组载体转染细胞,流式分选阳性细胞群,提取细胞基因组,Sanger测序分析Cas9核酸酶对靶位点的切割情况,构建同源修复模板,通过T7EN1试验进一步检测编辑效率;将重组载体和同源模板通过电转染方法共同转染至成纤维细胞中,通过单克隆挑取、PCR和Sanger测序鉴定挑取含目标突变的细胞株。[结果]成功构建靶向p53基因目标区域的CRISPR/Cas9打靶载体;获得5个含目标突变的克隆点,点突变率为10%,测序结果出现套峰,表明出现基因型多样化;1个细胞克隆的测序结果无杂峰,TA克隆鉴定结果表明:一个等位基因存在p53^(V149F)位点突变,另一个等位基因存在240 bp缺失。[结论]成功构建了含p53^(V149F)的细胞系,并对基因的功能进行了初步验证,为进一步构建两基因同时修饰模型奠定了基础,并为药物筛选提供可用的细胞模型资源,为创制模拟疾病发生的遗传模式和临床表现的小型猪实验动物模型奠定了基础。

关键词：基因编辑打靶载体癌症 p53基因

昆明犬IGF1基因在肝脏中的表达特征及遗传多样性分析

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黑龙江畜牧兽医 2024年第4期 108-114页

作者：韦云芳李飞翔汪斌陈方良魏红江云南农业大学动物科学技术学院昆明650201 云南省小型猪基因编辑与异种器官移植重点实验室昆明650201 公安部昆明警犬基地昆明650204 警犬技术公安部重点实验室昆明650204

为了探究IGF1基因在不同生长发育阶段昆明犬肝脏中的表达特征,并筛选与昆明犬体重和体尺性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,试验首先采用实时荧光定量PCR方法检测IGF1基因在不同年龄段昆明犬肝脏中的m... 详细信息

为了探究IGF1基因在不同生长发育阶段昆明犬肝脏中的表达特征,并筛选与昆明犬体重和体尺性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,试验首先采用实时荧光定量PCR方法检测IGF1基因在不同年龄段昆明犬肝脏中的mRNA表达水平,然后分别针对IGF1基因5′和3′侧翼序列、外显子1~4和内含子1设计引物,采用PCR-单链构象多态性(SSCP)技术对昆明犬IGF1基因单核苷酸多态性(SNP)位点进行筛查,通过测序分析其突变情况,统计该SNP位点的基因型频率和基因频率及遗传多样性指标[纯合度(homozygosity,Ho)、杂合度(heterozygosity,He)和有效等位基因数(number of effective alleles,Ne)],最后分析该SNP位点与昆明犬体重和体尺性状的关联性。结果表明:IGF1基因在5个年龄段的昆明犬肝脏中均有表达,且表达量随着月龄的增大呈现逐渐下降的趋势;与2月龄比较,6,12,20,30月龄昆明犬肝脏中IGF1基因的相对表达量均极显著降低(P基因仅外显子3中识别到1个SNP位点,其他区域未识别到SNP位点。该位点位于外显子3第464位核苷酸处,发生了T→C的点突变,但氨基酸未变,命名为T464C位点。T464C位点在昆明犬群体中共存在两种基因型,分别为TT纯合型和TC杂合型,其中优势基因型为TT纯合型,优势等位基因为T,表现为低度多态(PIC基因T464C位点TT纯合型个体胸深、头长显著高于TC杂合型个体(P基因在昆明犬生长发育过程中具有重要作用,T464C位点可作为昆明犬品种培育的潜在辅助选择标记。

关键词：昆明犬胰岛素样生长因子1(IGF1) 差异表达单核苷酸多态性(SNP) 遗传多样性关联性分析

昆明犬IGF1R基因外显子多态性与体重和体尺性状的关联性分析

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黑龙江畜牧兽医 2024年第12期 115-121页

作者：韦云芳李飞翔彭建国陈方良魏红江云南农业大学动物科学技术学院昆明650201 云南省小型猪基因编辑与异种器官移植重点实验室昆明650201 公安部昆明警犬基地昆明650204 警犬技术公安部重点实验室昆明650204

为了解胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)基因外显子多态性与昆明犬体重和体尺性状的关系,从而为优质昆明犬的培育寻找可靠的分子选择标记,试验采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对昆明犬IGF1R基因外显子区域单核苷酸多态性(single nucl... 详细信息

