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基因治疗产品质量控制策略及面临挑战

中国新药杂志 2022年第21期31卷 2090-2100页

作者：于雷史新昌秦玺王光裕李响周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

近年来基因疗法进入快速发展阶段,越来越多的产品进入临床研究阶段或获批上市,适应证涉及遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等。体内基因治疗产品是指在体内通过对人体细胞的遗传物质进行修饰、表达外源基因、操纵细胞基因表达... 详细信息

近年来基因疗法进入快速发展阶段,越来越多的产品进入临床研究阶段或获批上市,适应证涉及遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等。体内基因治疗产品是指在体内通过对人体细胞的遗传物质进行修饰、表达外源基因、操纵细胞基因表达或调控细胞生物学特性等方式达到治疗疾病目的的药品,其结构、功能及生产工艺较传统蛋白类药物更加复杂,潜在的安全性风险更高,如病毒安全性和遗传毒性。因此,质量控制工作面临更多挑战。本文基于体内基因治疗产品的研发、生产和质量控制现状以及相关法规、技术指南,探讨了基于“质量源于设计”理念的质量控制策略以及目前生产和质量控制面临的挑战和解决方案,为相关产品的质量控制提供参考。

关键词：体内基因治疗质量源于设计质量风险评估生产工艺质量控制

人粒细胞刺激因子生物学活性协标品均匀度分析

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中国新药杂志 2022年第9期31卷 850-853页

作者：朱留强刘兰于雷丁有学史新昌周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:分析人粒细胞刺激因子生物学活性协作标定样品(以下简称协标品)均匀度。方法:利用协标品协作标定数据中同一次实验中A组和B组配对数据差值估算协标品引入的不确定度,进而估算协标品的均匀度;以数据两两间差值的标准差和协标品引入... 详细信息

目的:分析人粒细胞刺激因子生物学活性协作标定样品(以下简称协标品)均匀度。方法:利用协标品协作标定数据中同一次实验中A组和B组配对数据差值估算协标品引入的不确定度,进而估算协标品的均匀度;以数据两两间差值的标准差和协标品引入的不确定度共同估计国际标准品引入的不确定度。结果:协标品的不确定度为0.27×10^(6)IU·支^(-1);扣除实验影响,协标品均匀度约为3%;国际标准品带来的不确定度为0.49×10^(6)IU·支^(-1)。结论:探讨生物学活性协标品均匀度分析方法,为其他标准品协作标定提供方案参考,也为该标准品的应用提供数据支持。

关键词：人粒细胞刺激因子生物学活性协作标定样品协作标定均匀度不确定度

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中国脑膜炎球菌疫苗发展现状与挑战

中国公共卫生 2022年第7期38卷 948-951页

作者：徐颖华李亚南叶强中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

接种疫苗是预防流行性脑脊髓膜炎(流脑)最有效、最经济的方法,在过去几十年,随着疫苗的广泛使用,流脑发病率显著下降。目前在中国上市的疫苗主要包括A、C、W、Y群单价和多价多糖脑膜炎球菌疫苗(MPV),A、C群多糖脑膜炎球菌结合疫苗(MPCV-... 详细信息

接种疫苗是预防流行性脑脊髓膜炎(流脑)最有效、最经济的方法,在过去几十年,随着疫苗的广泛使用,流脑发病率显著下降。目前在中国上市的疫苗主要包括A、C、W、Y群单价和多价多糖脑膜炎球菌疫苗(MPV),A、C群多糖脑膜炎球菌结合疫苗(MPCV-AC)以及A、C群脑膜炎球菌多糖结合b型流感嗜血杆菌结合联合疫苗(MPCV-AC-hib)。纵观我国脑膜炎球菌疫苗近50年的发展历程,在疫苗生产、质量控制以及相关研究方面均取得了显著成绩,但仍然面临着流脑疾病负担被低估、脑膜炎球菌疫苗免疫策略尚未完善、不同厂家脑膜炎球菌疫苗免疫程序不统一、无B群脑膜炎球菌疫苗上市等问题和挑战,为此应不断提高流脑监测手段及系统开展流脑疾病负担评价的研究以助力我国脑膜炎球菌疫苗免疫策略和免疫程序的完善,并针对流脑血清群高度可变和易发生抗原漂移的特性通过基因重组等技术研发出免疫力更长、保护效果更好的可预防所有血清群流脑的通用性疫苗。

