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豚鼠生长激素受体及其突变体在哺乳动物细胞中的功能性表达(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第5期35卷 403-408页

作者：廖志勇张信娜景乃禾朱尚权中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

采用RT PCR克隆得到豚鼠生长激素受体cDNA。序列同源比较显示生长激素受体的一些功能性保守氨基酸在豚鼠生长激素受体中被其他氨基酸所取代。例如 ,哺乳动物生长激素受体中保守的第 170位组氨酸和第 333位酪氨酸分别是受体二聚化和生长... 详细信息

采用RT PCR克隆得到豚鼠生长激素受体cDNA。序列同源比较显示生长激素受体的一些功能性保守氨基酸在豚鼠生长激素受体中被其他氨基酸所取代。例如 ,哺乳动物生长激素受体中保守的第 170位组氨酸和第 333位酪氨酸分别是受体二聚化和生长激素刺激蛋白质合成及脂生成所必需的 ,但在豚鼠生长激素受体中分别被酪氨酸和丝氨酸所取代。为此 ,采用定点突变法得到了突变体gpGHRY16 8H和 gpGHRS332Y ,并构建了表达质粒 pcDNA3 gpGHR ,pcDNA3 gpGHRY16 8H和pcDNA3 gpGHRS332Y。借助COS 7和CHO细胞 ,研究了豚鼠生长激素受体及其突变体的生物活性。实验表明转染了pcDNA3 gpGHR的COS 7细胞对牛生长激素具有高亲和性 [Ka=1.3× 10 9(mol/L) -1],并且用鼠抗生长激素受体单克隆抗体mAb2 6 3可检测到一分子量约 92kD的蛋白质。在CHO细胞中 ,虽然两个氨基酸的定点突变不影响受体与配体的结合 ,但都提高了生长激素刺激的蛋白质合成而降低生长激素刺激的脂肪生成。蛋白质印迹实验揭示突变体 gpGHRY16 8和gpGHRS332Y分别降低和提高了生长激素诱导的JAK2酪氨酸磷酸化。因此 ,报道了豚鼠生长激素受体在生长激素代谢功能中的调节作用以及受体中保守氨基酸的取代导致配体结合后信号转导的变化。

关键词：豚鼠生长激素受体突变脂肪生成蛋白质合成

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从酵母表达时间序列估计基因调控网络

生物化学与生物物理学报 2003年第8期35卷 707-716页

作者：徐肖江王连水丁达夫中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

基因调控网络是生命功能在基因表达层面上的展现。用组合线性调控模型、调控元件识别和基因聚类等方法 ,从基因组表达谱解读酵母在细胞周期与环境胁迫中的基因调控网络。结果表明 ,细胞在不同环境条件下会调整基因调控网络。在适应的环... 详细信息

基因调控网络是生命功能在基因表达层面上的展现。用组合线性调控模型、调控元件识别和基因聚类等方法 ,从基因组表达谱解读酵母在细胞周期与环境胁迫中的基因调控网络。结果表明 ,细胞在不同环境条件下会调整基因调控网络。在适应的环境下 ,起主要作用的是细胞生长和增殖有关的基因调控网络 ;而在响应环境胁迫时 ,细胞会再规划调控网络 ,抑制细胞生长和增殖相关的基因 ,诱导跟适应性糖类代谢与结构修复相关的基因 ,还可能启动减数分裂产生孢子。分别从细胞周期和环境胁迫响应相关基因中 ,搜索到转录因子Mcm1结合位点TT CC T GGAAA ,和Dal82在尿囊素代谢途径相关基因上的结合位点TGAAAAWTTT。从而 ,从酵母表达时间序列估计基因调控网络是可行的 ,与至今已知的实验观察相当吻合

关键词：基因调控网络基因组表达时间序列细胞周期环境胁迫

水稻齿叶矮缩病毒S8基因编码的结构蛋白质及其自聚集性质

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生物化学与生物物理学报 2002年第5期34卷 565-570页

