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文昌鱼胰岛素样肽的表达、纯化、鉴定及其多克隆抗体制备

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生物化学与生物物理学报 2001年第6期33卷 629-633页

作者：沈璐郭占云陈衍刘兰英冯佑民吉林大学生命科学院中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所?

为了深入研究胰岛素和胰岛素样生长因子 1(IGF 1)的起源和进化以及结构与功能的关系 ,表达了胰岛素和IGF 1的祖先分子———文昌鱼胰岛素样肽 (ILP)。重组单链ILP的基因用化学方法合成 (从cDNA推测的ILPB结构域的C端与A结构域的N端用Ala... 详细信息

为了深入研究胰岛素和胰岛素样生长因子 1(IGF 1)的起源和进化以及结构与功能的关系 ,表达了胰岛素和IGF 1的祖先分子———文昌鱼胰岛素样肽 (ILP)。重组单链ILP的基因用化学方法合成 (从cDNA推测的ILPB结构域的C端与A结构域的N端用Ala Ala Lys三肽连接起来 ,并将B2 8Arg突变为Lys) ,克隆到表达载体pVT10 2 U中 ,ILP在酿酒酵母中得到有效表达。发酵液经 4步分离纯化 ,得到均一的单链ILP ,经质谱测定分子量和氨基酸组成分析证明表达产物正确。通过Lys C蛋白内切酶处理将重组单链ILP转化成双链形式。虽然双链ILP与人胰岛素受体没有结合活力 ,但圆二色性光谱显示它与胰岛素的结构非常相似。用表达的单链ILP免疫新西兰大白兔 ,获得了高滴度的多克隆抗体。

关键词：胰岛素胰岛素样生长因子1 胰岛素样肽文昌鱼表达

重组活性小鼠组织因子及其阻断性单抗的制备与应用

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生物化学与生物物理进展 2009年第5期36卷 601-607页

作者：裴新辉池姗王尽淘林志新张雪洪耿建国上海交通大学生命科学与技术学院上海200240 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子细胞生物学实验室上海200031

组织因子是一种位于细胞膜上的糖蛋白,是外源性凝血过程的关键启动因子,近年来其在肿瘤细胞迁移等其他过程中的重要作用也已逐渐被揭示.构建了融合有His标签的小鼠组织因子胞外区段重组蛋白基因,利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统成功表达... 详细信息

组织因子是一种位于细胞膜上的糖蛋白,是外源性凝血过程的关键启动因子,近年来其在肿瘤细胞迁移等其他过程中的重要作用也已逐渐被揭示.构建了融合有His标签的小鼠组织因子胞外区段重组蛋白基因,利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统成功表达并得到大量可溶性重组小鼠组织因子.利用血浆凝集实验和鼠尾流血时间实验对此重组小鼠组织因子进行的活性检测表明,此重组蛋白具有良好的生物活性,可以引起血浆凝血或缩短鼠尾流血时间.同时,利用此重组蛋白为抗原,制备了小鼠组织因子的小鼠源功能阻断性单克隆抗体,在血浆凝集实验中证明其对小鼠组织因子的活性有明显抑制作用.利用此阻断性单抗,成功地在小鼠深静脉血栓模型中减轻了血栓形成,证明组织因子在深静脉血栓的病程发展中起重要作用,这也是组织因子阻断性单抗在此类动物模型中的首次成功应用.通过此项工作,成功地建立了大量制备具有良好生物活性的重组小鼠组织因子蛋白的方法,并进而得到了小鼠组织因子功能阻断性单抗,为利用各种小鼠动物模型对组织因子在各项生命活动中的作用进行深入研究奠定了良好的基础.

