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共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

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中国生物工程杂志 2007年第8期27卷 25-28页

作者：刘慧娟金宁一马鸣潇金明兰沈国顺霍晓伟鲁会军金扩世李旭计越中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

目的:对筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法:分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行... 详细信息

目的:对筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法:分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行免疫接种,并检测各免疫组的T淋巴细胞亚类数量、CTL杀伤活性及抗体效价。结果:重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠T淋巴细胞亚类数量,CTL杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组,且重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的小鼠T淋巴细胞亚类数量和CTL特异性杀伤活性与rFPV-P1-2A-3C相比,差异显著。结论:为开发新型FMDV疫苗奠定了实验免疫基础。

关键词：口蹄疫病毒重组鸡痘病毒免疫原性

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血清外泌体的提取方法与鉴定

药物分析杂志 2022年第8期42卷 1400-1406页

作者：李雪洁付洁冀元凯宋海峰安徽医科大学基础医学院合肥230000 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所蛋白质药物国家工程研究中心北京102206

目的:建立阴选纯化富集(NSPE)法,从血清中高效、快速提取外泌体,并对外泌体进行鉴定。方法:利用低密度脂蛋白受体与低密度脂蛋白(LDL)结合的原理,去除人血清中大量LDL干扰,再通过外泌体表面磷脂分子的磷酸盐基团与二氧化锆(ZrO_(2))双... 详细信息

目的:建立阴选纯化富集(NSPE)法,从血清中高效、快速提取外泌体,并对外泌体进行鉴定。方法:利用低密度脂蛋白受体与低密度脂蛋白(LDL)结合的原理,去除人血清中大量LDL干扰,再通过外泌体表面磷脂分子的磷酸盐基团与二氧化锆(ZrO_(2))双配位结合的原理富集外泌体。使用纳米流式细胞仪、透射电子显微镜来检测外泌体的粒径分布、颗粒浓度和形态特征,蛋白免疫印迹法检测外泌体表面标志性蛋白。使用基因本体论数据库和京都基因与基因组百科全书数据库对外泌体内部的microRNAs(miRNAs)进行基因通路分析。结果:该方法可在60 min从血清中有效提取外泌体。外泌体颗粒浓度为(2.94±0.3)×10^(10)颗粒·mL^(-1),粒径大小为(88.07±2.94)nm,并呈现标志性蛋白TSG101~+、CD9~+。外泌体内部miRNAs与免疫、代谢过程等相关。结论:建立的NSPE法可从血清中高效、快速地提取外泌体,用于健康监测和医学检验。

关键词：外泌体医学检验 ZrO_(2) miRNAs 阴选纯化富集法

蚓激酶乳腺组织特异性表达载体构建及在山羊奶中的表达

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高技术通讯 2005年第1期15卷 66-69页

作者：梁慧颖张守峰扈荣良王永志涂长春王莘中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

以合成的蚓激酶cDNA突变体为目的基因,构建了其乳腺组织特异性表达载体pIbCP-LK-neo和含有两个目的基因拷贝的表达载体pIbCP-LK-LK.以山羊乳腺作为生物反应器,在稳定泌乳期于乳腺组织分别注射以上两种表达质粒,采集乳汁,通过纤维蛋白平... 详细信息

以合成的蚓激酶cDNA突变体为目的基因,构建了其乳腺组织特异性表达载体pIbCP-LK-neo和含有两个目的基因拷贝的表达载体pIbCP-LK-LK.以山羊乳腺作为生物反应器,在稳定泌乳期于乳腺组织分别注射以上两种表达质粒,采集乳汁,通过纤维蛋白平板溶圈试验进行纤溶活性测定.结果显示,注射了蚓激酶表达质粒的山羊奶具有明显的纤溶活性;pIbCP-LK-LK蚓激酶在奶中的表达量高于pIbCP-LK-neo.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析表明,表达的蚓激酶分子量为26kDa.本试验系首次实现了蚓激酶的基因工程表达,为通过转基因途径生产蚓激酶奠定了基础.