为了解胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)基因外显子多态性与昆明犬体重和体尺性状的关系,从而为优质昆明犬的培育寻找可靠的分子选择标记,试验采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对昆明犬IGF1R基因外显子区域单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点进行筛选,通过测序分析其突变情况,统计SNP位点的优势基因型、优势等位基因、多态信息含量(polymorphism information content, PIC)、纯合度(homozygosity, Ho)、杂合度(heterozygosity, He)、有效等位基因数(number of effective alleles, Ne)、Hardy-Weinberg平衡状态,并采用一般线性模型分析SNP位点与昆明犬体重和体尺性状的关联性。结果表明:在昆明犬IGF1R基因外显子中仅识别到1个SNP位点,该位点位于外显子8的第1 773位核苷酸处,发生了C→T的点突变,但氨基酸未变,命名为C1773T位点。C1773T位点在昆明犬群体中共存在两种基因型,分别为CC纯合型和CT杂合型,其中优势基因型为CC纯合型,优势等位基因为C,表现为低度多态(PIC基因C1773T位点CT杂合型个体胸宽显著高于CC纯合型个体(P0.05)。说明IGF1R基因C1773T位点对昆明犬胸宽具有一定影响,可作为昆明犬品种培育的潜在分子选择标记。

关键词：昆明犬 IGF1R基因基因多态性体尺性状关联性分析

大黄鱼C型凝集素受体Clec4e的分子鉴定及凝集特性

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水产学报 2024年第2期48卷 31-45页

作者：张鑫洛王永阳吴子良黄小红陈新华张伟妮海水养殖生物育种全国重点实验室福建省海洋生物技术重点实验室福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室

为了揭示硬骨鱼C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CTLR)的生物学功能，实验以从大黄鱼转录组数据库中筛选出的一个CTLR基因—C型凝集素结构域家族4成员E基因(Clec4e)为研究对象，研究其分子特征、表达分布和凝集特性。结果显示，Lc... 详细信息

为了揭示硬骨鱼C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CTLR)的生物学功能，实验以从大黄鱼转录组数据库中筛选出的一个CTLR基因—C型凝集素结构域家族4成员E基因(Clec4e)为研究对象，研究其分子特征、表达分布和凝集特性。结果显示，LcClec4e cDNA全长1 546 bp，开放阅读框(ORF)771 bp，编码254个氨基酸。LcClec4e的N端有一个跨膜区，无信号肽，C端含有一个糖识别结构域(CRD)，其中含有糖结合位点EPN和WFD以及6个可形成二硫键的保守半胱氨酸。系统发育分析表明，LcClec4e与多种鲈形目鱼类Clec4e具有较近的亲缘关系。荧光定量PCR结果显示，LcClec4e在所检测的10种组织中呈组成型分布，且在肝脏中表达量最高；LcClec4e在来源于大黄鱼头肾组织的原代巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞中均有表达，且在巨噬细胞中表达量最高；经灭活溶藻弧菌刺激后，LcClec4e在3种免疫细胞中的表达均极显著上调。原核表达的重组LcClec4e胞外段(recombinant LcClec4e-extracellular domain,rLcClec4e-ex)具有Ca2+依赖性的凝集活性，可凝集小鼠、家兔的红细胞，以及嗜水气单胞菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌等4种水产常见的革兰氏阴性菌。D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、α-乳糖和脂多糖均可抑制rLcClec4e-ex对大黄鱼重要病原菌变形假单胞菌的凝集作用，说明LcClec4e可能与变形假单胞菌表面的糖类物质结合。上述结果提示，LcClec4e可能作为一种模式识别受体，通过结合病原菌表面的糖类病原体相关分子模式来识别病原，参与大黄鱼抗细菌感染的免疫防御。

关键词：大黄鱼 C型凝集素受体(CTLR) Clec4e 红细胞凝集细菌凝集

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蚤亚科线粒体基因组研究进展

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第3期42卷 389-398页

作者：林小霞董文鸽大理大学病原与媒介生物研究所云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室云南大理671000

蚤亚科(Pulicinae)隶属于蚤目(Siphonaptera)蚤总科(Pulicoidea)蚤科(Pulicidae),是啮齿动物和猫犬常见的嗜血性体外寄生虫。已测定的蚤亚科共3属5种(猫栉首蚤、犬栉首蚤、东洋栉首蚤、印鼠客蚤和人蚤),其线粒体基因组的结构特征和变异... 详细信息

蚤亚科(Pulicinae)隶属于蚤目(Siphonaptera)蚤总科(Pulicoidea)蚤科(Pulicidae),是啮齿动物和猫犬常见的嗜血性体外寄生虫。已测定的蚤亚科共3属5种(猫栉首蚤、犬栉首蚤、东洋栉首蚤、印鼠客蚤和人蚤),其线粒体基因组的结构特征和变异情况具有以下特点:线粒体基因组保留了节肢动物典型的排列模式,未发生基因缺失、增加和重排现象;AT含量较高,且AT-偏斜和GC-偏斜均为负值,与大多数全变态类昆虫一样,密码子使用度具有明显的偏好性;人蚤的丝氨酸转运RNA (trnS1)呈典型的三叶草结构,其余物种与后生动物一样trnS1缺失D-臂,且5种蚤亚科物种的trnS1以UCU为反密码子代替了常见的GCU;蚤亚科控制区偏大,最大可达7 kb以上,主要以二核苷酸重复为主,NADH脱氢酶亚基4 (nad4)~nad4L之间存在7 bp的保守重叠区,与多数全变态类昆虫一致。本文以期对今后蚤亚科在全变态类昆虫中的演化提供参考。