关键词：小鼠组织因子昆虫杆状病毒昆虫细胞Sf9 功能阻断性单克隆抗体

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人Septin家族成员KIAA0202与hPFTAIRE1的相互作用

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第4期34卷 520-525页

作者：杨弢高衍昆陈江野中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

hPFTAIRE1是一个人Cdc2相关激酶 ,分布在胞液中。为了寻找hPFTAIRE1的底物及调控蛋白 ,将hPFTAIRE1与LexA蛋白融合 ,作为靶蛋白筛选人脑LexA双杂交文库 ,筛选到了包括KIAA0 2 0 2在内的 7个hPFTAIRE1结合蛋白。免疫共沉淀实验证实了KIAA... 详细信息

hPFTAIRE1是一个人Cdc2相关激酶 ,分布在胞液中。为了寻找hPFTAIRE1的底物及调控蛋白 ,将hPFTAIRE1与LexA蛋白融合 ,作为靶蛋白筛选人脑LexA双杂交文库 ,筛选到了包括KIAA0 2 0 2在内的 7个hPFTAIRE1结合蛋白。免疫共沉淀实验证实了KIAA0 2 0 2和hPFTAIRE1的相互作用。KIAA0 2 0 2是一个septin家族成员 ,含 5 0 8个氨基酸 ,与人septin2有最高的同源性 ,达 70 % ,蛋白质分子中部是一个septin家族特有的GTP-CDC保守结构域。KIAA0 2 0 2和hPFTAIRE1的相互作用提示KIAA0 2 0 2在hPFTAIRE1的功能调控中有重要作用。

关键词： hPFTAIRE1 KIAA0202 septin 酵母双杂交

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氨基酰-tRNA合成酶与神经退行性疾病

生物化学与生物物理进展 2007年第6期34卷 562-566页

作者：朱斌王恩多中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

氨基酰-tRNA合成酶催化tRNA的氨基酰化反应为生物体内的蛋白质合成提供原料.这类古老且保守的蛋白质分子在高等生物复杂的细胞分子网络中分化出的新功能是目前人们关注的焦点.近期在对一些患有神经退行性疾病的病人和小鼠模型的研究中发... 详细信息

氨基酰-tRNA合成酶催化tRNA的氨基酰化反应为生物体内的蛋白质合成提供原料.这类古老且保守的蛋白质分子在高等生物复杂的细胞分子网络中分化出的新功能是目前人们关注的焦点.近期在对一些患有神经退行性疾病的病人和小鼠模型的研究中发现,位于酪氨酰-tRNA合成酶、甘氨酰-tRNA合成酶和丙氨酰-tRNA合成酶上的突变,可分别导致DI腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease,CMT)C型,腓骨肌萎缩症2D型及小脑浦肯雅(Purkinje)细胞丢失.初步的致病机理研究表明,致病突变对这3种酶的影响各不相同:酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酰化催化能力受到影响,甘氨酰-tRNA合成酶受影响的可能是一种未知的新功能,而丙氨酰-tRNA合成酶受影响的则是它的编校功能.这些研究结果揭示了氨基酰-tRNA合成酶涉及神经退行性疾病的广泛性和其机制的复杂性,并将促进对神经退行性疾病这一类常见疾病的病理和治疗方法的研究.

关键词：氨基酰-tRNA合成酶酪氨酰-tRNA合成酶甘氨酰-tRNA合成酶丙氨酰-tRNA合成酶神经退行性疾病腓骨肌萎缩症浦肯雅(Purkinje)细胞

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一种提高固定pH梯度(IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法(英文)

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生物化学与生物物理学报 2003年第7期35卷 611-618页

作者：袁泉安杰刘定干赵辅昆中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Mult... 详细信息

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Multi stripsononeSDSgel,MSOG)电泳。用此方法比较了人肝癌细胞、不同生长状态的人肝癌细胞、3T3细胞的蛋白质以及同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统 (大型和中型凝胶 )的双向电泳图谱。结果表明 ,同一样品在 13cmIPGStrip双向电泳可分离 2 0 0 0以上蛋白质点且图谱蛋白质点的匹配率可超过 95 %以上。同时又可以最大程度地降低凝胶背景对蛋白质点比较分析的干扰 ,从而提高了双向电泳分离蛋白质的分辨率和通量。这些优点都有助于差异蛋白质组学特别是细胞器差异蛋白质组学研究的自动化。

关键词：双向电泳同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶的方法重复性高通量蛋白质组学

成骨生长肽的合成及其与粒细胞集落刺激因子之间的协同作用(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第2期35卷 177-181页