作者：吕慧涓邵朝纲龚祖埙中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、蛋白质组学重点实验室上海200031

水稻齿叶矮缩病毒是一种以水稻为侵害寄主的植物呼肠孤病毒 ,其基因组 1 0条dsRNA编码的蛋白质产物的功能除S9外的大部分还未阐明。报道了该病毒菲律宾分离株S8的开放阅读框序列 ,在大肠杆菌中表达和纯化出了其 6 7kD的蛋白质产物 ,并... 详细信息

水稻齿叶矮缩病毒是一种以水稻为侵害寄主的植物呼肠孤病毒 ,其基因组 1 0条dsRNA编码的蛋白质产物的功能除S9外的大部分还未阐明。报道了该病毒菲律宾分离株S8的开放阅读框序列 ,在大肠杆菌中表达和纯化出了其 6 7kD的蛋白质产物 ,并进一步研究了该产物的功能。实验结果表明 ,S8的蛋白质产物是病毒的一种主要结构蛋白质 ,在体外具有自剪切活性和自聚集性质 ,并推测可能是病毒的内层衣壳蛋白

关键词： RRSV P8 结构蛋白质自剪切自聚集

丝瓜籽中一种具有翻译抑制活性和胰蛋白酶抑制剂活性的多肽——Luffin P1的纯化和性质

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第9期35卷 847-852页

作者：李丰夏恒传杨欣秀胡维国李臻张祖传中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室

通过硫酸铵分级沉淀、CM 5 2阳离子交换层析、蓝胶亲和层析和FPLCMonoS阳离子交换层析 ,从丝瓜籽抽提液中分离到一种多肽luffinP1。经MALDI TOFMS测得其分子量为 5 2 2 6 .5。氨基酸序列测定及同源性分析发现 ,luffinP1的N端 11个氨基... 详细信息

通过硫酸铵分级沉淀、CM 5 2阳离子交换层析、蓝胶亲和层析和FPLCMonoS阳离子交换层析 ,从丝瓜籽抽提液中分离到一种多肽luffinP1。经MALDI TOFMS测得其分子量为 5 2 2 6 .5。氨基酸序列测定及同源性分析发现 ,luffinP1的N端 11个氨基酸序列与丝瓜籽中的一种 6 .5K富含Arg Glu的多肽AGRP的部分序列相同 ,并与南瓜籽中一种胰蛋白酶抑制剂C2肽具有很高的同源性。体外分析表明 ,luffinP1同时具有两种生物活性 :(1)对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用 ,IC50 为 0 .6nmol L ;(2 )具有明显的胰蛋白酶抑制活性 ,IC50 为 2 2 μmol L。

关键词：丝瓜籽 Luffin P1 翻译抑制活性胰蛋白酶抑制活性

栝楼籽中一种新的具有蛋白质生物合成抑制活性的多肽——TrichokirinS1的分离、纯化和性质

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第9期35卷 841-846页

作者：李丰杨欣秀胡维国夏恒传李臻张祖传中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

改进了常规的核糖体失活蛋白的分离纯化方案 ,首先采用抽提蛋白体的方法 ,提高了分离效果 ,然后再经硫酸铵分级沉淀、FPLCMonoS阳离子交换层析和Superose12凝胶过滤层析等步骤 ,从栝楼种子中分离到一种新的多肽———trichokirin S1。经... 详细信息

改进了常规的核糖体失活蛋白的分离纯化方案 ,首先采用抽提蛋白体的方法 ,提高了分离效果 ,然后再经硫酸铵分级沉淀、FPLCMonoS阳离子交换层析和Superose12凝胶过滤层析等步骤 ,从栝楼种子中分离到一种新的多肽———trichokirin S1。经MALDI TOFMS质谱分析测得其分子量为 114 2 6。该肽的N端氨基酸序列为PRRKEG GSFDECCSE ,与一种存在于南瓜籽中的小分子核糖体失活蛋白 β moschin具有很高的同源性。trichokirin S1对核糖体失活的机制与天花粉蛋白 (TCS)一致 ,是rRNAN 糖苷酶催化型的 ,对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用 ,IC50 为 0 .71nmol L ,因而有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。