关键词：蚓激酶乳腺组织特异性表达 CP 纤溶活性注射山羊奶目的基因酶分子量载体构建

去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用

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中国组织工程研究 2022年第7期26卷 1012-1019页

作者：周颖张幻廖松胡凡琦易静刘玉斌靳继德中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京市100850 广西医科大学附属肿瘤医院乳腺及骨、软组织肿瘤内科广西壮族自治区南宁市530021 中国人民解放军总医院北京市100853

背景:免疫排斥是组织和器官移植面临的巨大挑战,免疫抑制剂的使用常给患者带来严重的不良反应,间充质干细胞的免疫抑制作用为免疫排斥的治疗带来新的希望。目的:探讨去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞免疫调节能力的影响。方法:用去铁胺... 详细信息

背景:免疫排斥是组织和器官移植面临的巨大挑战,免疫抑制剂的使用常给患者带来严重的不良反应,间充质干细胞的免疫抑制作用为免疫排斥的治疗带来新的希望。目的:探讨去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞免疫调节能力的影响。方法:用去铁胺、干扰素γ以及二者联合预处理人牙髓干细胞,CCK-8检测细胞增殖能力,Q-PCR检测相关基因mRNA的表达,ELISA检测培养上清中炎性因子水平;预处理后的人牙髓干细胞与CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞共培养,流式细胞术检测脾淋巴细胞的增殖能力。建立小鼠异体皮肤移植模型,经尾静脉注射PBS或不同预处理的人牙髓干细胞,记录移植皮肤存活时间,进行组织病理学和免疫组化分析,检测移植小鼠脾脏Treg细胞比例。结果与结论:①去铁胺和干扰素γ预处理均抑制了人牙髓干细胞的生长,去铁胺生长抑制作用更为明显;②去铁胺联合干扰素γ预处理明显提高了血管内皮生长因子、白细胞介素6、转化生长因子β1、环氧合酶2、人类白细胞抗原G、肿瘤坏死因子Α诱导蛋白6和白细胞介素10基因表达,促进了白细胞介素6、转化生长因子β1和前列腺素E2的分泌;③体内实验结果证实,去铁胺联合干扰素γ预处理的人牙髓干细胞可以延长小鼠异体移植皮肤存活时间,减轻了移植皮片处CD4^(+)T、CD8^(+)T以及巨噬细胞的浸润,促进了受体小鼠脾脏中Treg细胞增加;④研究结果表明,经去铁胺联合干扰素γ预处理后,人牙髓干细胞的免疫调节作用明显增强,减轻了皮肤移植免疫排斥反应。

关键词：干细胞人牙髓干细胞去铁胺干扰素γ 皮肤移植免疫调节免疫排斥

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

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中国兽医学报 2006年第1期26卷 42-44页

作者：韩松金宁一鲁会军郑敏尹革芬葛淑敏金扩世解放军军事医学科学院军事兽医研究所解放军基因工程重点实验室吉林长春130062

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段,将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBac分别用BamH及Hind酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-VP1;再将该重组质粒转... 详细信息

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段,将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBac分别用BamH及Hind酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-VP1;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在菌体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1;将Bacmid-VP1转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因杆状病毒表达

犬冠状病毒S糖蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究

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微生物学报 2005年第4期45卷 588-592页

作者：乔军夏咸柱杨松涛胡桂学谢之景闫芳高玉伟黄耕中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所长春130062塔里木大学动物科技学院阿拉尔843300 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所长春130062 吉林农业大学动物科技学院长春130118

首次构建了能表达犬冠状病毒纤突糖蛋白(CCVS1)的重组犬2型腺病毒(CAV-2)。用RT-PCR方法从CCVDXMV株细胞培养物中扩增出编码S糖蛋白A、B、C和D4个抗原位点的基因片段S1,将其克隆到pVAX1中,然后将含有CCVS1基因的完整表达盒(CMV-S1-PolyA... 详细信息

首次构建了能表达犬冠状病毒纤突糖蛋白(CCVS1)的重组犬2型腺病毒(CAV-2)。用RT-PCR方法从CCVDXMV株细胞培养物中扩增出编码S糖蛋白A、B、C和D4个抗原位点的基因片段S1,将其克隆到pVAX1中,然后将含有CCVS1基因的完整表达盒(CMV-S1-PolyA)进一步定向克隆到含有CAV-2E3区的穿梭质粒pVAXE3中,构建出pVAX△E3S1。通过SalⅠ+NruⅠ双酶切pVAX△E3S1回收含有目的基因的表达盒,将其克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,获得重组质粒pCAV-2-CCV-S1。ClaⅠ+AscⅠ酶切pCAV-2-CCV-S1释放重组基因组,转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-S1。该重组病毒在MDCK细胞上能产生典型的腺病毒细胞病变。通过mRNA水平和Westernblot检测,证实重组病毒能表达CCVS1蛋白。动物免疫试验表明,该重组病毒可以有效地诱导免疫犬产生抗CCV和CAV-2抗体。