作者：刘智慧邵云潮陈红红施德源陈统一崔大敷中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所上海200031 复旦大学附属中山医院骨科上海益众生物技术有限公司上海200030 上海201203 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所

Fmoc法固相合成成骨生长肽 (sOGP) ,HPLC鉴定纯度大于 98.6 % ,质谱测定 ,分子量 15 2 3.5kD ,与理论分子量相符 ,N端全序列测定结果正确。Balb/c小鼠体内实验证实sOGP与临床使用的人重组粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)之间有明显的协同... 详细信息

Fmoc法固相合成成骨生长肽 (sOGP) ,HPLC鉴定纯度大于 98.6 % ,质谱测定 ,分子量 15 2 3.5kD ,与理论分子量相符 ,N端全序列测定结果正确。Balb/c小鼠体内实验证实sOGP与临床使用的人重组粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)之间有明显的协同作用。实验共分两部分 :第一 ,sOGP共给予 13天 ,每天 1次 ,其中在给予sOGP 5天后开始同时给予rhG CSF ;第二 ,同时给予sOGP和rhG CSF ,每天 1次 ,连续 10天 (sOGP ,0 .5nmol/鼠 ;rhG CSF ,2 μg/鼠 )。两组都显示 ,sOGP能显著地协同rhG CSF促进外周血白细胞数和淋巴细胞数增加 ,但对外周血红细胞和血小板数无影响。骨髓有核细胞记数、骨髓涂片、胸骨切片和脾脏切片显示 ,联合给予sOGP及rhG CSF并未造成髓系和淋巴系异常增生。因此 ,sOGP是一种可以增强目前临床上广泛使用的rhG CSF功能的新的因子 ,是一种极有开发前景的新药。

关键词：成骨生长肽粒细胞集落刺激因子协同造血固相合成

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酵母蛋白质YJL084c的磷酸化分析

生物化学与生物物理学报 2002年第4期34卷 433-438页

作者：石晓钟敖世洲中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

PCL6、PCL7(PAP1)和PHO80为酵母蛋白激酶PHO85的细胞周期蛋白因子 ,同属于PHO80亚类 ,它们在蛋白质序列上有较高的同源性 ,彼此在功能上有一定程度的重叠。YLR190w为先前鉴定的PCL7 PHO85的一个底物 ,根据BLAST比较 ,YJL0 84c与YJLR190... 详细信息

PCL6、PCL7(PAP1)和PHO80为酵母蛋白激酶PHO85的细胞周期蛋白因子 ,同属于PHO80亚类 ,它们在蛋白质序列上有较高的同源性 ,彼此在功能上有一定程度的重叠。YLR190w为先前鉴定的PCL7 PHO85的一个底物 ,根据BLAST比较 ,YJL0 84c与YJLR190w在一段区域内有一定的同源性 ,并且根据已公布公共数据库 ,YJL0 84c是PCL6的一个结合蛋白。利用双杂交系统分析了YJL0 84c与这三个细胞周期蛋白因子之间的相互作用 ,表明PCL7也可以结合YJL0 84c。利用免疫共沉淀证实它们在体内的相互作用 ;通过体外GST沉降分析 ,验证它们的体外相互作用。YJL0 84c的体外翻译产物可以被PCL7 PHO85复合物磷酸化 ,进一步分别表达纯化YJL0 84c的氨基末端、中间和羧端三部分的GST融合蛋白片段 ,PCL7 PHO85复合物可以磷酸化其中间部分 ,而对N末端和C末端则未表现出磷酸化。以该中间片段蛋白质为底物 ,进一步研究高低磷条件对其磷酸化的影响。PCL7 PHO85对YJL0 84c的磷酸化受到无机磷条件的明显影响 :高磷条件下 ,磷酸化程度高 ;而低磷条件下磷酸化程度低。有意思的是 ,PCL6 PHO85免疫沉淀复合物也表现出同样的磷酸激酶特征。于是分析PHO81与这三个细胞周期因子之间相互作用。此外 ,还构建了Yjl0 84c的缺失株 ,分析了缺失的可能影响。

关键词： PCL6 PCL7 YJL084c 磷酸化酵母双杂交系统

豚鼠生长激素受体及其突变体在哺乳动物细胞中的功能性表达(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第5期35卷 403-408页