关键词：流行性脑脊髓膜炎(流脑) 脑膜炎球菌疫苗发展挑战中国

rAAV5基因组滴度测定的数字PCR方法研究

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药物分析杂志 2023年第11期43卷 1826-1832页

作者：郑红梅秦玺李永红于雷毕华饶春明朱留强杨靖清史新昌周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理r AAV5样品,用微滴数字PCR... 详细信息

目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理r AAV5样品,用微滴数字PCR测其基因组滴度,对病毒样品前处理试剂进行优化;在其他试验条件不变的情况下,分别设置微滴数字PCR的退火温度为60、58、54、52℃,以WPRE引物扩增,比较扩增效果,对数字PCR的退火温度进行优化;分别采用微滴数字PCR和芯片数字PCR测定rAAV5的基因组滴度并比较。结果:终浓度为1%SDS和62.5 mmol·L^(-1)EDTA按1∶1(v/v)的比例混合后前处理rAAV5,测定的基因组拷贝数较高,前处理液裂解效果较好;当退火温度为54℃时,微滴数字PCR中阳性微滴和阴性微滴分离效果最好,扩增特异性最强;2种测定结果的试验室内精密度和回收率接近,测定同一裂解样本的结果较为接近(在1个数量级)。结论:初步建立了数字PCR方法并验证,为后续的进一步验证奠定基础。

关键词：重组5型腺相关病毒基因组滴度微滴数字PCR 芯片数字PCR 基因治疗

双重数字PCR法评价Luc2P系列报告基因细胞系的稳定性

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中国生物制品学杂志 2023年第7期36卷 826-832,838页

作者：于雷王光裕裴德宁安怡方史新昌周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性。方法提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP3... 详细信息

目的建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性。方法提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性。结果未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10%,Luc和RPP30的线性拟合R~2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50%~100%之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致。该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致。结论建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价。

关键词：报告基因细胞系萤光素酶稳定性双重数字PCR

重组5型腺相关病毒基因组滴度测定用国家标准品的研制

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中国生物制品学杂志 2023年第4期36卷 429-433页

作者：郑红梅于雷李永红史新昌安怡方郭莹韩春梅饶春明周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、... 详细信息

目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、感染滴度等检定,根据结果稀释、分装,制备成候选标准品;采用热加速试验对候选标准品进行稳定性考察;组织3家实验室,采用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法对候选标准品进行协作标定。结果候选标准品原液及候选标准品的各项检测指标均符合相关要求;在25、4、-20、-40、-80℃条件下,1、3、4、6个月基因组滴度均无明显下降;经3家实验室协作标定,候选标准品赋值为2.56×10^(12)copies/mL,95%置信区间为2.48×1012~2.64×10^(12)copies/mL。结论研制的rAAV5基因组滴度测定用国家标准品具有良好的稳定性,可用于rAAV5相关产品的质量评价。

关键词：重组5型腺相关病毒微滴式数字PCR 基因组滴度协作标定国家标准品

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致病性钩端螺旋体的多位点序列分型研究

中国人兽共患病学报 2022年第2期38卷 95-101页

作者：李喆张影杜宗利辛晓芳叶强徐颖华中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

目的通过对致病性钩端螺旋体(简称钩体)多位点序列分型(MLST)分析,了解国内与全球致病性钩体种群结构及其分子进化。方法应用16S rRNA基因测序和MLST分析方法对不同来源、不同时期国内钩体分离菌株与国际参考菌株进行分析,并与国内7株... 详细信息