关键词： trichokirin-S1 翻译抑制活性 rRNA N-糖苷酶

一种提高固定pH梯度(IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法(英文)

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生物化学与生物物理学报 2003年第7期35卷 611-618页

作者：袁泉安杰刘定干赵辅昆中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Mult... 详细信息

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Multi stripsononeSDSgel,MSOG)电泳。用此方法比较了人肝癌细胞、不同生长状态的人肝癌细胞、3T3细胞的蛋白质以及同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统 (大型和中型凝胶 )的双向电泳图谱。结果表明 ,同一样品在 13cmIPGStrip双向电泳可分离 2 0 0 0以上蛋白质点且图谱蛋白质点的匹配率可超过 95 %以上。同时又可以最大程度地降低凝胶背景对蛋白质点比较分析的干扰 ,从而提高了双向电泳分离蛋白质的分辨率和通量。这些优点都有助于差异蛋白质组学特别是细胞器差异蛋白质组学研究的自动化。

关键词：双向电泳同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶的方法重复性高通量蛋白质组学

福寿螺 (Ampullaria crossean)内源性多功能纤维素酶基因的克隆(英文)

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生物化学与生物物理学报 2003年第10期35卷 941-946页

作者：王骥丁明李燕红陈清西许根俊赵辅昆中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室上海200031

迄今为止已克隆的动物纤维素酶基因都是编码内切 β 1,4 葡聚糖酶或β 葡萄糖苷酶的 ,还没有有关动物外切 β 1,4 葡聚糖酶基因的报道。并且 ,动物是否对植物细胞壁的另一主要成分木聚糖具有水解能力也依然是个疑问。已经由草食性软体... 详细信息

迄今为止已克隆的动物纤维素酶基因都是编码内切 β 1,4 葡聚糖酶或β 葡萄糖苷酶的 ,还没有有关动物外切 β 1,4 葡聚糖酶基因的报道。并且 ,动物是否对植物细胞壁的另一主要成分木聚糖具有水解能力也依然是个疑问。已经由草食性软体动物福寿螺的胃液中纯化得到一种纤维素酶 ,该酶同时具有外切 β 1,4 葡聚糖酶、内切 β 1,4 葡聚糖酶和内切 β 1,4 木聚糖酶等三种活性 ,是一种多功能纤维素酶 (命名为EGX)。在此基础上 ,从福寿螺胃组织中克隆得到的EGXcDNA开放阅读框全长为 1185bp ,共编码 395个氨基酸。由氨基酸顺序同源和活性部位的保守顺序的比较分析 ,EGX可归属于糖苷水解酶第10家族。该多功能纤维素酶cDNA在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中表达的产物具有水解外切 β 1,4 葡聚糖酶底物 (pNPC) ,羧甲基纤维素 (内切 β 1,4 葡聚糖酶的底物 )和木聚糖 (木聚糖酶的底物 )的活力。另外也从福寿螺卵巢组织中获得编码福寿螺多功能纤维素酶EGX基因 ,长度为 4 892bp ,含有 9个外显子和 8个内含子。8个内含子分别位于开放阅读框的 74bp、12 2bp、2 80bp、336bp、4 73bp、6 4 6bp、75 3bp和 972bp处。以上结果证明了多功能纤维素酶EGX是福寿螺自身产生的 ,同时也证明了福寿螺具有与微生物相似的纤维素?

关键词：多功能纤维素酶 EGX 基因克隆福寿螺(Ampullaria crossean)

超高分辨率毛细管等电聚焦- 电喷雾质谱联用方法观察蛋白质亚型(英文)

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生物化学与生物物理学报 2002年第4期34卷 423-432页

作者：刘韬邵晓霞曾嵘夏其昌中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组研究分析中心、蛋白质组重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组研?