作者：廖志勇张信娜景乃禾朱尚权中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

采用RT PCR克隆得到豚鼠生长激素受体cDNA。序列同源比较显示生长激素受体的一些功能性保守氨基酸在豚鼠生长激素受体中被其他氨基酸所取代。例如 ,哺乳动物生长激素受体中保守的第 170位组氨酸和第 333位酪氨酸分别是受体二聚化和生长... 详细信息

采用RT PCR克隆得到豚鼠生长激素受体cDNA。序列同源比较显示生长激素受体的一些功能性保守氨基酸在豚鼠生长激素受体中被其他氨基酸所取代。例如 ,哺乳动物生长激素受体中保守的第 170位组氨酸和第 333位酪氨酸分别是受体二聚化和生长激素刺激蛋白质合成及脂生成所必需的 ,但在豚鼠生长激素受体中分别被酪氨酸和丝氨酸所取代。为此 ,采用定点突变法得到了突变体gpGHRY16 8H和 gpGHRS332Y ,并构建了表达质粒 pcDNA3 gpGHR ,pcDNA3 gpGHRY16 8H和pcDNA3 gpGHRS332Y。借助COS 7和CHO细胞 ,研究了豚鼠生长激素受体及其突变体的生物活性。实验表明转染了pcDNA3 gpGHR的COS 7细胞对牛生长激素具有高亲和性 [Ka=1.3× 10 9(mol/L) -1],并且用鼠抗生长激素受体单克隆抗体mAb2 6 3可检测到一分子量约 92kD的蛋白质。在CHO细胞中 ,虽然两个氨基酸的定点突变不影响受体与配体的结合 ,但都提高了生长激素刺激的蛋白质合成而降低生长激素刺激的脂肪生成。蛋白质印迹实验揭示突变体 gpGHRY16 8和gpGHRS332Y分别降低和提高了生长激素诱导的JAK2酪氨酸磷酸化。因此 ,报道了豚鼠生长激素受体在生长激素代谢功能中的调节作用以及受体中保守氨基酸的取代导致配体结合后信号转导的变化。

关键词：豚鼠生长激素受体突变脂肪生成蛋白质合成

白色念珠菌CaBEM1基因的克隆及其在酿酒酵母丝状生长中的作用

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生物化学与生物物理学报 2002年第5期34卷 553-559页

作者：周舟刘浩平陈江野中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室 Department of Biological Chemistry College of Medicine University of California 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所上海200031 Irvine California9269

白色念珠菌在不同的生长条件下能发生显著的形态变化 ,这种变化由多种调控因子与信号转导途径所调控。酿酒酵母的G1期细胞周期蛋白Cln1和Cln2参与其形态发生 ,cln1/cln1、cln2 /cln2双缺失株不能形成菌丝。把白色念珠菌基因组文库导入cl... 详细信息

白色念珠菌在不同的生长条件下能发生显著的形态变化 ,这种变化由多种调控因子与信号转导途径所调控。酿酒酵母的G1期细胞周期蛋白Cln1和Cln2参与其形态发生 ,cln1/cln1、cln2 /cln2双缺失株不能形成菌丝。把白色念珠菌基因组文库导入cln1/cln1、cln2 /cln2缺失株 ,筛选能校正菌丝形成缺陷的基因 ,分离得到白色念珠菌中的CaBEM 1基因。从核苷酸序列推导 ,CaBEM1编码一种 6 32个氨基酸的蛋白质 ,氨基酸序列分析表明在其N端有 2个SH3结构域 ,中部有 1个PX结构域 ,C端有 1个PB1结构域 ;CaBem1的氨基酸序列与酿酒酵母的Bem1同源性达 38% ,与裂殖酵母的Scd2同源性达 32 %。在酿酒酵母的缺失株中异源表达CaBEM1,能够部分校正它们在氮源缺乏条件下的菌丝形成缺陷。这种菌丝形成的校正作用绕过MAPK途径和cAMP/PKA途径 ,表明CaBem1在菌丝形成中的作用可能位于这两条信号转导途径的下游

关键词：白色念珠菌 CaBEM1 丝状生长