目的通过对致病性钩端螺旋体(简称钩体)多位点序列分型(MLST)分析,了解国内与全球致病性钩体种群结构及其分子进化。方法应用16S rRNA基因测序和MLST分析方法对不同来源、不同时期国内钩体分离菌株与国际参考菌株进行分析,并与国内7株疫苗株结果平行比较,同时收集已公开的来自不同国家和不同时期1238株致病性钩体的基因种与MLST数据进行种群结构分析。结果16S rRNA基因测序分析结果显示7株钩体国际参考菌株和47株国内菌株基因种主要为问号基因种,分别占比71.4%和59.6%。7株国际参考菌株呈现7种不同ST型。而在47株中国钩体分离株中,发现15种ST型及24种尚未报道的新ST型。MLST聚类分析发现问号、波氏和卫氏基因种菌株均各自形成单独分支。7株不同ST的疫苗株也位于问号基因种内不同亚分支中。系统发育进化树表明世界范围内近百年分离的1238株钩体菌株主要包括16个进化簇,分别为ST17、ST34、ST149、ST1和ST37等,而中国236株钩体菌株可分为4个主要进化簇,主要流行基因型为ST1、ST128、ST17和ST143;不同国家流行菌株的基因种和ST型不尽相同。致病性钩体可在不同宿主物种广泛地交叉感染,不同国家间相互传播。结论获得我国致病性钩体基因种和MLST基因多态性资料,并系统地了解国内和全球致病性钩体种群结构和遗传进化关系,为后续致病性钩体监测和溯源提供科学指导。

关键词：致病性钩体多位点序列分型 16S rRNA基因测序进化簇系统发育

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我国钩端螺旋体分子分型研究进展

疾病监测 2022年第4期37卷 512-516页

作者：李喆徐颖华辛晓芳中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展,钩端螺旋体(钩体)分子流行病学的研究也愈发深入。新的分子分型技术以及大量钩体基因组的测序,使得研究者们对钩体可以有一个全新的认识。本研究以近年来国内外各种钩体分子分型方法为分类... 详细信息

随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展,钩端螺旋体(钩体)分子流行病学的研究也愈发深入。新的分子分型技术以及大量钩体基因组的测序,使得研究者们对钩体可以有一个全新的认识。本研究以近年来国内外各种钩体分子分型方法为分类,总结并归纳了16S rRNA基因分型、脉冲场凝胶电泳分析、多位点序列分型、多位点可变数目串联重复序列分型和全基因组测序分析方法,有助于新的菌株型别的发现,揭示不同菌株间的宿主传播关系,地域传播关系,可为今后钩体分子分型方法的应用和钩体病的预防控制提供借鉴。

关键词：钩端螺旋体流行病学分子分型疾病防控

1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清国家参考品的制备

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中国生物制品学杂志 2022年第2期35卷 179-183页

作者：陈琼王珊珊石继春王春娥李红李茂光叶强中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的制备1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清国家参考品,用于速率比浊法检测疫苗中的多糖含量。方法采用双光径速率浊度免疫分析系统(IMMAGE 800)非竞争性浊度模式进行检测,多糖体积21μL,血清体... 详细信息

目的制备1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清国家参考品,用于速率比浊法检测疫苗中的多糖含量。方法采用双光径速率浊度免疫分析系统(IMMAGE 800)非竞争性浊度模式进行检测,多糖体积21μL,血清体积21μL,反应缓冲液体积300μL,增益系数为4,反应时间为3.5 min。确定1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型兔源肺炎球菌特异性血清候选参考品的工作浓度、线性范围、检测限、定量限,并验证专属性和稳定性。采用本实验制备的血清国家参考品及市售血清同时检测2个厂家的23价肺炎球菌多糖疫苗的多糖含量。结果确定各型血清候选参考品的工作浓度在原倍至4倍稀释度之间,在相应工作浓度下,多糖浓度在1~6μg/mL范围时,与响应值呈良好的线性关系,相关系数(R2)均>0.980;检测限和定量限均低于多糖候选参考品最低点(1μg/mL)的反应值;各型血清候选参考品特异性良好,无交叉反应;血清候选参考品于2~8℃保存28 d后仍具有良好的稳定性。除厂家2疫苗的6B和9V型外,2种血清对厂家2疫苗其他型别及厂家1疫苗所有型别多糖含量检测结果的相对标准偏差(RSD)<15%。结论成功制备了12种兔源肺炎球菌特异性血清国家参考品,可用于速率比浊法检测23价肺炎球菌多糖疫苗的多糖抗原含量。

关键词：肺炎球菌特异性血清国家参考品速率比浊法