关键词：蚤亚科线粒体基因组系统发育分子进化

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拟南芥和大豆中用于RNA研究的细胞核制备和优化

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植物生理学报 2024年第5期60卷 823-836页

作者：何思豪苏京董志诚刘敏朱家富广东省植物适应性与分子设计重点实验室广州市作物基因编辑重点实验室分子遗传与进化创新中心广州大学生命科学学院广州510006

本研究旨在优化植物细胞核提取方法,以支持对核RNA完整性要求严格的转录组研究,如新生RNA检测方法、单细胞核RNA测序及其他组学技术。核心实验基于改进的Honda提取液配方,通过结合甘油、蔗糖和己二醇等三种渗压剂,并在此基础上添加或不... 详细信息

本研究旨在优化植物细胞核提取方法,以支持对核RNA完整性要求严格的转录组研究,如新生RNA检测方法、单细胞核RNA测序及其他组学技术。核心实验基于改进的Honda提取液配方,通过结合甘油、蔗糖和己二醇等三种渗压剂,并在此基础上添加或不添加聚蔗糖和葡聚糖T-40(Ficoll&Dextran T-40),形成六种不同的细胞核提取液。这些提取液被用于评估其在拟南芥和大豆样本中提取细胞核的效果。结果表明,含有己二醇的提取液在提取细胞核RNA及蛋白质方面表现出最高的得率,此外己二醇结合Ficoll&Dextran T-40能显著增强核RNA的纯度和完整性。此项研究为植物科学领域的组学研究提供了一种高效的细胞核提取方法,具有重要的参考价值。

关键词：细胞核RNA 拟南芥大豆核提取缓冲液己二醇

山羊NPC1基因核心启动子鉴定与转录调控分析

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中国动物传染病学报 2024年第3期32卷 154-163页

作者：李崇瑞陈思翟哲王雪梅吴艳茹刘志勇蒋俊明满初日嘎杜丽王凤阳海南大学动物科技学院海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口市动物基因工程重点实验室海口570228

NPC1基因编码的C型尼曼匹克蛋白1(NPC1)参与脂筏形成、病原微生物内吞以及内吞体的胞内转运等过程。本试验旨在阐明海南黑山羊NPC1基因的转录调控机制,为研究病原微生物与宿主细胞互作提供理论参考。首先,以山羊NPC1基因1466 bp启动子... 详细信息

NPC1基因编码的C型尼曼匹克蛋白1(NPC1)参与脂筏形成、病原微生物内吞以及内吞体的胞内转运等过程。本试验旨在阐明海南黑山羊NPC1基因的转录调控机制,为研究病原微生物与宿主细胞互作提供理论参考。首先,以山羊NPC1基因1466 bp启动子序列为模板,构建9个启动子5'端连续缺失的双荧光素酶报告载体,筛选NPC1基因核心启动子区;继而对核心启动子区的关键转录因子进行预测分析,构建转录因子结合位点缺失的双荧光素酶报告载体,筛选NPC1基因的关键转录因子结合位点。结果表明:山羊NPC1基因的核心启动子区位于转录起始位点上游-195 bp至-60 bp,并且该区域存在E2F3(-134/-120 bp)、SREBP-1(-107/-96 bp)、SP1(-68/-62 bp)等多个转录因子结合位点。双荧光素酶报告实验结果表明,缺失E2F3、SREBP-1、SP1三个转录因子结合位点均会使山羊NPC1基因启动子的转录活性显著下降(P基因转录活性下降最显著。提示,SREBP-1转录因子对海南黑山羊NPC1基因转录活性具有重要的调控作用。本试验成功鉴定山羊NPC1基因的核心启动子区(-195/-60 bp)及该区域的关键转录因子结合位点SREBP-1,为进一步研究山羊NPC1基因介导病原微生物与宿主互作分子机制提供理论基础。

关键词：海南黑山羊 NPC1基因转录调控核心启动子 SREBP-1

标准全消化道可消化钙、磷含量对断奶仔猪肠-肝-肾轴钙、磷吸收的影响及机制

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动物营养学报 2024年第7期36卷 4243-4257页

作者：孙焱杰韦洋洋苗振彦熊云霞吴绮雯杨雪芬王丽蒋宗勇易宏波黄艳娜广西大学动物科学技术学院南宁530004 广东省农业科学院动物科学研究所猪禽种业全国重点实验室农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室广东省畜禽育种与营养研究重点实验室广州510640