关键词：犬冠状病毒,纤突糖蛋白,重组犬2型腺病毒

用荧光抗体技术和肠细胞粘附试验检测K88^+***对仔猪小肠上皮的粘附作用

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畜牧兽医学报 1989年第S1期20卷 108-109页

作者：徐香黄翠芬中国人民解放军军事医学科学院

细菌粘附到宿主粘膜表面是细菌致病的前提,在引起人、畜腹泻的大肠杆菌中已经发现了许多具有粘附作用的蛋白质抗原,例如 K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/Ⅱ等抗原。这些抗原也叫菌毛或粘附素,它们位于菌体表面,能特异粘附到宿主小肠... 详细信息

细菌粘附到宿主粘膜表面是细菌致病的前提,在引起人、畜腹泻的大肠杆菌中已经发现了许多具有粘附作用的蛋白质抗原,例如 K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/Ⅱ等抗原。这些抗原也叫菌毛或粘附素,它们位于菌体表面,能特异粘附到宿主小肠上皮细胞上,使细菌克服肠道蠕动的排斥在小肠内定居、繁殖。目前已经用遗传工程技术克隆3菌毛基因,用菌毛蛋白制成的疫苗,预防大肠杆菌腹泻,效果很好。在我国,新生仔猪大肠杆菌腹泻的发病率很高,仔猪腹泻大肠杆菌多数具有K88抗原,本实验建立了荧光抗体染色和肠细胞粘附二种方法,检测了K88+***的粘附能力和菌毛的生物活性。

关键词：粘附作用 E.coli K88 细胞粘附小肠上皮蛋白质抗原菌毛仔猪大肠杆菌荧光抗体染色粘附能力

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建

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免疫学杂志 2007年第5期23卷 524-527页

作者：陈义锋金宁一贾雷立鲁会军南文龙田明尧陈晓月马海利马鸣潇刘成宏吉林大学畜牧兽医学院长春130062 中国人民解放军军事医学科学院11所全军基因工程重点实验室长春130062 军事医学科学院疾病预防所北京100071

目的构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株。方法筛选流感病毒主要抗原(HANANPM)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7HA融合表达基因为骨架,将多... 详细信息

目的构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株。方法筛选流感病毒主要抗原(HANANPM)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7HA融合表达基因为骨架,将多表位基因插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至鸡痘病毒表达载体pUTA-2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA。应用脂质体介导的转染法,将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压筛选挑斑纯化后传代,并对重组以鸡痘病毒进行PCR和IFA检测和Western blot分析。结果成功构建了重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA,PCR、IFA和Western blot检测阳性。结论筛选出稳定共表达H5H7HA基因和通用多表位基因的重组鸡痘病毒vUTA2-H7HA-Epi-H5HA株,该重组鸡痘病毒的构建为跨种通用型流感病毒活载体疫苗的研究奠定了物质基础。

关键词：重组鸡痘病毒多表位基因(Epi) 构建

鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析

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病毒学报 1997年第4期13卷 351-356页

作者：曾力宇金奇章金钢李茂祥姚二梅殷震侯云德中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室中国人民解放军农牧大学军事兽医研究所

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ－２，经常规方法提取其病毒核酸后，组建了完整的限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库，并对其中ＨｉｎｄⅢ（２１．０ｍ．ｕ．）－ＳａｃⅠ（３３．２ｕ．）进行了... 详细信息

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ－２，经常规方法提取其病毒核酸后，组建了完整的限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库，并对其中ＨｉｎｄⅢ（２１．０ｍ．ｕ．）－ＳａｃⅠ（３３．２ｕ．）进行了序列测定。同源比较分析证明：其Ｌ链含编码病毒末端前体蛋白，容量为５８０个氨基酸残基（ａａ）的开放读码框架（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）。由此推导的多肽氨基酸序列及结构特点，如保守序列、核定位信号（Ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）。等与其他腺病毒的相应多肽存在较大差异。本文为阐明腺病毒末端前体蛋白参与ＤＮＡ复制起始的机制提供了新的依据。

关键词：鸡减蛋综合征病毒末端前体蛋白基因结构