在线的毛细管等电聚焦电喷雾质谱联用 ,作为一种二维的分离系统 ,对毛细管等电聚焦过程中形成的蛋白质亚型进行了分析。这种分析系统通过使用中性的涂层毛细管 (80cm长 )、动态的毛细管位置调整方法和鞘流液接口得以建立。蛋白质首先... 详细信息

在线的毛细管等电聚焦电喷雾质谱联用 ,作为一种二维的分离系统 ,对毛细管等电聚焦过程中形成的蛋白质亚型进行了分析。这种分析系统通过使用中性的涂层毛细管 (80cm长 )、动态的毛细管位置调整方法和鞘流液接口得以建立。蛋白质首先在毛细管等电聚焦过程中根据它们等电点的差异得到分离 ,然后被电喷雾质谱鉴定。已聚焦好的蛋白质区带通过结合阴极移动和重力移动的方法从毛细管中流出而进入质谱仪。由于在此特定情况下这种方法具有极高的分辨率 ,有三种血红蛋白A和镰刀型血红蛋白的亚型 (具有几乎相同的电荷分布和分子质量 ,但它们的等电点差异在 0 .0 4到 0 .0 8之间 )和两种乳球蛋白A的亚型 (等电点差异为 0 .6 )被检测到。这些蛋白质亚型的等电点、相对含量和分子质量都通过毛细管等电聚焦电喷雾质谱联用方法同时得到了确定。

关键词：毛细管等电聚焦电喷雾质谱蛋白质亚型血红蛋白变种

慈菇蛋白酶抑制剂A和B的活性中心探讨(英文)

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生物化学与生物物理学报 2002年第5期34卷 662-666页

作者：李炯阮康成戚正武中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学实验室上海200031

慈菇蛋白酶抑制剂A和B(APIA和APIB)是一种双头多功能抑制剂 ,它们的一级结构和cDNA序列已经被阐明。为了找到它们的活性中心 ,利用定点诱变的方法将APIB中根据与其他抑制剂家族的序列比较所推断的可能的活性中心残基 :Lys44、Arg76和Ar... 详细信息

慈菇蛋白酶抑制剂A和B(APIA和APIB)是一种双头多功能抑制剂 ,它们的一级结构和cDNA序列已经被阐明。为了找到它们的活性中心 ,利用定点诱变的方法将APIB中根据与其他抑制剂家族的序列比较所推断的可能的活性中心残基 :Lys44、Arg76和Arg87分别用Pro替代 ,所得到的突变基因分别在酵母分泌体系中得到了表达。与天然的APIB相比 ,K44P APIB对胰蛋白酶的抑制活力没有改变 ;而R76P APIB和R87P APIB对胰蛋白酶的抑制活力都分别下降了一半 ,由原来的抑制两分子变成了一分子。表明Arg76和Arg87分别是APIB的两个活性中心残基 ,而Lys44则不是。为了证实以上结论 ,进一步制备了另外 3种突变体 (K44P R76P APIB、K44P R87P APIB、R76P R87P APIB) ,在每个突变体中 ,3个可能的活性位点中只保留 1个。有关的抑制活力测定表明 ,K44P R76P APIB(只保留Arg87)和K44P R87P APIB(只保留Arg76)分别只抑制一分子胰蛋白酶 ,而R76P R87P APIB(只保留Lys44)对胰蛋白酶基本不抑制 ,从而肯定了以上结论。经过测定 ,两个突变体K44P R87P APIB和K44P R76P APIB对胰蛋白酶的抑制常数Ki 分别是 0 .39nmol/L和 0 .4 7nmol/L。突变体R87L APIB(APIA中 87位是Leu)丧失了接近一半的胰蛋白酶抑制活力 ,但同时对胰凝乳蛋白酶的抑制活性由原来?

关键词：慈菇蛋白酶抑制剂定点诱变抑制活性活性中心