本试验旨在研究标准全消化道可消化钙(STTD Ca)和标准全消化道可消化磷(STTD P)含量对7~25 kg断奶仔猪钙、磷吸收的影响。选取21日龄、体重接近的杜长大杂交断奶仔猪144头,随机分为6组,每组6个重复,每个重复4头猪(阉公猪和母猪各2头)。... 详细信息

本试验旨在研究标准全消化道可消化钙(STTD Ca)和标准全消化道可消化磷(STTD P)含量对7~25 kg断奶仔猪钙、磷吸收的影响。选取21日龄、体重接近的杜长大杂交断奶仔猪144头,随机分为6组,每组6个重复,每个重复4头猪(阉公猪和母猪各2头)。第1~6组饲粮中STTD Ca和STTD P的比例均为1.2,STTD P含量分别为0.18%、0.26%、0.34%、0.42%、0.50%、0.58%,STTD Ca含量分别为0.216%、0.312%、0.408%、0.504%、0.600%、0.696%。试验期42 d。结果表明:1)随着饲粮中STTD Ca和STTD P的含量逐渐升高,血清碱性磷酸酶活性逐渐降低,但组间没有显著差异(P>0.05),血清降钙素(CT)、甲状腺素(T 4)、1,25二羟维生素D 3[1,25(OH)D 3]、甲状旁腺素(PTH)含量逐渐升高,且6组显著高于1组(P0.05)。3)所有组肠道结构完整,1和2组十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著高于5和6组(P基因相对表达量显著高于1和5组(P基因相对表达量显著高于4、5和6组(P细胞色素P450家族成员24A1(CYP24A1)的基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量显著高于2和5组(P基因相对表达量显著高于2组(P基因相对表达量显著高于2组(P基因相对表达量显著高于1和2组(P基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量逐渐降低,1和2组CYP24A1的基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量先升高后降低,当升高到NRC(2012)推荐STTD P添加量(STTD P含量为0.34%~0.42%)时到达最大;3和4组PTH1R的基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量显著高于其他组(P基因相对表达量显著高于4组(P基因相对表达量显著高于其他组(P<0.05)。综上所述,饲粮中STTD Ca和STTD P的比例为1.2时,随着饲粮中STTD Ca和STTD P的含量逐渐升高,十二指肠和结肠对钙、磷的吸收能力逐渐减弱,空肠对钙、磷的吸收能力逐渐增强,肝脏对钙、磷吸收能力逐渐降低。当饲粮中STTD Ca和STTD P的含量增加到NRC(2012)推荐的STTD P添加量(饲粮STTD P含量为0.34%~0.42%)时,肾脏对钙、磷重吸收的能力最强。结合血清钙、磷含量数据,当饲粮中STTD Ca和STTD P的含量分别在0.216%~0.312%和0.18%~0.26%时,断奶仔猪能有效利用饲粮钙、磷。

关键词：断奶仔猪 STTD Ca STTD P 肠道肾脏肝脏钙、磷吸收

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Pcgf2促进鸡胚成纤维细胞重编程形成诱导多能干细胞

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华南农业大学学报 2024年第3期45卷 311-320页

作者：姚梓淇廖立钦宋佳蓓张新珩谢青梅华南农业大学动物科学学院/岭南现代农业科学与技术广东省实验室河源分中心/广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广东广州510642

【目的】以提高诱导鸡多能干细胞的干性为目的,利用Pcgf2基因与传统诱导多能干细胞的重编程因子共同诱导鸡多能干细胞。【方法】以鸡早期胚胎为模板,对Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4这6种传统的重编程因子及Pcgf2进行基因扩增... 详细信息

【目的】以提高诱导鸡多能干细胞的干性为目的,利用Pcgf2基因与传统诱导多能干细胞的重编程因子共同诱导鸡多能干细胞。【方法】以鸡早期胚胎为模板,对Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4这6种传统的重编程因子及Pcgf2进行基因扩增,并与慢病毒载体重组为慢病毒质粒,在包装慢病毒并测定相对应的病毒滴度后,分组感染鸡胚成纤维细胞,在诱导的过程中对干细胞标记物进行检测。【结果】利用传统的重编程因子组合与加入Pcgf2共同诱导后的细胞都较早地表达出磷酸酶活性。加入Pcgf2诱导多能干细胞可以使细胞更早地出现类干细胞形态,且内源性基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到更稳定的提高。【结论】Pcgf2在加入诱导体系后可以有效提高细胞的重编程接近干细胞状态。该研究可为选择重编程因子诱导鸡细胞完全重编程及其机制研究提供理论参考。

关键词：鸡慢病毒多能转录因子鸡胚成纤维细胞体细胞重编程诱导多能干细胞